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1、胎牛血清对人胚胎神经干细胞分化的影响（完整版）实用资料(可以直接使用，可编辑 完整版实用资料，欢迎下载）论著文章编号:100025404(20030120004203胎牛血清对人胚胎神经干细胞分化的影响李巍,李成仁,蔡文琴,姚忠祥(第三军医大学基础医学部组织学与胚胎学教研室,重庆400038提要:目的探索胎牛血清对人神经干细胞(NSCs的影响。方法采用细胞培养、免疫组化、流式细胞仪检测的方法,观察了不同浓度胎牛血清对人NSC分化的影响。结果胎牛血清促进人NSC分化为神经系统的主要的3种细胞(神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞,且培养基中胎牛血清浓度为15%时,人NSC分化为星形胶质细胞的数量占
2、80% 90%。结论胎牛血清影响人NSC分化为神经元和神经胶质细胞的比例,并与胎牛血清的浓度有一定的关系。关键词:神经干细胞;胎牛血清;人中图法分类号:R392.7;R329.28;R322.8文献标识码:AE ffects of fetal bovine serum on differentiation of human fetal neural stem cells in vitro LI Wei,LI Cheng2ren,C AI Wen2qin,Y AO Zhong2xiang(Department of Histology and Embry ology,Third M ilitar
3、y Medical University, Chongqing400038,ChinaAbstract:ObjectiveT o observe the effects of fetal bovine serum(F BSon differentiation of human neural stem cells(NSCs.MethodsThe effects of F BS with different concentrations on differentiation of human fetal NSCs were observed by cell culture,immunocytoch
4、emistry and flow cytometry.Re sultsHuman fetal NSCs could be induced to differentiate mainly three types of nerve system cells(neuron,astrocyte and olig odentrocyte.There were 80%90%astrocytes of differentiated cells from human fetal NSCs with the concentration of15%F BS induced.ConclusionC oncentra
5、tion2dependent F BS in culture medium may have effect on the ratio of neurons to glial cells differentiated from human NSCs in vitro.K ey w ords:neural stem cell;fetal bovine serum;human随着神经干细胞的分离、培养成功,探索神经干细胞的增殖、分化机制,成为人们关注的焦点。首先,它将为阐明神经系统发育机制提供有力证据;其次,为神经干细胞的应用,提供更有价值的资料。许多退行性疾病、缺血、损伤等均有神经元的大量丢失。若
6、能离体或在体诱导神经干细胞向神经元方向分化,提供相对于各种疾病的神经细胞,将成为治疗疾病的理想材料。目前已知,细胞因子、生长因子以及周围环境等因素的作用可诱导神经干细胞向不同的终末神经细胞分化,如睫状神经生长因子(Ciliary neurotrophic factor,C NTF诱导神经干细胞向神经元方向分化1;脑源性生长因子(Brain2derived neurotrophic factor,BDNF和神经营养素23(Neurotrophic23,NT23使其更多地分化为神经元2;骨形成蛋白(Bone m orphogenetic protein,BMP可诱导神经干细胞向胶质细胞分化3。本实
7、验利用分离基金项目:国家自然科学基金资助项目(30130110作者简介:李巍(1964-,女,四川省双流县人,博士,实验师,主要从事神经发育和再生方面的研究。 :(02368752229通信作者:蔡文琴, :(02368752233,E2mail:wenqinpublic.cta.cq 收稿日期:2002209210;修回日期:2002212210培养第5代的人胚胎神经干细胞,用不同浓度的胎牛血清在培养条件下诱导神经干细胞分化,了解神经干细胞分化为神经元和神经胶质细胞的比例,为神经干细胞的定向分化,提供基础资料。1材料和方法111分组培养第5代的人胚胎神经干细胞分成4组:无血清培养组,5%胎牛
8、血清组,10%胎牛血清组,15%胎牛血清组,每组的基础培养基均为DME MF12(G ibco公司,胎牛血清(G ibco公司。112用于光镜免疫组化检测的诱导分化实验将每组的神经干细胞分别置入(预先放有涂有多聚赖氨酸的盖玻片35mm培养皿中,1.52ml培养液皿,50100个细胞集落ml,培养7d后收集各组贴有细胞的盖玻片,用4%多聚甲醛加3%饱和苦味酸固定液固定812h后,行NF2200和G FAP免疫组化染色(常规免疫组化染色步骤,光镜观察。113用于流式细胞仪检测的诱导分化实验将每组的神经干细胞分别置入50ml培养瓶中,56ml培养基瓶,200300个细胞集落ml,培养7d后,用0.2
9、5%胰酶4第25卷第1期2003年1月第三军医大学学报ACT AAC ADE MI AEME DICI NAEMI LIT ARISTERTI AEV ol.25,N o.1Jan.2003消化2030min ,并用吸管反复吹打细胞使之脱落,收集分化细胞于10ml 离心管中离心510min ,收集细胞用4%多聚甲醛加3%饱和苦味酸固定液固定812h 后,行NF 2200和G FAP 免疫荧光染色(常规免疫组化染色,流式细胞仪检测,数据采用SPSS 软件包进行统计学处理,计算分化细胞的百分率(%,并进行组间2检验。2结果211相差显微镜下观察和免疫组化结果在相差显微镜下,未分化的神经干细胞呈集落
10、样悬浮生长见图1,培养基中去除碱性成纤维细胞生长因子(bFG F 以后,有血清组神经干细胞很快贴壁(约4h ,而无血清培养组细胞贴壁则相对较慢,培养12h 以后各组均见有贴壁的细胞,并有突起长出。培养过程中可见有血清培养组的细胞长得很快、数量较多,并可见到3种类型的细胞,见图2:具有一个或两个突起、突起较长,折光性很好,细胞核圆形或椭圆形的神经元样细胞。具有多个粗、长突起,细胞较大,紧贴底部的星形胶质细胞。具有多个细胞突起,突起有分枝的少突胶质细胞,此种细胞常成群分布在神经干细胞分化所形成放射状分化细胞团的周边。用S ABC 2硫酸镍铵增强法,更进一步地证实了我们的以上观察,即,有12个长突起
11、的,折光性很强的为NF 2200阳性神经元,见图3;细胞较大、突起粗大,细胞平贴在盖玻片上的为G FAP 阳性星形胶质细胞,见图4;细胞突起细、短、胞体体积较小的为少突胶质细胞。212流式细胞仪检测结果流式细胞仪检测结果提示:胎牛血清对神经干细胞的分化有非常明显的影响,培养基中胎牛血清的浓度越高,神经干细胞向胶质细胞方向分化的趋势越大,在含15%胎牛血清的培养液中,神经干细胞所分化的细胞中,80%90%为G FAP 阳性星形胶质细胞,而在无血清培养基中,却有50%60%的神经干细胞分化为NF 2200阳性神经元,见图5 。图1人神经干细胞集落(第5代,相差显微镜200Fig 1A colony
12、 of hum an fetal NSCs (fifth generation ,underthe phase contrast light m icroscopy 200 图210%FBS 诱导人神经干细胞分化7d (相差显微镜200Fig 2Differentiated cells from hum an fetal NSCs with 10%FBS inducedat 7th d ay (under the phase contrast light m icroscopy 200 图35%FBS 诱导人神经干细胞分化14d 后,NF 2200免疫组化阳性反应细胞(S ABC 2硫酸镍铵增
13、强法200Fig 3A fter 14d ays of differentiation of HNSCs with 5%FBS in 2duced ,NF 2200immunopositve cells (S ABC 2Nickel amm onium sulfate enhancement 200 图45%FBS 诱导人神经干细胞分化14d 后,G FAP 免疫组化阳性反应细胞(S ABC 2硫酸镍铵增强法400Fig 4A fter 14d ays of differentiation of HNSCs with 5%FBS in 2duced,G FAP immunopositve ce
14、lls (S ABC 2Nickel amm onium sulfate enhancedment 4005第1期李巍,等.胎牛血清对人胚胎神经干细胞分化的影响 图5胎牛血清对神经干细胞分化的影响(%Fig 5E ffects of fetal bovine serum on differentiation of NSCs (%3讨论神经干细胞的分化受到许多因素的影响,目前认为神经营养因子、生长因子、细胞粘附因子、周围环境等均可影响神经干细胞的分化。但其确切机制仍不清楚。探索神经干细胞的分化机制,以便使其向着人们所需要的方向分化,更好地为患者服务。311神经干细胞的自行分化有资料显示:将丝裂原
15、从神经干细胞培养液中撤除后,NSC 即进入分化阶段。其中EG F 反应性干细胞绝大多数分化为胶质细胞,分化为神经元的比例不足1%,随传代数目增加,这个比例还将进一步下降4;有人从胚龄16d 的大鼠海马取出的多能干细胞体外bFG F 扩增后,发现bFG F 神经干细胞则更多分化为神经元表型祖细胞5,6。研究者将这一现象称为“缺席分化(Default differentiation ”,其机制不清。有趣的是,许多研究已证实正常胚胎发育过程中bFG F 反应性干细胞早于EG F 反应性干细胞出现,而神经元发生恰恰早于胶质细胞发生。以上两种现象间可能存在某种必然联系。本实验用的是bFG F 作为有丝分
16、裂原培养的人胚胎神经干细胞,在去除bFG F 后,神经干细胞自行分化,从免疫组化和流式细胞仪检测结果看,神经干细胞自行分化成神经元的比例较高,达到561893117。与以上报道结果基本一致。312牛血清对神经干细胞分化的影响去除有丝分裂原后,在培养基中加入不同浓度的胎牛血清,发现胎牛血清的含量对神经干细胞分化的影响很大,且有一定的倾向性,即胎牛血清含量越高,分化成胶质细胞的比例增大,血清浓度在15%时,星形胶质细胞达到87.712158。这一结果与刘士勇等7报道基本相似。胎牛血清的成分十分复杂,包括一些对细胞的增殖、分化具有重要作用的已知细胞因子和未知因子,可能是导致神经干细胞更多地分化为胶质
17、细胞的影响因素。已知的因子包括神经营养因子、生长因子、细胞粘附分子以及其它具有营养作用的细胞因子,如神经生长因子、白介素21、维甲酸等,未知的因子目前尚知之甚少,如一些存在于细胞条件培养液的因子8。因此,是何种单一因子或是多种因子联合作用,导致人胚胎神经干细胞的分化差异,还有待进一步研究。参考文献:1Johe K K,Hazel T G,Muller T ,et al .S ingle factor direct the differentiationof stem cell from the fetal and adult central nerv ous systemJ .G enes D
18、ev ,1996,10(24:3129-3140.2G hosh A ,G reenberg M E.Distinct roles for bFG F and NT 23in the regula 2tion of cortical neurogenesisJ .Neuron ,1995,15(1:89-103.3Bartlett P F ,Brooker GJ ,Faux C H ,et al .Regulation of neural stem celldifferentiation in the forebrainJ .Immunol Cell Biol ,1998,76(5:414-4
19、18.4G age F H ,Ray J ,Fisher L J.Is olation ,characterization and use of stemcells from the CNSJ .Ann Rev Neurosci ,1995,18:159-192.5T akahashi T ,Palmer T D ,G age F H.Retinoitic acid and neurotrophins col 2laborater to regulate neurogenesis in adult derived neural stem cell cultures J .J Neurobiol
20、 ,1999,38(1:65-81.6T atebayashi Y,Iqbal K,G rundke 2Iqbal I.Dynam ic regulation of ex pressionand ph os ph orylation of tau by fibroblast grow th factor 22in neural progenitor cells from adult rat hippocam pusJ .J Neurosci ,1999,19(13:5245-5254.7刘士勇,张可成,杨辉等.I L 21和胎牛血清对大鼠神经干细胞分化的影响J .中国组织化学与细胞化学杂志,2
21、000,9(4:432-43518Lundberg C ,M artinez 2Serrano A ,Cattaneo E ,et al .Survival integrationand diffentiation of neural stem cell lines after transplantiation to the adult rat striatumJ .Exp Neurol ,1997,145(2Pt 1:260-342.(编辑冯崇英(上接3页关键词:坏疽性脓皮病;诊断中图法分类号:R753文献标识码:B参考文献:1Bennett M L ,Jacks on J M ,Joriz
22、z o J L ,et al 1Py oderma gangrenosum :Acom paris on of typical and atypical forms with an em phasis on time to rem is 2sion 1Case review of 86patients from 2institutionsJ 1M edicine (Balti 2m ore 2000,79(1:37-4612Riahi I ,M okni M ,Haouet S ,et al 1Py oderma gangrenosum :15casesJ .Ann M ed Interne
23、(Paris ,2001,152(1:3-913Delbrel X ,G ermain P ,Fach J ,et al 1Cutaneous py oderma gangrenosumwith hepatosplenic localization and m onoclonal gammapathy.A case report J 1Ann M ed Interne (Paris ,2001,152(1:65-671(编辑王红6第三军医大学学报第25卷组织工程绿色荧光蛋白标记基因体内示踪骨髓间充质干细胞的分化胡运生1马保安1李文海2张勇1范清宇1【摘要】目的利用绿色荧光蛋白(green fl
24、uo rescen t p ro tein,GFP标记技术,观察组织工程骨在体内形成过程中种子细胞的变化与转归。方法A deno2X T M2GFP扩增和纯化后,测定病毒滴度,感染新西兰大白兔骨髓间充质干细胞(m esenchym al stem cells,M SC s,倒置相差显微镜观察细胞形态变化,并在荧光显微镜下观察GFP表达情况。确认标记成功后,将其与未标记的兔M SC s共同成骨诱导培养3周后,接种于磷酸钙骨水泥(calcium pho sphate cem en t, CPC2纤维蛋白胶(fib rin glue,FG复合支架材料,构建组织工程骨作为实验组,回植于供体兔皮下。单纯
25、CPC2FG复合支架材料植入对称部位作为对照。术后1、2、3周行碱性磷酸酶(alkaline pho sphatase,AL P活性测定;4周,激光共聚焦显微镜下对GFP进行示踪观察和 型胶原、骨钙素(o steocalcin,OC免疫组织化学检测成骨细胞功能蛋白,M asson染色观察新骨形成。结果A deno2X T M2GFP经扩增和纯化后,病毒噬菌斑形成,测得病毒滴度为3108pfu m l。A deno2X T M2 GFP感染M SC s后96h,可见GFP表达,感染率达50%70%,细胞分裂增殖基本正常。术后1、2、3周,实验组AL P活性差异有统计学意义(P0105。4周,实验
26、组大体可见组织工程新骨形成,对照组未见新骨形成;组织学显示实验组新生骨小梁围绕材料孔隙形成,CPC2FG复合支架材料部分降解;实验组 型胶原、OC免疫组织化学结果阳性,对照组未见阳性染色;实验组可见新生组织内有GFP标记的细胞。结论组织工程骨组织结构与松质骨小梁类似,新生组织表达GFP,提示组织工程骨组织的形成来源于接种的细胞。【关键词】组织工程骨骨髓间充质干细胞腺病毒载体绿色荧光蛋白兔中图分类号:R318108Q813111文献标识码:AGREEN F L UORESCENT PR OTE IN LABEL ING GENE TRANSFERRED INT O M ESENCHYM AL S
27、TE M CELL S T O TRACE THE IR D IFFERENTI ATI ON IN V IV O H U Y unsheng,M A B aoan,L I W enha i,et a l.Cen ter of O rthop ed icS u rg ery,O rthop ed ic O ncology Institu te of PL A,T ang d u H osp ita l of F ou rth M ilita ry M ed ica l U n iversity,X ianCorresp ond ing au thor:FA N Q ingy u,E2m a i
28、l:bonet mf mm u.ed u 【Abstract】ObjectiveTo ob serve the tissue engineered bone fab ricated w ith the cu ltu red m esenchym al stem cells(M SC sby the green fluo rescen t p ro tein(GFPgene tran sfer.M ethodsT he recom b inan t A deno2X T M2GFPexp ressi on vecto r w as pu rified after being packed and
29、 p ro liferated by the H EK293cells,and then it w as u sed to infectthe rabb its M SC s directly after the viru s titer w as assayed.T he cell mo rpho logical changes w ere ob served under the inverted phase con trast m icro scope,and the exp ressi on of GFP w as ob served under the fluo rescence m
30、icro scope to confirm success of the labeling of M SC s.T he GPF2labeled M SC s and the pu re M SC s w ere cu ltu red together in the conven ti onal o steogen ic supp lem en ts fo r3w eek s,and then they w ere seeded on to the compound scaffo ld of the calciumpho sphate cem en t(CPCand the fib rin g
31、lue(FGto fo rm a new k ind of the tissue engineered bone.It w as i m p lan tedin to the donato r rabb it subcu taneou sly to be u sed as the experi m en tal group;in con trast,the pu re compound scaffo ld ofthe CPC2FG w ithou t any M SC s w as i m p lan ted in the sam e rabb it as a con tro l.T he a
32、lk line pho sphatase(AL Pactivity assay w as perfo rm ed respectively at1,2and3w eek s after operati on.GFP w as ob served under the laser confocalm icro scope at4w eek s after operati on,and the fo rm ed new bone w as harvested at4w eek s and evaluated by the M asson stain ing,the i m m unoh istoch
33、em istry stain ing of o steocalcin(OCand co llagen type .ResultsT he viru s titer w as3108pfu m l after p ro liferati on and pu rificati on.Exp ressti on of GFP w as confirm ed96h after M SC s w ere infected by theA deno2X T M2GFP exp ressi on vecto r and the infecti on rate w as p rox i m ally50%27
34、0%.In con trast to M SC s,divisi on andp ro liferati on of the GPF2labeled M SC s w ere no t sign ifican tly differen t.T he AL P activity in the experi m en tal group基金项目:国家自然科学基金资助项目(30330610作者单位:1第四军医大学唐都医院骨肿瘤研究所暨全军骨科中心(西安,710038,2胸外科(12154611091,16156701659,20214301706w as sign ifican tly h ighe
35、r than that in the con tro l group(0145301113,0124301018,0130801056,respectively at1,2and3w eek s after operati on(P0105.T he tissue engineered bone fo rm ed at4w eek s.T here w ere new ly2fo rm ed trabecu lae around the po re of the compound scaffo ld,and the i m m unoh istochem istry stain ing of
36、OC and co llagen type w ere po sitive.T he laser confocalm icro scope revealed that the GFP2labeled cells ex isted in m any new ly2fo rm ed tissues,and the compound scaffo ld of CPC2FG w as partly degraded. ConclusionT he engineered bone is si m ilar to the spongy bone and the compo sed cells o rigi
37、nate from the cu ltu red M SC s,all of w h ich can be confirm ed by the GFP gene tran sfer techn ique.【Key words】T issue engineered boneM esenchym al stem cellsR ecom b inan t adenoviru s vecto rGreen fluo rescen t p ro teinR abb itFounda tion ite m:N ati onal N atu ral Science Foundati on of Ch ina
38、(30330610骨髓间充质干细胞(m esenchym al stem cells, M SC s因获取及培养容易,扩增后数量充足,且自体细胞避免了免疫排斥反应等特点,已成为骨组织工程研究中理想的种子细胞1,2。M SC s在体外成骨诱导培养条件下,能表现出一些成骨细胞的表型特征,即碱性磷酸酶(alkaline p ho sp hatase,AL P、 型胶原、骨钙素(o steocalcin,O C表达及钙结节形成等,在体内复合生物材料植入骨缺损部位一定时间后能成骨325。但对于其植入受体后如何转归,是在体内各种因子的刺激下向成骨方向转化,最终形成新骨;还是在受体组织中死亡,而由受体组织中
39、的成骨细胞或干细胞沿材料爬行替代成骨;或是二者兼有这个问题还存在争论。一般认为,种子细胞在体内各种因子的刺激下向成骨方向转化,最终参与形成新骨,但是缺乏证据。我们的实验利用绿色荧光蛋白(green fluo rescen t p ro tein, GFP基因标记技术,直接追踪植入的M SC s在体内的分化与转归,为阐明M SC s在体内异位成骨的作用,提供了直接证据,也为组织工程种子细胞的标记提供了一种灵敏、可靠且又直观的方法。1材料与方法1.1实验动物及材料2.00mm的圆柱状6,直接分装于24孔培养板,塑料包装袋热压密封,60Co消毒备用。1.2实验方法量未标记兔M SC s同时进行扩增和
40、成骨诱导。成骨诱导的两种M SC s混匀接种至CPC2FG复合支架材料上,按V acan ti等7推荐标准:接种细胞数量5107个 m l,计算出实验使用的1枚支架体积约需用1.8106个细胞。24孔培养板中继续成骨诱导培养1周后,取4枚支架回植于实验兔一侧背部竖脊肌中,以4枚单纯CPC2FG植入对称部位作为对照组并分别标记。1.3检测指标1.4统计学方法采用SPSS11.0统计软件包进行分析。数据以均数标准差表示,组间比较采用D unnet t、t检验,P值 0105为有统计学意义。2结果2.1A deno2X TM2GFP重组腺病毒的扩增和纯化A deno2X TM2GFP感染H EK29
41、3细胞,8d出现CPE。H EK293细胞感染后出现贴壁不牢,易脱落,部分细胞空泡样变及死亡(图1。经空斑形成实验测得病毒滴度为3108p fu m l。2.2M SC s分离培养及GFP标记兔M SC s表现为长梭形的成纤维细胞样,排列呈旋涡状(图2。A deno2X TM2GFP感染后细胞形态规则,生长旺盛,随培养时间延长多角形细胞增多,未见显著细胞形态改变,部分细胞胞浆可见较多分泌性颗粒,细胞分裂增殖基本正常,与未感染的M SC s相比,三角形、多角形细胞所占比例增多(图3。A deno2X TM2GFP 感染兔M SC s,48h后可在荧光显微镜蓝光激发波长下,见到较暗的绿色荧光,腺病
42、毒感染成功;96h后部分细胞发出明亮的绿色荧光,感染率达到50%70% (图4。2.3M SC s在异位成骨中的作用表1各组各时间点的AL P活性(n=3,U g,xsTab.1The AL P activ ity of the spec i m en at differen t ti m es(n=3,U g,xs分组Group1周1w eek2周2w eek s3周3w eek s实验组Experi m ental group对照组Contro l group0.4530.1130.2430.0180.3080.0563与对照组比较P值0.053Compared w ith the con
43、tro l group,P0.05学染色可见细胞中出现棕黄色着色,为阳性染色(图6、7。对照组未见阳性染色。在骨组织工程中最终形成新生骨组织的细胞来源,存在一定争议。一种观点认为是外源性种子细胞分化而来,另一种认为是自体相关细胞分化而来。只有将植入的种子细胞与原有的自身细胞区分开来,才能进一步探讨植入种子细胞的真正作用。我们的实验尝试通过外源标记基因导入种子细胞,对其在体内转化进行追踪,以明确早期新生骨组织的细胞来源,探讨种子细胞在体内的转归。CPC 主要成分为羟基磷灰石,与骨基质中的无机成分类似,具有良好的生物相容性。实验证明CPC 植入骨缺损处后充当新骨形成的支架,发挥着骨传导的作用,内部
44、细胞长入形成新骨与未降解材料互相交织,融为一体8。但单纯CPC 与细胞亲和性差,降解慢,机械强度也有限,故将CPC 和FG 制成复合支架材料,利用FG 强大的黏合和止血功能,弥补CPC 黏结性差、抗水性能不足的缺点。同时,FG 强大的黏结作用,还能增强CPC 的机械强度。另外,利用FG 降解快的特性,以逐步提高复合支架材料的孔隙率,加速新骨长入6。但是,对于该复合支架材料而言,在应用组织工程技术构建组织工程骨的过程中,若无适当的种子细 图1Adeno -X T M -GFP 感染HEK 293细胞后出现CPE (倒置相差显微镜200图2兔M SCs 表现为长梭形的成纤维细胞样,排列呈旋涡状(倒
45、置相差显微镜200图3Adeno -X T M -GFP 感染后细胞生长旺盛,多角形细胞增多(倒置相差显微镜200图4Adeno -X T M -GFP 感染M SCs 96h后GFP 的表达(荧光显微镜100图5术后4周M asson 染色观察(100a 实验组b 对照组图6术后4周,实验组OC 免疫组织化学染色阳性(200图7术后4周,实验组 型胶原免疫组织化学染色阳性(200图8术后4周,新生骨组织中的细胞高效表达GFP (激光共聚焦显微镜100F ig .1Appearance of CPE af ter the HEK 293cells were i nfected with Ade
46、no -X T M -GFP (I nverted phase con trast m icroscope 200F ig .2The rabbit sM SCs showi ng the f ibroblast -like sp i ndled morphology and the ir array i n a wh irlpool pattern (I nverted phase con trast m icroscope 200F ig .3The rabbit sM SCs proliferati ng quickly and the cells with a cubo idal ,s
47、tellate appearance i ncreasi ng af ter the cells were i nfected by Adeno -X T M -GFP (I nverted phase con trast m icroscope 200F ig .4The GFP expression detected 96hours af ter M SCs were i nfected with Adeno -X TM-GFP (Fluorescence m icroscope 100F ig .5TheM asson sta i n i ng observation at 4weeks af ter operation (100a T he experi m ental group b T he con