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1、猪病诊断技术规范一、致病性大肠杆菌的检测1 引用标准参考NY/T 555-2002（动物产品大肠杆菌、粪大肠菌群和大肠杆菌的检测方法）。2 范围适用于猪大肠杆菌病的诊断。3 检测方法3.1 材料 营养肉汤 营养琼脂 EMB TSI IMViC生化鉴定管 小白鼠3.2 分离培养a) 将采集的肝、脾、心血或肠内容物等分别接种伊红美兰琼脂平板（同时接种营养肉汤增菌备用），置37 培养1824 h。b) 观察培养特性，挑取黑色有金属光泽的菌落，用该菌落涂片，革兰氏染色，镜检。c) 如可见到两端钝圆并多以单个存在的革兰氏阴性粗短杆菌，应取510个典型菌落再接种于TSI琼脂。d) 同时挑取典型菌落接种营养
2、琼脂，37 培养1618 h的菌液用于生化特性鉴定。3.3 生化鉴定挑取上述菌落纯培养物接种以下生化培养基和乳糖发酵管，(361) 培养24 h后观察结果。 靛基质试验：a) 滴加Kovacs氏靛基质试剂0.1 mL于靛基质试验培养基中混合，观察结果。b) 出现红色环的为反应阳性；出现黄色环的为反应阴性。 甲基红（MR）试验a) 滴加甲基红指示剂0.2 mL于MR-VP培养基中混合，观察结果。b) 出现红色为阳性反应；出现黄色为阴性反应。3.3.3 VP试验a) 滴加VP试剂甲液0.2 mL于MR-VP培养基中混匀，再滴加VP试剂乙液0.1 mL混匀，静置，观察结果。b) 在15 min内出现
3、红色的为阳性反应；无颜色变化的为阴性反应。阴性结果1 h后再观察一次，出现红色也为阳性反应。 枸橼酸盐试验：观察培养基颜色变化，出现蓝色为阳性反应；不变色为阴性反应。3.4 大肠杆菌鉴定结果应符合表1要求。表1 大肠杆菌鉴定结果靛基质MRVP枸橼酸盐鉴定+-典型大肠埃希氏杆菌-+-非典型大肠埃希氏杆菌+-+典型柠檬酸盐杆菌-+-+非典型柠檬酸盐杆菌-+典型产气杆菌+-+非典型产气杆菌出现表1的生化反应类型时，如果为组织样品，由此可初步报告为致病性大肠杆菌。如果为粪便，尿液，饲料，饮水，应进一步做致病性试验。3.4 致病性试验a) 取经营养肉汤37 培养1618 h后的纯化菌株培养液，分别腹腔接
4、种体重20g左右的小白鼠，每株接种23只，每只0.3 mL（含菌量约为11012 cfumL），同时用相同数量的小白鼠接种无菌肉汤作对照。b) 饲养观察、记录死亡数，并从死亡鼠的心、肝中回收接种菌。在24小时内出现死亡的可报告为致病性大肠杆菌。4 药敏试验a) 挑选琼脂平板上典型菌落接种营养肉汤培养中，37 培养1618 h，菌液用于药敏试验。b) 将肉汤培养物（用标准比浊管比较达相同浊度）稀释至含菌量为1109 cfumL，摇匀后蘸取菌悬液均匀涂布于琼脂平板上，然后用无菌镊子将药敏片贴附其上，每纸片25张，置37 培养24 后观察。c) 根据抑菌圈大小来判定其对药物的耐受性，选择敏感药物。二
5、、沙门氏菌的检测1 引用标准 参考NY/T 550-2002（动物和动物产品沙门氏菌检测方法）。2 范围适用于猪沙门氏菌病的诊断。3 检测方法3.1 材料 SC DHL TSI 赖氨酸脱羧酶（LD） 邻-硝基酚-D-半乳糖苷（DNPG） 甘露醇糖发酵管3.2分离培养a) 采集疑似病例的肝、脾、心血或肠内容物样品。b) 无菌剪取肝、脾样品1 g，投入10 mL SC增菌液中（血液、粪便样品可以采适量直接投入10 mL增菌液），361 培养1824 h。c) 取一接种环增菌液划线接种于DHL琼脂平板上，361 培养1824 h。观察平板上菌落生长形态。沙门氏菌在DHL平板上呈无色半透明，产硫化氢（
6、H2S），菌落中心黑色或几乎全黑色。3.3 生化鉴定a) 挑取DHL平板上可疑菌落35个，每个菌落先洗入TSI培养基冷凝水中，继而在斜面上划线接种并高层穿刺接种。b) 再挑取同一菌落依次接种氨基酸脱羧酶发酵试验（LD）和ONPG，甘露醇糖发酵管三支生化管，若菌落偏小，二次挑取菌落有困难，可用接种环醮取TSI培养基中冷凝水接种其余生化管，361 培养1824 h（挑取菌落后的平板，应置于4 冰箱保留48 h以备复查）。c) 按表1记录反应结果，对照表2进行判定。d) 凡符合表2生化反应模式，可报告为沙门氏菌。表1 生化反应结果判定生化管TSILDONPGMAN底a斜面b硫化氢第一次颜色记录符合黄
7、+黄+黑+紫+深黄+黄+第二次颜色记录符号红-红-无黑色-黄-无色或淡黄-紫-a “底”观察葡萄糖反应。b “斜面”观察乳糖和蔗糖反应。表2 生化检测沙门氏菌属判定表序号TSILDONPGMAN判定底斜面硫化氢ABaCDbEcFdG+-+-+-+-+-+-+-+-+-沙门氏菌亚种、沙门氏菌亚种b、15a沙门氏菌亚种a、15b、15少数沙门氏菌亚种少数沙门氏菌亚种甲型副伤寒沙门氏菌非沙门氏菌a含1硫化氢阳性的大肠埃希氏菌，可加试靛基质加以鉴别，其中大肠杆菌阳性，沙门氏菌阴性。b赖氨酸阴性的沙门氏菌主要有：甲型副伤寒、伤寒、猪霍乱沙门氏菌孔成道夫变种、鸡等。c 硫化氢阴性的沙门氏菌主要有：甲型副伤
8、寒、伤寒、猪霍乱、猪伤寒、仙台、贝塔、巴布亚、鸡、马流产、山夫登堡、都柏林登。d可直接用（O）单因子血清证实，以排除雷极氏普罗菲登斯菌登。4 药敏试验a) 挑选DHL平板上典型菌落接种营养肉汤培养中，361 培养1618 h，菌液用于药敏试验。b) 将肉汤培养物（用标准比浊管比较达相同浊度）稀释至含菌量为1109 cfumL，摇匀后蘸取菌悬液均匀涂布于琼脂平板上，然后用无菌镊子将药敏片贴附其上，每纸片25张，置361 培养24 后观察。c) 根据抑菌圈大小来判定其对药物的耐受性，选择敏感药物。三、产气荚膜梭菌的检测1 引用标准 自定标准。2 范围适用于猪产气荚膜梭菌病的诊断。3 材料3.1 绵
9、羊血琼脂3.2 牛乳培养基。4 组织染色镜检对疑似病例的肠道黏膜涂片，魏氏梭菌呈G+，直杆状，两端钝圆，单在或成双，无鞭毛，不运动。芽孢大而卵圆，位于菌体中央或近端，多数菌株可形成荚膜。5 分离培养可将肠道内容物接种血平板，37 厌氧培养1824 h后观察。菌落特点：魏氏梭菌在血平板上可形成直径25 mm、圆形、边缘整齐、灰色至灰黄色、表面光滑半透明、圆屋顶状菌落，有双层溶血环。可通过镜检对形态进一步确定。6 生化鉴定对牛乳培养基的“暴烈发酵”。7 肠内毒素检查采集空肠后段或结肠前段内容物，加适量生理盐水稀释，经离心沉淀后取上清液分成两份，一份加热（60 30min）。两份上清液分别静脉注射家
10、兔（13ml）或小鼠（0.10.3ml）。如有毒素存在，不加热组动物常于数分钟至数小时内死亡，而加热组动物不死亡。8 报告因为正常人畜肠道内存在此菌，并且发病菌主要靠在肠道内产生毒素致病，细菌本身并不侵入机体。因此只有细菌分离和肠毒素检查都符合，并结合临床症状才能报告产气荚膜梭菌感染。鉴别A型和C型要靠中和保护试验。四、猪痢疾诊断1 引用标准参考NY/T 545-2002。2 范围适用于猪痢疾（SD）的实验室诊断。3 粪便中Sh显微镜检查3.1 材料 器材：显微镜，暗视野镜头，玻片及盖玻片，酒精灯等 染色液：结晶紫染色液或稀释的石炭酸复红。 样品：病猪新鲜粪便（含粘）或直肠拭子或大肠内容物及黏
11、膜3.2 操作方法 染色样品制作：取样品直接抹片，干燥，火焰固定，以1.2.2结晶紫液或稀释复红染色2 min3 min，水洗，吸干后待检。 悬滴样品制作：取样品少许悬于生理盐水，待检。每份样品最少制片2张 显微镜检查：染色样品以油镜直接观察，悬滴样品在暗视野4001000倍镜头下观察。3.3 结果判定典型Sh菌体长6 m8.5 m，呈25个密螺旋体，两端尖锐，呈蛇样活泼运动。当视野中有数量（35条以上）Sh样菌体时，在获培养前，可作为诊断的重要参考。4 分离培养和鉴定4.1 材料准备 器材：厌氧培养装置及使用方法，细菌学实验常规器材，外科手术器材，微孔滤器和0.65 m滤膜。 试验动物：小鼠
12、（20 g左右） 试剂：PBS(0.01M，pH7.2)，生理盐水，多粘菌素，TSA。 样品：病猪新鲜粪便或大肠粘膜刮取物（含粘液）。对死猪或扑杀猪大肠分段结扎（每段10cm），分离取出。样品应尽早分离培养，也可04 保存47 d。4.2 操作方法 样品种Sh镜检将样品少许摸片染色或作成悬滴标本，镜检，观察Sh有无活力。含菌量少且无活力者，则难以分离成功。 分离培养.1 直接划线分离法：即取样品直接在TSA上划线接种若干皿。.2 集菌法：先将样品以生理盐水或PBS作1：5稀释，2000 r/min，弃去沉淀。将上清液再以60008000 r/min离心20 min。取沉淀划线接种TSA若干皿。
13、.3 稀释法：将样品或集菌法的沉淀物作10倍梯度稀释至10-610-8。取各梯度稀释液各1滴，分别划线接种于TSA上，（每梯度稀释液最少接种3皿）。接种后的培养皿置厌氧罐内进行厌氧培养。若上述稀释液中加入多粘菌素200 U/mL300 U/mL，可提高分离率。4.3 结果判定 观察每隔24 d开罐检查一次，共24次，观察有无溶血区及溶血菌落。致病性Sh呈强溶血，一般看不见菌落。当培养条件适宜时，再溶血区可见到云雾状菌苔。无害蛇样螺旋体等呈弱溶血。 移植纯化先作溶血区内物质涂片，染色镜检。如见Sh样菌体，可在无菌落溶血区内移取小块琼脂划线于TSA若干皿。如此每隔2天移植一次，一般24次后即可纯化
14、和保存。猪蛇样螺旋体鉴定.1 溶血试验将猪蛇样螺旋体、无害蛇样螺旋体或毛肠蛇样螺旋体及被检菌株，分别划线于同一TSA上不同区内，经48 h培养后，观察比较其溶血程度。.2 肠致病性试验每菌株至少接种6只小鼠，将小鼠停饲24 h后，每只每次灌服1 mL（含菌35亿），次日再灌服一次，15 d后剖检观察盲肠病变。感染后50出现腹泻和病变者，则为致病性Sh。五、猪巴氏杆菌病诊断技术1 引用标准参考NY/T 564-2002。2 范围适用于猪巴氏杆菌病的检测。3 材料3.1 改良马丁氏琼脂3.2 马丁氏肉汤3.3 常用生化培养基。4 组织染色镜检用肝脏组织或心血摸片或纯培养物染色呈阴性，瑞氏染色呈两极
15、浓染的球杆菌。5 病原分离鉴定将濒死前或死后数小时内以无菌手术采取病死猪的心血、肝脏组织，接种于改良马丁氏琼脂斜面，进行分离。培养1824 h后，改良马丁琼脂斜面生长纯粹的培养物，呈微蓝色菌台或菌落。马丁肉汤培养物生长为均匀浑浊，不产生菌膜。6 生化鉴定本菌发酵葡萄糖、果糖、半乳糖，多数发酵蔗糖，不发酵乳糖、肌醇、菊糖、水杨素及鼠李糖，吲哚试验和氧化酶试验阳性。7 诊断判定根据临床症状和病理变化，加上涂片染色镜检，可对本病作出初步的诊断，但确诊要靠病原分离鉴定。六、猪链球菌病诊断技术1 引用标准参考GB/T 199 15.2-2005和GB/T 199 15.9-20052 范围适用于猪链球菌
16、病诊断。3 材料3.1 绵羊血琼脂4 组织染色镜检对最急性和急性病例，无菌采取集病死猪的心、肝、脾、肺、肾和淋巴结等组织做触片，姬姆萨染色，链球菌可见较纯的单个或成双的圆形或椭圆形球菌, 有少量形成短链和长链，如见链球菌则表明病料中可能含有链球菌。5 病原分离鉴定无菌取心、肝、脾、肺、肾或淋巴结内部组织划线接种普通琼脂绵羊血平板，361培养242 h，如果菌落生长缓慢，可延长至482 h后观察。如果是猪链球菌2型，培养24 h，在普通琼脂绵羊血平板形成圆形、微凸、表面光滑、湿润、边缘整齐、半透明的菌落，直径0.3 mm1mm，大多数菌株呈溶血，部分菌株产生溶血。将可疑菌落做革兰氏染色和过氧化氢
17、酶试验。本菌为革兰氏阳性球菌，菌体直径l固体培养物以双球菌为多，少量呈3个5个排列的短链，液体培养物以链状为主，无芽孢，能形成荚膜。本菌过氧化氢酶试验均为阴性。菌落生长特征、革兰氏染色、菌体形态和过氧化氢试验符合者，可初步确定为链球菌。6 生化鉴定 经初步鉴定后，做5乳糖、海藻糖、七叶苷、甘露醇、山梨醇、马尿酸钠等糖发酵试验。7 PCR鉴定是否为猪链球菌2型 必要时进行猪链球菌2型毒力因子PCR检测。7.1 仪器：台式高速（12000 r/min）离心机；DNA扩增仪；水浴锅；稳压稳流电泳仪和水平电泳槽；电泳凝胶成相分析系统；可调移液器一套，包括120 L 2支，20200L 1支，20010
18、00L 1支；与移液器匹配的滴头；1.5 mL离心管；0.5 mL或0.2 mL（与扩增仪配套）塑料管。7.2 试剂7.2.1 细菌DNA提取试剂盒7.2.2 2.5 mmol/L dNTP7.2.3 10PCR Buffer7.2.4 25 mmol/L MgCl27.2.5 10 pmol/L引物7.2.6 Taq DNA聚合酶7.2.7 50TAE（保存液）和1TAE（使用液）7.2.8 琼脂糖：电泳级7.2.9 CYBgreen7.3 PCR引物根据猪链球菌2型溶血素基因设计引物，引物序列如下，其目的片断长度为495 bp。sly1：5-CCCAAGTTCAAGCCGCATTTA-3(
19、1542)sly2：5-GAAGATTGCGAGCATTTCCTG-3(2036)7.4 DNA提取 利用对数生长期的液体培养物，严格按照DNA提取试剂盒说明书进行。7.5 PCR扩增反应体系25L：细菌总DNA 5.0L10 pmol/L的上游引物 1.0L10 pmol/L的下游引物 1.0L2.5 mmol/L dNTPs混合物 2.0L10PCR Buffer 2.5L25 mmol/L的MgCl2 2.0L5 U的TaqDNA聚合酶 0.3L双蒸水补至25L。循环参数：95 预变性 5 min；94 变性 1 min；56 退火 1 min； 共35个循环，72 延伸 1 min；
20、72 延伸10 min，4 保存。7.6 电泳检测取1.5g琼脂糖，于100 mL电泳缓冲液中加热，充分溶化，制胶。在电泳槽中加入电泳缓冲液，使液面刚刚没过凝胶。取810l PCR扩增产物分别和适量加样缓冲液和CYBgreen混合后加样，进行电泳。电压大小根据电泳槽长度来确定，一般控制在3 V/cm5V/cm，电泳时间为30 min35 min。将电泳好的凝胶放紫外透射仪或凝胶成像系统上观察结果。阳性对照的PCR产物电泳后在495 bp的位置上出现一条特异性条带，阴性对照PCR产物电泳后没有条带，试验结果成立。在试验结果成立的前提下，如果样品中PCR产物电泳后在495 bp的位置上出现一条特异
21、性条带，判为该菌株含有猪链球菌2型溶血素基因。七、副猪嗜血杆菌（Hps）PCR诊断技术1 引用标准自定标准。2 范围副猪嗜血杆菌诊断。3材料3.1 仪器：台式高速（12000 r/min）离心机；DNA扩增仪；水浴锅；稳压稳流电泳仪和水平电泳槽；电泳凝胶成相分析系统；可调移液器一套，包括120 L 2支，20200L 1支，2001000L 1支；与移液器匹配的滴头；1.5 mL离心管；0.5 mL或0.2 mL（与扩增仪配套）塑料管。3.2 试剂 TSA培养基 TSB培养基3.2.3 10 mmol/L Tris/1 mmol/L EDTA溶液中 溶菌buffer (0.0005%Tween
22、20，0.24 mg/mL proteinaseK和0.1 mol/L Tris，pH8.5)3.2.5 2.5 mmol/L dNTP3.2.6 10PCR Buffer3.2.7 25 mmol/L MgCl23.2.8 10 pmol/L引物3.2.9 50TAE（保存液）和1TAE（使用液） Loading Buffer 琼脂糖 CYBgreen4 操作方法4.1 镜检对从临床症状疑似副猪嗜血杆菌病的发病仔猪的肺和脾作组织触片，革兰氏染色，副猪嗜血杆菌镜检呈革兰氏阴性小球杆菌。4.2 分离培养取出患病仔猪病变肺、气管分泌物、胸水、腹水及脾组织，划线接种于TSA平板。37 ，5%CO2培
23、养2448。副猪嗜血杆菌呈无色、透明、湿润、光滑的露珠样细小菌落，革兰氏染色呈阴性小球杆菌，老龄培养物呈多形态(细小杆状、短链状和长丝状)。4. 3 PCR引物设计 HP 16S1：5-GTGATGAGGAAGGGTGGTGT-3 HP 16S2：5-GGCTTCGTCACCCTCTGT-3该引物扩增出编码16SrRNA的DNA部分片段，长度为822 bp。 tbpA55：5-TTAGCCTTGCTCTTCTTAGCC-3 tbpA33：5-AAGCTTGAAACTAAGGTACTCTAA-3 该引物扩增出编码转铁结合蛋白A的DNA部分片段，长度为1.9 kb。4.4 细菌DNA提取将TSA平
24、板上典型菌落接种TSB，37 过夜培养，取对数生长期分离菌悬浮于10 mmol/L Tris/ 1 mmol/L EDTA溶液中，10000 r/min离心5min；弃上清，沉淀用溶菌buffer重悬；56 作用30 min；最后煮沸15 min；12000 r/min离心5min；收集上清，-20 保存备用。注：DNA的提取可以用试剂盒，按试剂盒操作说明进行，以节省时间，减少DNA损失。4.5 编码16S rRNA的DNA部分片段的扩增反应体系25L：细菌总DNA 2.0L10 pmol/L的上游引物 1.0L10 pmol/L的下游引物 1.0L2.5 mmol/L dNTPs混合物 2.
25、0L无Mg2+缓冲液 2.5L25 mmol/L的MgCl2 1.5L5 U的TaqDNA聚合酶 0.3L双蒸水补至25L。循环参数：95 预变性 5 min；94 变性 30 s；59退火 30 s； 共30个循环，72 延伸 90 s；72 延伸 10 min。4.6 编码tbpA的DNA部分片段的扩增反应体系同4.5，循环参数为：94 预变性 5 min;94 变性 1 min； 50 退火 1 min； 共30个循环72延伸 2 min；最后72 延伸 10 min。4.7 结果分析与判定4.7.1 1琼脂糖凝胶板的制备称取1 g琼脂糖，加入100 mL 1TAE中，加热融化后，倒入放
26、置在水平台面上的凝胶盘中，胶板厚5 mm左右。依据样品数选用适宜的梳子。待凝胶冷却凝固后拔出梳子（胶中形成加样空），放入电泳槽中，加1TAE缓冲液淹没胶面。 加样取68 L PCR扩增产物和23 L加样缓冲液和适量CYBgreen混匀后加入一个加样孔。每次电泳至少加1孔阳性对照的扩增产物作为对照，没有阳性对照的情况下，一定加Marker。 电泳电压80100 V，或电流4050 mA，电泳3040 min。 结果观察与判定电泳结束后，取出凝胶板置于紫外透射仪上，打开紫外灯观察。如某一待检样品扩增产物的DNA带与阳性对照的带在一条直线上，即他们与加样孔的距离相同，或根据Marker判定大小与设计
27、的大小（820 bp和1.9 kb）一致，则该样品判定为阳性。5 诊断判定同份样品在2个PCR中全部阳性的才可以判为本猪（群）已经感染Hps，根据流行病学、临床症状和病理变化判定猪群是否发病。八、猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）PCR检测技术1 引用标准自定标准。2 范围 适用于PRRS的PCR诊断。3材料3.1 仪器：组织匀浆机；低温台式高速（12000 r/min）离心机；DNA扩增仪；水浴锅；稳压稳流电泳仪和水平电泳槽；电泳凝胶成相分析系统；可调移液器一套，包括120 L 2支，20200L 1支，2001000L 1支；与移液器匹配的滴头；1.5 mL离心管；0.5 mL或0.2 mL（
28、与扩增仪配套）塑料管。3.2 试剂 Trizol试剂 氯仿异丙醇 反转录酶M-MLV（200 U/L）3.3.5 75%乙醇3.2.6 0.1%焦碳酸二乙酯（DEPC）水溶液3.2.7 2.5 mmol/L dNTP3.2.8 10PCR Buffer3.2.9 25 mmol/L MgCl23.2.10 10 pmol/L引物3.2.11 50TAE（保存液）和1TAE（使用液） Loading Buffer 琼脂糖 Oligo(dT)18（50 mol/L） CYBgreen4 操作步骤4.1 样品采集取疑似猪的肺脏、淋巴结和脾脏病变部位组织，-20 保存备用。4.2 样品处理取部分组织样
29、品，磨碎并用0.01M PBS（PH 7.27.4）稀释成1: 5乳剂（或将病料用剪刀剪成小块，放入5 mL青霉素小瓶，进一步剪碎，按5倍体积的0.01M PBS后，用匀浆机匀浆），-20保存备用或立即用于RNA提取。4.3 RNA的提取a) 取处理好的稀释样品200300 L，加入700 L TRIZOL试剂，涡悬混匀，在1530 温育23 min；加入200 L的氯仿，盖紧管盖，上下颠倒混匀15 s，1530温育23 min，28 12000 g离心15 min；b) 转移水相500 L到一新的离心管中，加入0.5 mL的异丙醇，1530作用10 min，28 12000 g离心10 mi
30、n；c) 弃去上清液，加入75%乙醇1.0 mL，振摇，28 7500 g离心5 min；d) 弃去上清，干燥沉淀物（室温约5 min）；加入20 L DEPC水溶解，-20 保存或立即使用（置冰上）。4.4 引物设计根据文献和PRRSV代表株VR2332和LV设计了一对引物：PRRSV N1： 5-ATGGCCAGCCAGTCAATCA-3PRRSV N2： 5-TCGCCCTAATTGAATAGGTG-34.5 RT总体积为10 L，反应体系如下：5RT buffer 2.0 LdNTP（10 mmol/L） 0.25 LOligo(dT)18 0.5 LRNA 模板 7 L混匀离心，65
31、 作用10 min，冰上冷却，加入M-MLV （200 U/L） 0.25 L，421h，冰上冷却后作为PCR模板。4.6 PCRPCR 反应总体积为25 L，包括：2条PRRSV引物（10 pmol/L） 各1 LMg+(25 mmol/L) 1.5 LdNTP (2.5 mmol/L) 2.0 L10Buffer 2.5 LTaq 酶（5 U/L） 0.2 L模板cDNA 5 L灭菌双蒸水 11.8 L瞬时离心混匀，将PCR反应管置于PCR仪内。PCR反应参数为：95预变性 5 min；94 45 min；51 45 min； 共35个循环，72 1 min；72延伸 10 min。将PC
32、R产物放4 保存或立即做琼脂糖凝胶电泳，分析PCR产物。4.7 结果分析与判定4.7.1 1.5琼脂糖凝胶板的制备称取1.5 g琼脂糖，加入100 mL 1TAE中，加热融化后，倒入放置在水平台面上的凝胶盘中，胶板厚5 mm左右。依据样品数选用适宜的梳子。待凝胶冷却凝固后拔出梳子（胶中形成加样空），放入电泳槽中，加1TAE缓冲液淹没胶面。 加样取68 L PCR扩增产物和23 L加样缓冲液和和适量CYBgreen混匀后加入一个加样孔。每次电泳至少加1孔阳性对照的扩增产物作为对照，没有阳性对照的情况下，一定加Marker。 电泳电压80100 V，或电流4050 mA，电泳3040 min。 结
33、果观察与判定电泳结束后，取出凝胶板置于紫外透射仪上，打开紫外灯观察。如某一待检样品扩增产物的DNA带与阳性对照的带在一条直线上，即他们与加样孔的距离相同，或根据Marker判定大小与设计的大小（400 bp或430 kb）一致，则该样品判定为阳性。5 诊断判定PCR检测结果阳性，表明该猪（群）已感染PRRSV，根据流行病学、临床症状和病理变化判定猪群是否发病。九、古典猪瘟（CSFV）PCR检测技术1 引用标准自定标准。2 范围适用于古典猪瘟（CSFV）的PCR诊断。3材料3.1 仪器：组织匀浆机；低温台式高速（1300020000 r/min）离心机；DNA扩增仪；水浴锅；稳压稳流电泳仪和水平
34、电泳槽；电泳凝胶成相分析系统；可调移液器一套，包括120 L 2支，20200L 1支，2001000L 1支；与移液器匹配的滴头；1.5 mL离心管；0.5 mL或0.2 mL（与扩增仪配套）塑料管。3.2 试剂 Trizol试剂 氯仿 异丙醇 反转录酶M-MLV（200 U/L）3.3.5 75%乙醇3.2.6 0.1%焦碳酸二乙酯（DEPC）水溶液3.2.7 2.5 mmol/L dNTP3.2.8 10PCR Buffer3.2.9 25 mmol/L MgCl23.2.10 10 mol/L引物3.2.11 50TAE（保存液）和1TAE（使用液） Loading Buffer 琼脂
35、糖 BSA(0.4 mg/mL) CYBgreen4 操作方法4.1 病料采集：可用于检测的病料包括扁桃体、淋巴结、脾脏和母猪流产胎儿及死胎(扁桃体、淋巴结和脾脏)，-20 保存备用。4.2 病料处理：取部分材料0.52.0 g于无菌研钵，磨碎并用PBS（0.01M, PH 7.27.4）稀释成1: 5乳剂（或将病料用剪刀剪成小块，放入5 mL青霉素小瓶，进一步剪碎，按5倍体积的PBS后，用匀浆机匀浆），-20 保存备用或立即用于RNA提取。4.3 RNA提取a) 取处理好的稀释样品200300 L，加入700 L TRIZOL试剂，涡悬混匀，在1530 温育23 min；加入200 L的氯仿
36、，盖紧管盖，上下颠倒混匀15 s，1530温育23 min，28 12000 g离心15 min；b) 转移水相500 L到一新的离心管中，加入0.5 mL的异丙醇，1530作用10 min，28 12000 g离心10 min；c) 弃去上清液，加入75%乙醇1.0 mL，振摇，28 7500 g离心5 min；d) 弃去上清，干燥沉淀物（室温约5 min）；加入20 L DEPC水溶解，-20 保存或立即使用（置冰上）。4.4 引物设计根据华中农业大学2004年在Genbank中公开发表的序列DQ127910设计的引物，产物大小为374bp，引物序列如下：gE1: 5-CCACCCGACG
37、CTACGATTGT-3gE2: 5-CTGGCATCCATCATTCCCTG-34.5 RT以提取到的组织总RNA为模板，进行反转录，反转录体系为20L。反转录体系如下：RNA 7 L10 mol/L引物(gE1/gE2) 1 L于70水浴中5分钟，然后室温冷却10分钟；再加入： dNTP (10 mM) 1 L5M-MLV buffer 4 LBSA(0.4 mg/mL) 5 LM-MLV 反转录酶 1 L 混均后，37水浴45-60分钟。-20保存。4.6 PCR扩增反应cDNA 5.0 L10PCR buffer 2.5 LdNTP (2.5 mM) 2.0 LMgCl2（25 mM）
38、 1.5 L上游引物（10 mol/L） 1.0 L下游引物（10 mol/L） 1.0 LTaq DNA聚合酶（5 U） 0.2 L灭菌双蒸水 1.8 L配好反应液后，将PCR反应管置于PCR仪内，循环参数如下：95 5 min94 45 min;56 45 min; 共35个循环72 1 min；72 10 min将PCR产物放4 保存或立即做琼脂糖凝胶电泳，分析PCR产物。4.7 结果分析与判定4.7.1 1.5琼脂糖凝胶板的制备称取1.5 g琼脂糖，加入100 mL 1TAE中，加热融化后，倒入放置在水平台面上的凝胶盘中，胶板厚5 mm左右。依据样品数选用适宜的梳子。待凝胶冷却凝固后拔
39、出梳子（胶中形成加样空），放入电泳槽中，加1TAE缓冲液淹没胶面。 加样取68 L PCR扩增产物和23 L加样缓冲液和适量CYBgreen混匀后加入一个加样孔。每次电泳至少加1孔阳性对照的扩增产物作为对照，没有阳性对照的情况下，一定加Marker。 电泳电压80100 V，或电流4050 mA，电泳3040 min。 结果观察与判定电泳结束后，取出凝胶板置于紫外透射仪上，打开紫外灯观察。如某一待检样品扩增产物的DNA带与阳性对照的带在一条直线上，即他们与加样孔的距离相同，或根据Marker判定大小与设计的大小（370 bp）一致，则该样品判定为阳性。5 诊断判定如果是在免疫后20 d采集的样品，PCR检测结果阳性，表明该猪（群）已感染野毒，根据流行病学、临床症状和病理变化判定猪群是否发病。