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1、第十二章 DNA损伤与修复MOLECULAR BIOLOGY一、概述：突变定义及其分类1突变（mutation）：可以通过复制而遗传的DNA 结构的任何永久性改变，都叫突变。2突变体（mutant）：携带突变的生物个体，或群体或株系。3突变基因(mutant gene)：突变位点可能存在于基因内，该基因称为突变基因。4野生型基因(wild type gene)：指没有发生突变的基因。后习惯上指有机体的正性状。引发突变的原因：1突变剂：能引起突变的物理因素、化学因素。2自发突变：自然界中突变剂的作用或偶然的复制错误被保留下来引起的突变。3诱发突变：由于人们使用突变剂处理生物体而产生的突变。碱基序
2、列改变单点突变：只有一个碱基对发生改变。有以下几种：碱基替代：转换(transition)：嘌呤嘌呤或嘧啶嘧啶 AG,TC;颠换(transversion)：嘌呤嘧啶或嘧啶嘌呤A T or C T A or GG T or C C A or G 碱基插入；碱基缺失多点突变：有两个或两个以上的碱基对发生改变，包括：缺失突变;插入突变。移码突变（移框突变）：插入或缺失12个碱基，引起阅读框的改变，其结果改变蛋白质的氨基酸组成。Ser Glu Thr Met Phe ThrAGC GAG ACU AUG UUU ACG野生型：GSer Glu Asp Tyr Val TyrAGC GAG GAC U
3、AU GUU UAC G突变体：对遗传信息的改变同义突变：没有改变产物氨基酸序列的密码子的变化，与密码子的简并性有关。错义突变：碱基序列的改变引起了产物氨基酸序列的改变。致死突变：有些错义突变严重影响蛋白质活性甚至完全无活性，如果该基因是必需基因，则该突变为致死突变。渗漏突变：突变的产物仍然有部分活性，表现型介于完全的突变型和野生型之间的某种中间类型。中性突变：有些错义突变不影响或基本不影响蛋白质的活性，不表现明显的性状改变。无义突变：氨基酸的密码子变为蛋白质合成终止密码子。UAG:琥珀型(Amber,Am)UAA:赭石型(Ochre,Oc)UGA:乳石型(Opal,Opal)正向突变：背离野
4、生型的突变。回复突变：突变体失去的野生性状可以通过第二次突变恢复，这第二次突变就称为回复突变。又称为抑制突变。条件型突变条件突变体：在许可条件下细胞生长正常或近乎正常，而在非许可条件下表现出病态或死亡。温度敏感突变体，其突变一般为错义突变，改变了的蛋白质产物在许可温度下，活性正常或接近正常，而在非许可温度下无活性（可能不能形成高级结构或多亚基复合物）。三、回复突变和抑制突变 1回复突变的分类（1）真正的回复突变（原位点突变）很少单点突变：其回复突变频率一般是正向突变的十分之一。两点突变：多点突变和缺失突变，回复突变几率几乎为0。（3）抑制突变：通过第二点的突变，使第一次突变的效应被抑制，这样的
5、第二点回复突变称为抑制突变。基因内抑制：抑制突变发生在正向突变基因内；基因间抑制：抑制突变发生在其他基因之中；直接抑制突变：通过恢复或部分突变基因蛋白质的功能；间接抑制突变：通过改变其他蛋白质的性质或表达水平而补偿原来突变造成的缺陷，从而使野生表型得心恢复。错义突变的基因内抑制突变：错义突变可通过基因内的另一处突变使蛋白质功能得到恢复。移框突变的基因内抑制突变：可通过基因内第二点基因插入或基因缺失使蛋白质功能得到恢复。Ser Glu Thr Met Phe ThrAGG GAG ACU AUG UUU ACG野生型：GSer Glu Asp Tyr Val TyrAGC GAG GAC UAU
6、 GUU UAC G突变型：Ser Gly Thr Met Phe ThrAGC GGG ACU AUG UUU ACG去除ASer Glu Asp X Phe ThrAGG GAG GAC UAG UUU ACG去除U需要琥珀抑制tRNA3基因间抑制突变 正向突变的无义突变、错义突变和移框突变可被另一基因上的突变所抑制，分别称为无义抑制突变，错义抑制突变和移框抑制突变。这些突变均发生在tRNA 或与tRNA 功能有关的基因上，这些基因又叫抑制基因。UAG 抑制tRNA：琥珀型（amber）抑制突变UAA 抑制tRNA：赭石型（Ochre）抑制突变UGA 抑制tRNA：乳石型（Opal）抑制突
7、变（1）基因间无义抑制突变：4基因间间接抑制突变（1）多亚基蛋白质的亚基间；（2）生化反应的两个步骤；（3）生化反应的两种途径；（4）一个突变产生有害物质，另一种突变消除之。二、突变剂和突变组成1碱基类似物在DNA 复制时的渗入 5-溴尿嘧啶（BU）酮式A，可产生AT GC 的转换；烯醇式G，可产生GG AT 的转换。碱基类似物渗入DNA 必须经过两轮复制后才能产生稳定的可遗传的突变。2氨基嘌呤（AP，2-AP）主要产生ATGC 的转换。2DNA分子上碱基的化学修饰（1）HNO2引起氧化脱氨反应A 次黄嘌呤：CC U：AG黄嘌呤：C 不引起突变转换（2）烷基化试剂的致突变作用 常用的有：硫酸二
8、甲酯，甲磺酸乙酯(EMS),乙磺酸乙酯等。作用机制有二种：烷基化试剂可以产生转换，也可以产生颠换。电离作用去嘌呤作用3嵌合剂的致突变作用 常用的嵌合剂：吖啶橙、原黄素、吖黄素 作用机制：插入碱基中引起阅读框的改变。4转座成分的致突变作用 如果转座的位点处于一个基因内部，这种大片断的插入常常造成基因失活。5紫外线的致突变作用诱发SOS 修复系统，突变包括各种形式的转换的颠换。其他：电离辐射、X 射线、射线及丝裂霉素C、黄曲酶素B1，都能诱发SOS 反应。6突变热点：某些位点的突变的频率大大高于平均数，这些位点就称为突变热点。DNA修复 一、复制修复尿嘧啶糖基酶系统 错配修复系统 二、损伤修复 三
9、、其他损伤类型及其修复一.复制修复1.尿嘧啶糖基酶系统包括:尿嘧啶-N-糖基酶 AP内切酶 Pol I DNA 连接酶 U=A,G修复过程：1)尿嘧啶糖基酶切除U；2)AP 内切酶制造切口；3)由Pol I 和DNA 连接酶修复。2.错配修复系统 修复系统如何识别错配碱基?系统组成和修复过程。DNA的甲基化具有重要的生物学功能DNA甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，从而控制基因表达腺嘌呤(A)的第6位氨基与胞嘧啶(C)的5位碳原子上腺嘌呤的甲基化是错配修复系统的识别标志系统组成：错配矫正酶(基因mutH,mutL和mutS编码)Pol I DN
10、A 连接酶2.错配修复机制:DNA 复制,亲代链GATC 位点A 的N6 甲基化,子代链的甲基化要延迟几分钟.MutL/MutS/MutH 识别错配的碱基对和附近的GATC.DNA helicase II,SSB,exonuclease I 切除包含错配碱基对的DNA 片段DNA polymerase I&DNA ligase 填充缺口1.胸腺嘧啶二聚体的产生二.损伤修复2.胸腺嘧啶二聚体修复的生物学指征 存活曲线:用菌落的形成能力为指标,将存活的百分比与照射时间(或剂量)作曲线。光复活作用：细胞在UV 照射后，立即用可见光照射，可显著增加细胞的存活率。液体保持恢复：将紫外线照射过的细菌在黑暗
11、中置于非营养性的温暖的缓冲液中，可显著增加细菌的存活率。其实质是暗修复。3.胸腺嘧啶二聚体修复的分子生物学机制五种修复途径:1)光复活2)切除修复3)重组修复4)SOS 修复5)二聚体糖基酶修复1)光复活 光复活作用是在可见光(300600nm)的活化作用下,由光复活酶催化胸腺嘧啶二聚体分解成单体的过程。2)切除修复四个步骤：切补切封1)修复内切酶识别胸腺嘧啶二聚体，并在二聚体前的糖磷酸骨架上作一切口；2)Pol I 在3 OH 末端聚合一条新的DNA 链，同时置换掉约20个核苷酸的DNA 片段（其中包含胸腺嘧啶二聚体）；3)被置换出的片段被Pol I 的5 3 外切核酸酶和内切核酸酶切除；4
12、)DNA 连接酶封合新合成的DNA 片段和原有DNA 链间的切刻。Uvr systemUvrAB recognizes damageUvrBC nicks the DNAUvrD unwinds the marked region.根据切除的DNA 片段的长短，切除修复可分为：短补丁修复：切除片段 30 个核苷酸，占99；长补丁修复：切除片段1500核苷酸，占1%。3)重组修复实验现象：对于uvrA，平均使一个细胞死亡的紫外线照射剂量能产生300个胸腺嘧啶二聚体；recA对紫外线更敏感（右图）。重组修复机制1)二聚体后起始；2)姐妹染色体发生交换，从正常链上切下一段弥补缺失，由DNA连接酶连接
13、；3)正常链上的缺口由Pol I和DNA连接酶补齐。它允许新生的DNA链越过胸腺嘧啶二聚体而生长，其代价是保真度极大降低，是个错误潜伏的过程。SOS修复是一种旁路系统：只在细胞受损伤时才出现；丧失校对功能，错误碱基可出现在任何位置。SOS修复是紫外线诱变的主要原因。4）SOS修复紫外线照射，二聚体形成SOS 系统的诱导，错误潜伏的复制超越二聚体而进行错误碱基SOS修复导致校对功能丧失，错误碱基可出现在任何位置。SOS修复系统中的两个重要蛋白：LexA：一种阻遏蛋白，结合于SOS系统中各基因的操作子上，关闭这些基因；RecA：有3种活性重组活性；单链DNA结合活性；蛋白酶活性（活化需单链DNA，
14、只作用于少数蛋白，LexA是其中之一）RecA引发SOS修复系统：SOS基因：又称din基因(damage induced genes),是LexA控制的基因，有的基因只在DNA复制受抑制的时候才表达，有的在正常细胞中表达量低，DNA受损伤时表达量剧增。SOS boxSOS基因的操作子上LexA的结合位点，称为SOS框。20bp的保守序列。5)嘧啶二聚体糖基酶修复系统嘧啶二聚体糖基酶（具有AP内切酶活性）PolDNA连接酶4.其他损伤类型及其修复1)非标准碱基：尿嘧啶二聚体次黄嘌呤非标准碱基由糖基酶修复系统修复 DNA糖基酶有两类：i.不具有AP内切酶活性，如：尿嘧啶糖基酶；ii.具有内在的A
15、P内切酶活性，如：嘧啶二聚体糖基酶。2)碱基丢失形成原因：自发的去嘌呤作用，去嘧啶作用；体外：低pH，高温和烷基化试剂。碱基丢失的修复：两种修复方式：i.由AP内切酶修复，也称为无碱基内切酶；ii.由碱基插入酶修复：只发现嘌呤碱基插入酶，只作用于双链DNA上的AP位点，碱基供体可以是自由的嘌呤碱基，也可以是嘌呤脱氧核苷，而不能是非脱氧的嘌呤核苷。3)烷基化损伤的修复由O6甲基鸟嘌呤甲基转移酶修复。去除烷基；每个酶分子仅使用一次。4)链的断裂形成原因：1)一些化学试剂：过氧化物，巯基化合物，某些金属离子及DNAase；2)电离辐射修复机制：单链断裂：切除修复；双链断裂：很少有修复的可能。5)交联形成原因：某些抗生素（如丝裂酶素C）和某些试剂（如亚硝酸）。通过与DNA的交联，抑制肿瘤细胞的DNA复制，类似于烷化剂的作用。修复机制：切除修复。细胞在射线或化学物质作用下死亡的原因：1)DNA产生不可修复的改变；2)修复系统本身受到损伤；3)修复系统被饱和；4)修复结果引起突变。复习思考题1.那些环境因素容易损伤生物体内的DNA?损伤有那些方式和类型?结果对生物细胞会有些什么影响?2.现在所知生物细胞对DNA损伤修复有那些方式?修复反应的结果会如何?