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1、第五章 黄酮类化合物第 一 节 概述 一、根本结构与分类一根本结构；以前，黄酮类化合物主要是指具有2-苯基色原酮结构的一类化合物，现在那么指由两个苯环A环和B环通过三碳连相互联结而成的一系列化合物，即凡具有C6-C3-C6结构的化合物都有称作黄酮，因其分子中有碱性的氧原子，故又称为黄碱素。色原酮 2-苯基色原酮 C6-C3-C6二分类 1、根据C3链结合状态可将黄酮类化合物分为15个类型；1根据C3的氧化程度；有黄酮、黄酮醇，二氢黄酮和二氢黄酮醇。黄酮:木犀草素 黄苓素 榕碱 异榕碱 黄酮醇 槲皮素3-O-云香糖：芦丁 二氢黄酮 法尔杜鹃素 苦参醇A 二氢黄酮醇水飞藓素2根据B环的连接位置；假
2、设苯环连接在3-位上，为异黄酮，二氢异黄酮类。异黄酮 大豆素 7，4-二OH 葛根素 7，4-二OH，8-O-glc 大豆苷 4-OH，7-O-glc 二氢异黄酮紫檀素R=CH3高丽槐素R=H 高异黄酮3根据C3链是否成环；假设C3为开环的，称为查尔酮，二氢查尔酮类。查尔酮 二氢查尔酮红花苷无色 红花苷黄色 醌式红花苷红色4其它；花色素类 花青素母核 R=H 矢车菊素 R=OH 飞燕草素儿茶素类 -表儿茶素 +儿茶素黄烷-3-醇类 黄烷-3，4-二醇类R1=OH，R2=H 无色矢车菊素R1=R2=OH 无色飞燕草 R1=R2=H 无色天竺葵素 山酮类异芒果素 橙酮和异橙酮类 紫铆花素 硫磺菊素
3、2、双黄酮类；两分子黄酮或二氢黄酮或黄酮二氢黄酮通过CC和C-O-C醚键联接而成。15，8-双芹菜素型，为两分子黄酮通过5-位和8-位联接。R1 R2 CH3 H 银杏素 H H 白果素 H CH3 异银杏素2苯醚型；桧黄素 38，8-双芹菜素型；柏黄素 从以上分类可以看出，天然黄酮类是以C6-C3-C6为根本母体，常见的取代基；-OH，-OCH3，CH3，亚甲二氧基及萜类等。如苦参醇A；在C-8联接一个单萜结构，及一些结构较复杂的；如水飞蓟素，榕碱等。3黄酮苷类；黄酮类化合物多以苷类形式存在，由糖的种类，数量，连接位置及方式，组成各种黄酮苷类化合物。单糖类；D-葡萄糖，D-木糖，L-鼠李糖，
4、L-阿拉伯糖及D-葡萄糖醛酸等。双糖类；槐糖D-glc1-2glc,龙胆二糖D-glc1-6glc,云香糖rh1-6glc,新橙皮糖rh1-2glc等。三糖类；龙胆三糖，槐三糖等。连接位置；一般说，分子中所有-OH都有成苷的可能，但，一般常见的多在3-，6-，3，4位上。有些为双糖链苷等。碳苷C-苷；如葛根素，即葡萄糖连接在碳原子上。葛根素 牡荆素二、黄酮类化合物的生理活性略第二节 黄酮类化合物的性质与颜色反响一、性状1、黄酮类化合物多数为结晶性固体，少数苷类为无定形粉末。2、旋光性；C环C3链饱和的，如二氢黄酮，二氢黄酮醇，黄烷等，在C环上产生一个手性碳12个，二氢黄酮的C2为手性碳，二氢黄
5、酮醇的C2和C3两个手性碳，因而具有旋光性。3、颜色；黄酮，黄酮醇的颜色与分子中有无交叉共轭体系有关。一般说：1黄酮，黄酮醇及其苷类多显灰黄至黄色。2查尔酮显黄色至橙黄色。3二氢黄酮，二氢黄酮醇，异黄酮一般为无色，异黄酮显微黄色。以上颜色深浅的不同，主要取决于分子中是否存在交叉共轭体系及助色团-OH，-OCH3的数量。以黄酮来说；色原酮本无色，但在2-位引入苯基后，产生交叉共轭体系，通过电子转移，重排，使共轭链延长而显色。4花色素及其苷的颜色随PH而变化，当PH 8.5 时，显兰色。二、溶解度 与其它化合物一样，黄酮类化合物的溶解度也受其结构及结合状态不同而有很大差异，如取代基的种类，数量不同
6、，均有很大影响，一般情况下，溶解顺序为；花色素 二氢黄酮 黄酮醇1、结构影响1 立体因素：黄酮，黄酮醇，查尔酮等为平面型分子，虽然有酚-OH，但分子堆砌紧密，分子间引力大，不易水化，因而难溶于水。而二氢黄酮，查尔酮等平面型分子等，因C环饱和，取椅式型象，为为非平面型分子排列不紧密，有利于水分子进入，溶解度较大。2引入-OH即增加了极性基团，将增大水中溶解度，引入-OH越多，增加越大，假设甲基化后，相当于减少了极性基团，那么使溶解度降低，相反，却增大了在有机溶剂中的溶解度，如，川陈皮素5，6，7，8，3，4-六甲氧基，可溶于石油醚。3 花色素，溶解度较大，虽为平面型结构，但因以离子状态存在，有普
7、通盐的性质，在水中电离成 所以在水中较易溶解。2、结合状态；一般游离苷元难溶于水或不溶于水，而易溶于乙醇，乙酸乙酯，乙醚等有机溶剂及稀碱溶液中，是因为分子中的酚-OH具有酸性，可与碱成盐。但黄酮类化合物一般多具有酚-OH，具有一定的极性，所以，一般不溶于石油醚等很低极性的溶剂。苷；结合成苷后，由于极性基团糖的引入，水溶性相应增大，糖链增长，溶解度也随之增大，一般易溶于水，醇等强极性溶剂中，而在低极性溶剂，如苯，氯仿等中，溶解度很小或不溶解。但糖的结合位置对水中的溶解度也有一定的影响，4或7-O苷的溶解度就小于3-O苷，原因是结合在极性强的-OH上，将使分子少了一个较强的极性基团，例；棉黄素；C
8、5或C3-OH与C=O形成氢键，对溶解度供献不大，结合成苷后，对原-OH对溶解度影响不大，相反，假设结合在C7或C4-OH是，影响就很大，形成苷后，该-OH的原有的溶解度较大的奉献消失，所以C7-O-苷的溶解度小于C3-O-苷。三、酸碱性 一酸性 黄酮类化合物因分子中多有酚-OH，显弱酸性，可溶于碱性水溶液，吡啶等。1、酚-OH数目越多，其酸性越强。2、位置；7-OH，4-OH与C=O交叉共轭，酸性最 强。3或5-OH与C=O有氢键缔合，酸性较弱，其酸性强弱顺序为：7，4-二-OH 7或4-OH 一般酚-OH 5-OH NaCHO3 Na2CO3 NaOH二碱性氧原子的性质 C环-吡喃酮环上的
9、1-位氧原子，有末共用电子对，有微弱的碱性，可与强酸形成 羊盐，该 羊盐极不稳定，加水即时分解，且生成的 羊盐常带有特殊颜色，可用于鉴别。如；四、显色反响 一复原试验 1、HCl-Mg反响盐酸-镁粉反响；是鉴别黄酮类化合物的常用方法，多数黄酮，黄酮醇，二氢黄酮，二氢黄酮醇显橙红兰色，一般说，-OH多，或B环上有-OH，OCH3+颜色加深。实际工作中，要注意的是，反响阴性时，即可证实没有黄酮类，但阳性时也不能绝对确定含有黄酮，尤其有花色素，在酸性条件下，显红色，干扰反响，应先作对照，即取样品溶液，先酸化浓盐酸观察。2、NaBH4反响 与二氢黄酮类反响生成红-橙色，其它无此反响，可用作二氢黄酮的鉴
10、别反响。假设-OH，-OCH3数目增加，颜色加深。操作：取样品1-2mg溶于甲醇，加NaBH4 10mg，然后加1%HCl，呈红紫色，可在纸上进行。此外，尚有一些反响，也常有于黄酮类鉴定反响，如盐酸锌粉反响等。二金属盐试剂络合反响 黄酮类化合物中含有氧原子，如：-OH，C=O，具有末共用电子对，可与具有空轨道的金属离子发生络合反响，但要形成较稳定的络合物，需要这些含氧基团有适当位置，具有以下结构的；可与金属盐类产生有色络合物，常用的金属盐类有铝盐，铅盐，镁盐等。1、铝盐 铝盐可与具有上述结构的黄酮产生络合物，显黄色，紫外灯下显荧光，一般用1%AlCl3溶液。2、铅盐 常用的有醋酸铅Pb(Ac)
11、2和碱式醋酸铅 Pb(OH)(Ac)，1%浓度，与黄酮类反响产生黄-红色沉淀。Pb(Ac)2；与含上述结构即邻-二酚-OH，C5-OH或C3-OH的化合物反响，即生成沉淀。Pb()H)(Ac);沉淀范围更广，除上述结构外，含一般酚-OH者都能与之沉淀，此性质可用于鉴定，甚至可用于别离纯化。可以说；与Pb(Ac)2产生沉淀，就可能含有上述结构，反之那么无。假设与Pb(OH)(Ac)沉淀，而不与Pb(Ac)2可能不含上述结构，而含有一般酚-OH。例：豆科植物葛根，所含异黄酮，因C3被苯取代，因此，不含C3-OH，也不含上述结构，那么不与中性醋酸铅沉淀，利用这下性质，可于别离精制。即先于提取液中加中
12、性醋酸铅，沉淀杂质，再用碱性醋酸铅沉淀异黄酮，然后，脱铅后即得到较纯的化合物。3、锆盐，2%甲醇溶液，与具有上述前两种结构者，即C5-OH，或C3-OH的黄酮类，产生有色络合物。由于C5-OH和C3-OH位置不同，所形成的络合物稳定性也不同，C3-OH C5-OH，二氢黄酮醇除外，因其C3-OH为醇-OH，当于反响液中参加枸缘酸后，由C5-OH形成的络合物分解，颜色退去，而C3-OH不退色，由此可区别C3-OH和C5-OH黄酮类。反响可在纸上进行，络合物一般呈黄绿色，并有荧光。4、镁盐；主要用于区别二氢黄酮及二氢 黄酮醇与黄酮，黄酮醇。二氢黄酮及二氢黄酮醇，显天兰色荧光。黄酮，黄酮醇和异黄酮显
13、黄，橙黄，褐色。此反响常在纸上进行。5、氯化锶反响；主要与具有邻二酚-OH结构的黄酮类反响，与具有邻二酚-OH的黄酮类化合物产生绿色棕色黑色沉淀。6、三氯化铁反响FeCl3；不是黄酮类特有反响，三氯化铁与含酚-OH的化合物，均有颜色反响。黄酮类化合物多含酚-OH，显色，不能用为鉴别。三硼酸显色反响 硼酸只与含有 结构的黄酮类反响，产生亮黄色，显然，只有C5-OH或者2-OH查尔酮可有反响，作为该两类成份的的鉴别有价值，与其它类区别。一般:枸缘酸丙酮存在下，只显黄色，无荧光。草酸存在下，黄色带有绿色荧光。四、碱性试剂显色反响1、二氢黄酮类在碱性条件下开环生成查尔酮，即呈棕色-黄色。2、黄酮醇类在
14、碱性下，先呈黄色，通入空气后，显棕色。3、分子中有邻二酚-OH或3，4-二OH时，碱性条件下不稳定，很快被氧化，由黄色变深红，再转成绿棕色。第 三 节 黄酮类化合物的提取别离一、提取 在植物的花，叶，果，树皮等组织中，黄酮类一般以苷类形式存在，而在木质部那么多以苷元形式存在。因此在提取时，要根据原料情况及提取目标，选择适当溶剂，才能获得满意的结果。1、苷类及极性大的苷元提取，一般常选用丙酮，乙醇，甲醇，乙酸乙酯，水。最常用的是醇或醇水。方法；可用温浸，回流，水煎煮。对于多糖苷，那么可用沸水提取，为防止酶水解，一般应先破坏酶，花色素在植物中一般是以盐的形式存在，提取时，先加少量的酸，如1%HCl
15、，使花色素游离出来，再用水提取。对于含脂肪较多的原料，也可先用石油醚脱脂，除去杂质。甲醇，乙醇穿透力强，提取效果好，但甲醇有毒，所以习惯上，常用乙醇提取，如以下流程。乙醇提取物 石油醚除杂质 乙醚提取苷元 乙酸乙酯提取苷。2、苷元的提取；常用氯仿、乙醚、苯、乙酸乙酯作溶剂。总之，提取方法多种多样，实际工作中，应根据具体情况，设计合理的方法。一溶剂萃取法 一般是提取液先用石油醚，氯仿，乙酸乙酯，丁醇顺次萃取；提取液 石油醚萃取石油醚层 水层油脂，叶绿素 氯仿萃取 氯仿层 水层 含苷元 乙酸乙酯萃取 水层 乙酸乙酯层 含苷 对于水提取物，含杂质较多，萃取时易乳化，可先用几倍量的乙醇沉淀杂质，主要是
16、蛋白质，多糖等，回收乙醇后，加适当水，再按上述方法萃取，对于一些含量高的黄酮类，往往通过上述萃取，即可得到较纯的黄酮类化合物。二 黄酮类化合物由于分子中多含有酚-OH，显弱酸性，可溶于碱液中，但难溶于酸水中，故可以用碱提取，酸沉淀法。当于碱提取液中参加酸时，黄酮类即可析出沉淀，但要注意的是；碱性过强会使黄酮破坏。一般多项选择用氢氧化钙Ca(OH)2法，其优点是；1 碱性中等，较适合。2可与多糖，粘液质，树胶等产生沉淀，到达除去杂质的目的。如芦丁的提取：槐花米 水煎煮Ca(OH)2调PH89，趁热过滤 提取液 60-70，调PH=5 水溶液 沉淀 水洗，60枯燥 粗芦丁 水重结晶 芦丁纯品 注意
17、：1碱性不宜过强，尤其在加热时易破坏黄酮。2酸沉淀时，酸性不宜过强，否那么，黄酮形成 羊盐而损失。3用Ca(OH)2,可沉淀杂质，有利于纯化。三活性炭主要用于苷类的精制。分两步：1、吸附，通常是在甲醇提取液中，分次参加活性炭，不断搅拌下，加至提取液不再显黄酮反响为止。2、洗脱；己吸附黄酮的活性炭，依次用沸甲醇。沸水，7%酚水，15%酚水洗脱，对各局部进行定性检查，对含黄酮的局部，除去醇或酚，水溶液浓缩，即可得到较纯的黄酮。通过上述方法，虽有时可获得局部较纯的黄酮，但多数情况睛，大多数黄酮仅靠上述方法尚不能得到有较别离，要想更好地别离提取物中的黄酮，尚需进一步别离。二、别离 别离的主要依据：1、
18、极性大小不同；选用吸附层析或分配层析，极性大的用分配层析，极性小的用吸附层析。如极性大的用氧化铝，吸附太强，不易洗脱。2、根据酸性不同，可采用PH梯度法。3、分子大小不同，用葡聚糖凝胶进行别离。分子中功能基团不同，利用与金属盐络合能力不同的特点进行别离。较常用的方法：一柱层析法，常用于别离黄酮类化合物的吸附剂，主要有硅胶，聚酰胺和纤维素，此外也有用氧化铝，氧化镁及硅燥土等。1、硅胶柱层析 是应用最广泛的吸附剂之一，对别离黄酮类化合物来说，主要用于异黄酮，二氢黄酮和二氢黄酮醇及一些极性较小的黄酮类，如高度甲基化的黄酮。对于少数极性较大的黄酮类，有时那么需要加水去活化。硅胶加水后，那么有分配和吸附
19、两种性质。2、聚酰胺柱层析 取酰胺对别离黄酮类化合物，是一种较为理想的吸附剂。与纤维素粉相比，其具有吸附容量大，分辨能力强的特点。其吸附主要是通过聚酰胺中的C=O与黄酮分子中的酚-OH及氨基与黄酮中的C=O形成氢键而吸附的，其吸附强弱取决于：1黄酮类与聚酰胺形成氢键的能力大不同，如分子中的酚-OH的数目，位置等。2洗脱剂与聚酰胺或洗脱剂与黄酮类形成氢键的能力越强，洗脱力越大。如水和甲醇，二者中甲醇与聚酰胺形成氢键盘的能力比水强，洗脱力就大于水。黄酮类在聚酰胺层析中有以下几个规律性：苷元相同，三糖苷 双糖苷 单糖苷 苷元 母核上酚-OH增加，洗脱力相应减慢。无酚-OH 一个酚-OH 二个酚-OH
20、 三个酚-OH.酚-OH数目相同，其位置不同不有影响。由于分子内 氢键形成，如5-OH，3-OH，邻二-OH。所以，洗脱力 为邻二酚-OH 对二酚-OH。不同类型的黄酮，先后洗脱顺序为：异黄酮 二氢黄酮 黄酮 黄酮醇 分子中芳核，共轭双键多的吸附力强，如查尔酮，难洗脱。3、葡聚糖凝胶；sephadex G和HL-20型。葡聚糖凝胶别离黄酮类主要有两种形式：1分子筛；以分子量大小来别离，主要别离黄酮苷，分子量越大，洗脱速度越快。以Ve为总洗脱体积，Vo为空柱体积，那么Ve/Vo值可以说明化合物的洗脱能力。2别离苷元，主要靠吸附作用，一般说，游离酚-OH多，吸附力强，Ve/Vo 大，洗脱难。二)梯
21、度PH萃取法 主要根据黄酮分子中的酚-OH数目和位置不同，其酸性也不同的性质，可用碱性溶剂萃取，到达别离目的。不同PH溶液中，用有机溶剂萃取。从有机溶剂中，用不同PH溶液萃取。一般情况下，7-OH和4-OH酸性较强，当分子中同时存在时，用NaHCO3萃取。当分子中只有7-OH或4-OH时，用N a2CO3萃取，其它酚-OH需要用不同浓度NaOH溶液萃取。三根据分子中某些特殊官能团进 行别离 黄酮类化合物用于别离作用的官能团，主要是分子中的邻二酚-OH与PbAc2产生沉淀，与不具该结构的别离。铅盐的用途一是除杂质，也是别离精制中常用的。实际别离中，硼酸也一种常用试剂。具有邻二酚-OH的黄酮与硼酸
22、形成的络合物易溶于水，借此可与其它成份别离。实例1：从柠檬果皮中别离降压有效成份：柠檬果皮2400g 搅碎成匀浆，热水提取 滤液 浓缩至小体积，加三倍量乙醇,静止 过夜，过滤，滤液浓缩，冷冻枯燥 水提取物183g，取179 g，用500ml水溶解，过滤 滤液 滤液 依次用Hexane,n-BuOH提取Hexane提取物 n-BuOH38.5g 水溶性部份36g 溶于1500mlg)加220gPb(OH)(Ac)饱和溶液 黄色铅盐沉淀 加20gNaHCO3饱和水溶，搅拌1小时，静止，过滤 滤液 滤液 6mol/L HCl调PH5.3,n-BuOH提取，500ml5 水层 n-BuOH提取物 凝胶
23、过滤 Fr A-H Fr I-P Fr O-K(PH5酸水)PH7水洗部份 PH9碱水洗脱部份 洗脱部份)各部份分别进行反复硅胶 柱层析，化合物L-1 L11第 四 节 黄酮类化合物的检识与结构测定 黄酮类化合物的检识与结构测定常用的方法有：1、化学法；定性，测定理化常数，化学降解，化学相关。2、层析法，薄层，常用硅胶，纸层，聚酰胺薄膜。3、光谱法；质谱；分子式测定，及主要碎片可提供结构信息。UV光谱；通过测定其甲醇中的UV光谱及各种诊断试剂。IR光谱；提供一些起官能团信息。NMR光谱；1H-NMR，13C-NMR，2D-NMR。4、文献对照；己知化合物可对照标准光谱或文献数据。未知化合物要通
24、过与文献相关化合物对照，常可得出正确的结构信息。对于一些结构复杂的化合物，往往还需要进行化学降解，化学相关等方法，如苷类的水解，乙酰化，甲基化等。必要时还需进行化学全合成。一、层析法在黄酮类化合物结构测定中的应用一纸层析 纸层析广泛应用于天然产物的别离鉴定中，同样也适用于别离和鉴定各种黄酮类及其苷。对于混合物来说，常用双向层析法。展开剂1、溶剂选择；对于别离黄酮类来说，所用溶剂大致可分为两大类。1醇性溶剂：常用：n-BuOH-HOAc-H2O(4:1:5上层)，BAW，t-BuOH-Hac-H2O(3:1:1),TBA,水饱和的n-BuOH。2水性溶剂：常用，水，26%HAc，3%NaCl,H
25、Ac-HCl-H2O(30:3:10)等。双向层析时可先用醇性溶剂展开，再用水性溶剂展开。对于苷元来说，一般选用醇性溶剂，或极性更低的溶剂。如苯-HAc-H2O125：72：3等。花色苷或苷元；多以盐的形式存在，可用含HCl或HAc的溶剂展开。2、显色：黄酮类多具有颜色，直接观察斑点。荧光，在紫外灯下观察。对一些颜色或荧光都较弱的，那么需要显色，常用的显色剂有5%FeCl3乙醇溶液，2%AlCl3甲醇溶，1%FeCl3-1%K3Fe_(CH)6 3水溶液等。以氨处理后也常发生颜色变化。3、纸层析PPC时，Rf值与结构的关系：1不同类型的苷元：平面型分子，黄酮，黄酮醇，查尔酮等，用水性溶剂展开如
26、3-5%HAc，Rf值 单糖苷 双糖苷。在用水性溶剂展开时，与醇性溶剂相反，苷元几乎在原点，苷的Rf值那么大于0.5，并随糖链增加而加大。另外糖结合的位置也有影响。二薄层析TLC；吸附薄层；常用的吸附剂为硅胶，其次为纤维素。1、吸附薄层：硅胶G，或CMC-Na作粘合剂 常用的溶剂：甲苯-甲酸甲酯-甲酸5：4：1，根据别离情况，还可以调整甲苯、甲酸的比例，还有苯-甲醇95：5等溶剂。别离苷元的甲醚等衍生物等中性成份，展开剂的极性可进一步降低，如苯：丙酮9：1等。2、聚酰胺薄层，适用范围较广，由于氢健形成，吸附力增大，故要加大洗脱剂的极性。实际中，根据具体情况，通常选择不同浓度的乙醇，如：乙醇：水
27、3：2，水饱和的n-BuOH-HAc100：1、100：2等。以上所讲的溶剂系统多为一些经验，只能参考，在具体工作中，还要视具体情况而定。二、紫外光谱在黄酮类化合物结 构测定中的应用 一般程序如下：1、测定样品在甲醇溶液中的紫外光谱。2、于样品溶液中参加各种诊断试剂，测定其 UV光 谱，常 用 的 诊 治 断 试 剂 有NaOMe,NaOAc,醋 酸 钠/硼 酸，AlCl3和AlCl3/HCl等。3、苷类样品，那么可进行水解，或甲基化后水解再测苷元或衍生物的UV光谱。一黄酮类化合物在甲醇溶液中 的UV光谱苯甲酰局部 黄酮R=H 肉桂酰局部带II；220-280nm 黄酮醇R=OH 带I；300
28、-400nm 1、黄酮与黄酮醇 两者图形相近，但带I位置不同，带I：黄酮类：304-350nm,黄酮醇：352-385nm3-OH游离 328-3573-OH取代。带I受母核上所有含氧基团影响，母核上含氧基团数目增多，带I向红移，尤其4位引入-OH，红移更大些。见下表；化合物 maxHOMe 带I 3,5,7-三羟基黄酮高良姜素 350 3,5,7，4-；四羟基黄酮山奈酚 367 3,5,7，3，4-五羟基黄酮 370 3,5,7，3，4，5-六羟基黄酮 374 带II；主要受A环氧取代影响，B环影响很小，但影响其峰形，当B环仅有4-OH时，带II呈单峰，当B环上有3，4-二OH时，带II呈双
29、峰，可根所带II的峰形初步推测B环上取代情况。化合物 带II maxHOMe 7-羟基黄酮 250 5-羟基黄酮 252 5-羟基黄酮及5，7-二羟基黄酮 262 5,6，7-三羟基黄酮 274 5,7，8-三羟基黄酮 281 甲基化和苷化后，相应的吸收带将紫移，尤其带I。乙酰化后，原-OH对光谱的影响消失，以此可以判断-OCH3取代位置，例：某黄酮具有5，7-二羟基，另有一-OCH3位置末确定，可先将其乙酰化，与己知光谱的比较，假设与己知-OCH3在4位的光谱一致，那么可确定该 OCH3在4位。2、查尔酮和橙酮：共同特征；带I很 强，为主峰，带II很弱，为次强峰。图：查 尔 酮：带 I；34
30、0390nm，带 II；220270nm.有时分裂成I a;340-390nm，Ib;300320nm。引入氧取代基，同样带I红移，其中2-OH影响最大，当2-OH甲基化时，带I紫移1520nm，其它的影响不大。但6，7-二OH中的7-OH除外，假设该7-OH取代时，将紫移18nm，3、异黄酮，二氢黄酮及二氢黄酮醇类由于B环桂皮酰共轭系统消失，带I很弱，图其主要吸收带为苯甲酰系统引起的吸收峰，带II，而带I常在主峰的一侧呈一肩峰，图。主峰位置：异黄酮：245270nm，二氢黄酮和二氢黄酮醇；270295，区别二参加诊断试剂引起的位移在结构测定中的意义1、参加甲醇钠引起的位移1黄酮及黄酮醇类 参
31、加甲醇钠强碱，黄酮分子中所有-OH均可游离，将引起相应的吸收带大幅度红移。4-OH，带I红移4060nm,3-OH,带I红移5060nm,7-OH游离，在320330nm之间有吸收。存在对碱敏感系统时3，4-二-OH，3，3，4-三OH,5,6,7-三-OH，5，7，8-三OH，3，4，5-三-OH等，吸收带将随处理时间处长而衰退。2异黄酮类，二氢黄酮，二氢 黄酮醇类 主峰不红移，示A环上无-OH取代。5，7-二OH，主峰恒定地向红移35 40nm。对碱敏感系统同上。一些二氢黄类，在甲醇钠碱性下，转变成查尔酮，带I移至400nm处。3查尔酮和橙酮 查尔酮：带I：红移60100nm，强度相应加强
32、，示有4-OH。红移60100nm强度不增加，示有2-OH或4-OH。无4-OH。红移4050nm，示有2-OH，或4-OR。使由4-OH引起的红移减少 橙酮：带I；红移8095nm，强度增加，示有4-OH。红移6070nm，示有6-OH假设分中同时存在6，4-二OH，或6-OH，4-OH红移还要小。2、醋酸钠：弱碱，只能使7-OH游离，而引起带II红移520nm，带I在长波一测有一肩峰，示4-OH，但无3-，及/或7-OH。1黄酮及黄酮醇 7-OH游离，带II红移520nm假设同时有6，或8-O取代时，那么上述红移幅度降低。4-OH，如有7-OH被取代，那么其带I红移比在NaOMe中稍大，或
33、相同。碱敏感系统存在时，吸收带将随处理时间处长而衰退。2异黄酮，二氢黄酮，二氢 黄酮醇 7-OH游，主峰红移620nm7-OH异黄酮。红移35 nm5，7-二-OH二氢黄酮，二氢黄酮醇3查尔酮和橙酮 4-OH及/或4-OH查尔酮和4-OH及或6-OH时，带I红移或在长波方向显一肩峰。3、醋酸钠-硼酸；分子中有邻二酚-OH时，在碱性条件下，与硼酸形成螯合物，引起吸收带红移。A环或B环有邻二酚-OH，将引起相应的吸收带红移。1黄酮 及黄酮醇类带I红移1230nm示B环有邻二酚-OH。带II红移510nm示B环有邻二酚-OH。不包括5，6-位2异黄酮，二氢黄酮，二氢黄酮醇A环有邻二酚-OH，主峰红移
34、1015nm。3橙酮和查尔酮 B环上有邻二酚-OH，主峰红移836nm，A环有邻二酚-OH影响较小。4、AlCl3及AlCl3/HCl：分子中有邻二酚-OH；3-OH，4 C=O，或5-OH，4 C=O时，可与AlCl3络合，引起吸收带红移。不同-OH形成的络合物稳定性也不同，顺序如下：3-OH 5-OH 5-OH二氢黄酮 邻二酚-OH 3-OH二氢黄酮由此顺序可以看出，邻二酚-OH和二氢黄酮醇3-OH形成的络合物很不稳定，加少量HCl即可分解，那么由其产生的位移消失。络合物形成，假设分子中同时存在3-OH，4 C=O和5-OH，4C=O时，那么优先形成3-OH，4C=O络合物。以上性质在Al
35、Cl3及AlCl3/HCl中的UV光谱将有如下规律：1有5-OH，无游离3-OH时，带I红移3355nm。2有3-OH，或同时还有5-OH时，带I红移5060nm。3B环上有邻二酚-OH时，带I在AlCl3中要比在AlCl3/HCl中红移3040nm，假设A，B环上同时有邻二酚-OH时，这种位移将增加2025nm。上述所述为一经验规律，在黄酮类药合物结构测定中相当有用。三、1H-NMR光谱在黄酮类化合物 结构测定中的核磁共振氢谱，在鉴定黄酮类化合物结构中，是一种重要方法。是一种不可缺少的方法，过去由于受到溶剂等因素限制，使其应用范围受到限制。近年来，核磁共振技术开展极为迅速，如600兆超导核磁
36、共振仪，所用样品越来越小，使这一技术变得越来直重要。测定核磁共振光谱，所用的溶剂需是氘代试剂，如氘代氯仿，重水，氘代甲醇等。氘代试剂很贵，有时也将黄酮类作成三甲基硅醚衍生物，有如下优点：1、可溶于CCl4中，而不需要昂贵的氘代试剂。2、无干扰信号。3、容易回收用含水甲醇处理。4、可帮助了解C-3，C-6，C-8位的取代情况。5、容易转化成甲醚衍生物。黄酮化合物的质子，可分成A环质子，B环质子，C环质子三个局部，各局部质子信号特征不同，那么可以通过各质子信号的化学位移，偶合常数，归属各质子，进而做出结构推测。一A环质子，常见有以下几种情况。1、5，7-二OH取代 有两个质子，H-6和H-8，这两
37、个质子处于C=O的间位，受其去屏蔽影响较小，而且位于两个-OH的邻位，由-OH共电效应产生的屏蔽效应使这两个质子处于较高场，一般在5.76.9之间，并且一般H-6总是比H-8位于高场。当7-OHppm。2、7-OH黄酮类A环上有三个质子，H-5，H-6，H-8。5-H因处于C=O邻位，受其强的去屏蔽效应影响，位于较低场，因与6-H邻位偶合，(=8ppm左右，双峰，J=Ca 9Hz)。6-H,8-H位于C=O的间位，影响较小，且在-OH邻位供电处于较高场，此二个质子容易区别，H-6因同时与H-5，H-8偶合，为dd峰，J=Ca 2.5，8Hz，H-8仅与H-6偶合为d 峰，Ca2.5 Hz，所以
38、不难看出。四环质子。常见有以下情况：1、4-氧取代从结构上看出，化学环境相同的两组质子为2，6和3，5。相互邻位偶合为双重峰。2，6-H受C环吸电效应，去屏蔽，处于较低场，ppm，3，5-H受4-OR屏蔽供电，处于较高场，6.57.1ppm。2、3，4-二氧取代有2，5，6-位三个质子，也很容易区分。2，6位 质 子 信 号 位 于 较 低 场，7.27.9ppm，5-H位于较高场，d峰，6.77.1ppm，Ca8.0Hz。2-H较高场，6-H较高场，dd 峰，J=8.0,2.5Hz。2和6-H两个信号有时重叠，不好分辨。但假设C环饱和，为二氢黄酮或二氢黄酮醇时那么C环C=O吸电效应减弱，对B
39、环的影响降低，那么这三个质子的化学位移较接近，常出现两组复杂的多重峰。3、3，4，5-三氧取代：只有2，6位两个质子，当3，5位的R相同时，两个质子的化学环境相同，为一个单峰，6.57.5ppm，假设不同时，为两组双重峰，间位偶合，J=Ca2.0Hz。三 C环质子 C环上只有C-3位一个质子，黄酮醇类C-3位为-OH取代无质子。1、黄酮类，3-Hppm处，与此区间的其它芳质子易混，但A环上的芳质子常受其它基团远程偶合，信号变宽，峰强变小。可与3-H区别。2、异黄酮类 苯环取代在3-位上，2-H位于C=O的-位，受C=O强的吸电子影响，出现在低场7.67.8,亦因不受其它 质子干扰，为一单峰。3
40、、二氢黄酮 有三个质，2-H，3-2H，为饱和碳上质子，信号出现在较高场，C-2与氧相连，左右，C3-H位于C=O的-位，附近。因C-2为手性碳，那么C-3上的两个质子化学不等价，分别与H-2偶合，使H-2信号裂分为dd峰，J值分别为：反式者，J=11Hz，顺式者，J=Ca5Hz。C-3上的两个质子，中心位于2.8ppm，除相互偶合，J=17Hz，以分别与2-H偶合，反式者，J=11Hz，顺式者，J=Ca5Hz，同样也分别以dd峰出现。4、二氢黄酮醇 有C-2和C-3上两个质子，天然黄酮的这两个质子互成反式的竖键系统，分 别 为 d峰，J值 约 为 11Hz，H-2，4.9ppm，H-3；4.
41、3ppm。C3-OH成苷后，那么该两个信号均向低场位移5、查尔酮和橙酮 查尔酮中，在C=O的，位上两个质子，为反式双键上，受C=O影响，-H比-H处于较高 场，分 别 为-H 6.77.4ppm,-H 7.3-7.7ppm。橙酮；就一个苄基质子，为一单峰，位于处。四糖上质子1、端基质子；1H-NMR中，糖上最重要的信号就是端基质子信号，该信号一般出现在5.0左右，很容易识别，该信号可提供糖基的连接位置，端基构型等重要信息，由J值可知其端基构型，见下表；黄酮苷类糖上端基质子信号 化合物 糖上H-1 黄酮醇3-O-黄酮类7-O-葡萄糖苷 黄酮类4-O-黄酮类5-O-葡萄糖苷 黄酮类6-O-葡萄糖苷
42、 黄酮醇3-O-二氢黄酮醇3-O-二氢黄酮醇3-O-2、从表中可以看出；1 C3-糖苷很容易与其它苷区别。2 3-O-glc与3-O-rh也好区别。3但二氢黄酮醇的3-O-glc与3-O-rh不易区别。但由于鼠李糖的C-6位是CH3，一般多以 d峰出现在 0.8-1.2ppm。因此也很容易区别。3、通过34ppm之间的质子数，可推断是五碳糖还是六碳糖。4、双糖苷 双糖苷中，对于糖的种类不难判断，如薄层，纸层就可以解决，重要的是联接顺序和位置确实定。以葡萄糖和鼠李糖，其中鼠李糖连在葡萄糖 的6-位和2-位，其端基的化学位移不同，例如：芦丁的糖基和新橙皮的糖基：化合物 H-1 ppm H-6(pp
43、m)芦丁糖基(glc6-1Rh)4.2-4.4,d,J=2Hz 0.7-10(重峰)新橙皮糖基(glc2-1Rh)4.9-5.0,d,J=2Hz 1.1-1.3,d 还可通过碳谱，质谱亦可。且效果更好。五6-及8-CH3质子 黄酮母核上的甲基质子，其化学位移一般在2.0-2.6ppm 之间，而6-CH3信号恒定地比8-CH3ppm，乙酰基上的甲基质子，当酰基取代在酚-OH上，该甲基信号也在上述范围，应注意区别。乙酰基假设取代在醇-OH上，其CH3信号一般在ppm。六 甲氧基信号 该信号很简单，以单峰出现在 3.54.1ppm，极易识别。四、13C-NMR在黄酮类结构测定中的应用 13C-NMR
44、是测定化合物的骨架的强有力的工具，在一张碳谱中，每一个碳都产生一个信号。常用的有以下几种技术：1、噪声去偶谱：每一个单峰信号，即为一个碳，但不能给出每一个碳的结合状态，即碳结合质子的个数，很难确定各碳信号归属，一般通过以下几种方法，可以测出种碳信号是由那一类碳引起的。2、偏共振去偶谱。3、DEPT谱。4、INEPT谱。确定各信号碳的类型后，就可以通过与己知化物比较，根据各类取代基的位移效应，以推测结构。一骨架类型的判断二 取代图式确实定 同氢谱一样，13CNMR谱中，当黄酮母核上有取代基时，将引起相应的碳即邻近碳信号发生位移，通过比较取代前后的值，可以判断取代基的位置。1、取代基的影响 当引入
45、取代基时，将引起邻近碳化学环境发持变化，使其13C信号发生变化，对黄酮类化合物来讲，常见的取代基主要是-OH和-OCH3。-OH和-OCH3由于氧的电负性，吸电子效应，使直接与其连接的碳原子的13C信号向低场有较大范围的位移，25-32ppm.对邻，对位影响，-OH，-OCH3中的氧以其共轭效应为主，向环内供电，导致邻、对位碳信号向高场位移，7-14ppm.对间位影响较小，总的是向低场位移，约1.0-2.0ppm。根据大量实验数据，总结出这两个取代基对13C-NMR影响的规律。见下表：C5-OH：由于 与4-C=O形成氢键，与其它羟基取代产生的效应不同，除上述效应外，还将导至C-4和C-2信号
46、向低场位移，4.5，0.8，C-3信号高移1.99。相反破坏这种氢键，C-4，C-2信号将向高场位移。而C-3信号向低场位。比较以下几个化合物：X Zi Zo Zm ZpOCH3 黄酮 芫花素 槲皮素 芹菜素2、5，7-二羟基黄酮中的C-6、C-8信号 在这一类化合物中，C-6、C-8信号一般在90-100ppm之间，其它信号均处于低场，因此，这两个信号最好分辨。这两个信号的区别是；C-6总是比C-8处于高场。另外，该两个碳处于间位，相互间的取代基影响不大，即无论C-6上的-OH、CH3，glc取代，只引起C-6信号位移，而对C-8影响不大。同样，C-8上的取代基对C-6影响也不大。三糖苷中糖
47、的联接位置 一般讲，任何化合物苷元当成苷后，其成苷的碳原子及其邻近碳的13C信号将发生位移，称为苷化位移。这种苷化位移对确定糖的联接位置极为有用，但对不同类型化合物，其苷化位移又有一点区别，对黄酮类化合物来说，其成苷的酚-OH位置不同，其苷化位移也不同，根据这些位移，可以确定糖的联接位置。1、糖的苷化位移 糖成苷后，其端基13C信号将发生变化：连接在酚-OH上，端基13C信号将向低场位移4-6ppm。一般酚苷中糖的端基信在89-100ppm。该信号位移特征不很强，并与C-6、C-8等信号混在一起，不易区别。所以，需要一些特殊手段，双照射法加以区别，也可与文献对照区别。由于上述因素，利用端基苷化
48、位移来确定糖的联接位置，还不是一个很有效的方法，测定糖的连接位置，主要是以苷元的苷化位移，根据苷元的苷化位移，可以较方便确实定糖的连接位置。2、苷元的苷化位移规律 对黄酮类化合物，酚苷，成苷后，成苷碳原子的13C信号将向高场位移13ppm。ppm。C3-OH、C5-OH因与4-C=O形成氢键，苷化后，氢键消换，从交叉共轭可以看出，将对C-7、C-2及B环都有影响。四、双糖苷及低聚糖中苷键及糖的连接顺序 苷元与糖连接位置如上述，糖与糖之间的情况如下：以双糖苷为例：糖上-OH与另一糖的端基结合成苷后，其直接相连的碳信号将向低场位移5-10ppm。与相应的糖的13C谱比较，不难确定糖的联接位置。比方
49、：葡萄糖的C-6信号在66ppm左右，t峰，成苷后，将移至72ppm左右。五、质谱在黄酮类化合物结构测 定中的应用 质谱在复核、确定黄酮类化合物结构，尤其在样品量很少时，更显得重要，一般常用技术有以下三种：EIMS，FDMS，FABMS。多数黄酮类化合物在EIMS中都有较强的分子离子峰M+，对其苷来讲，其苷键在质谱中的电子轰击下，极易断裂，往往看不到M+，只能看到苷元的碎片峰。为解决这一问题，往往通过做成三甲基硅烷衍生物等方法，但近年来，质谱技术不断开展，FDMS、FABMS等的出现，使这一问题得到了解决。使苷类化合物在MS中也能得到清楚的分子离子峰M+。一EIMS 在EIMS中，黄酮类苷元，
50、除分子离子峰外，也常出现M-1峰M-H，如为甲基化物，那么有M-15M-HC3等。更重要的裂解，由以下裂解得到的碎片，在结构鉴定上很有意义。1、RDA裂解途径I 2、途径II 1、黄酮类根本裂解：M-28+。途径I+H转移 途径I 以黄酮及黄酮醇为例：和/或 上述裂解除过程中，M+一般都很强，往往为基峰，但M-28和A1和B1也很突出。由上述图式看出：A1+来自A环，B1+来自B环，由此通过A1和B1的质量，可以推算出A环和B环的取代情况，但不能确定取代位置。化合物 A1+B1+黄酮 120 102 5，7-二羟基黄酮 152 102 5，7，4-三羟基 152 118 5，7-二羟基，4-甲