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1、第五章第五章 免疫生物传感器免疫生物传感器5.1 概述1第二章第二章 免疫生物传感器免疫生物传感器5.1 概述免疫学经历了四个迅速发展阶段免疫学经历了四个迅速发展阶段n18761876年后，多种病原菌被发现，用已灭活及减毒的病原体年后，多种病原菌被发现，用已灭活及减毒的病原体制成疫苗，预防多种传染病，使疫苗得以广泛发展和使用。制成疫苗，预防多种传染病，使疫苗得以广泛发展和使用。n19001900年前后，抗原与抗体的发现，揭示出年前后，抗原与抗体的发现，揭示出“抗原诱导特异抗原诱导特异抗体产生抗体产生”这一免疫学的根本问题，促进了免疫化学的发这一免疫学的根本问题，促进了免疫化学的发展及抗体的临床
2、应用。展及抗体的临床应用。2第二章第二章 免疫生物传感器免疫生物传感器5.1 概述免疫学经历了四个迅速发展阶段免疫学经历了四个迅速发展阶段n19571957年后，细胞免疫学的兴起，人们理解到特异免疫是年后，细胞免疫学的兴起，人们理解到特异免疫是T T、B B淋巴细胞对抗原刺激所进行的主动免疫应答过程的结淋巴细胞对抗原刺激所进行的主动免疫应答过程的结果，理解到细胞免疫和体液免疫的不同效应与协同功能。果，理解到细胞免疫和体液免疫的不同效应与协同功能。n19771977年后，分子免疫学的发展，人们从分子水平理解抗年后，分子免疫学的发展，人们从分子水平理解抗原刺激与淋巴细胞应答类型的内在联系与机制。原
3、刺激与淋巴细胞应答类型的内在联系与机制。35.1 概述我国我国1111世纪开始接种人痘苗。世纪开始接种人痘苗。1818世纪后叶，世纪后叶，Jenner Jenner发明牛痘苗。发明牛痘苗。45.2 免疫学反应基础1.1.抗原抗原 定义定义:能够刺激机体产生免疫反应的物质能够刺激机体产生免疫反应的物质1 1）免疫原性）免疫原性 2 2）免疫反应性）免疫反应性 种类：种类：1 1）天然抗原）天然抗原 2 2）人工抗原）人工抗原 3 3）合成抗原）合成抗原55.2 免疫学反应基础 理化性状理化性状:1 1）物理性状：）物理性状：分子质量较大，分子质量较大，10104 4D D以上以上 环状比直线型免
4、疫原性更好环状比直线型免疫原性更好 2 2）化学组成：多数是蛋白质）化学组成：多数是蛋白质65.2 免疫学反应基础 抗原决定簇：抗原决定簇：抗原决定簇是抗原物质的一些化抗原决定簇是抗原物质的一些化学基团。它们是免疫细胞和抗体识学基团。它们是免疫细胞和抗体识别的标志。不同的抗原所具有的抗别的标志。不同的抗原所具有的抗原决定簇数目和分布不同。有的抗原决定簇数目和分布不同。有的抗原的抗原决定簇数量多且分布在表原的抗原决定簇数量多且分布在表面，有的则数量较少或分布于抗原面，有的则数量较少或分布于抗原内部。只有暴露的抗原决定簇能为内部。只有暴露的抗原决定簇能为免疫系统识别免疫系统识别。75.2 免疫学反
5、应基础2.2.抗体抗体 定义定义:抗原刺激机体产生的具有特异性免疫功能抗原刺激机体产生的具有特异性免疫功能的球蛋白。的球蛋白。人人类类免免疫疫球球蛋蛋白白已已发发现现有有五五大大类类 IgGIgG、IgAIgA 、IgMIgM、IgDIgD、IgEIgE 抗体也具有抗原性抗体也具有抗原性85.2 免疫学反应基础 抗体结构抗体结构抗体的结构抗体的结构-有有4 4条多肽链的对称结构条多肽链的对称结构95.2 免疫学反应基础3 3、抗原、抗原-抗体反应：抗体反应：抗原与相应抗体的特异性结合反应称为抗原抗体反抗原与相应抗体的特异性结合反应称为抗原抗体反应应(antigen-antibody react
6、ion)(antigen-antibody reaction)。抗原抗体反应既可在体。抗原抗体反应既可在体内作为免疫应答的效应机制自然发生，也可在体外作为免内作为免疫应答的效应机制自然发生，也可在体外作为免疫学实验的结果出现。在体内，可表现为溶菌、杀菌、促疫学实验的结果出现。在体内，可表现为溶菌、杀菌、促进吞噬或中和毒素等作用，在体外，依相应抗原物理性状进吞噬或中和毒素等作用，在体外，依相应抗原物理性状 以及反应的条件不同，可出现凝聚、沉淀和溶解反应等反以及反应的条件不同，可出现凝聚、沉淀和溶解反应等反应。应。本章叙述的抗原抗体反应，主要是指抗原和抗体在本章叙述的抗原抗体反应，主要是指抗原和抗
7、体在体外结合所表现的反应。体外结合所表现的反应。105.2 免疫学反应基础3 3、抗原、抗原-抗体反应：抗体反应：结合点位于结合点位于FabFab段，即抗体活性中心段，即抗体活性中心抗原抗体结合反应是抗原决定簇和抗体分子可变区之间的抗原抗体结合反应是抗原决定簇和抗体分子可变区之间的相互作用，是一种分子表面的特异的可逆的弱结合力。这相互作用，是一种分子表面的特异的可逆的弱结合力。这些弱结合力只能在极短距离内才能发生效应。因此抗原抗些弱结合力只能在极短距离内才能发生效应。因此抗原抗体结合反应的最重要的先决条件体结合反应的最重要的先决条件 1 1）形状互补）形状互补 2 2）电荷相反）电荷相反115
8、.3 免疫生物传感器反应原理1 1、免疫学分析方法：、免疫学分析方法：1 1）免疫沉淀测定法）免疫沉淀测定法 2 2）放射免疫测定法）放射免疫测定法 3 3）免疫荧光测定法）免疫荧光测定法 4 4）酶联免疫测定法）酶联免疫测定法 5 5）免疫电极测定法）免疫电极测定法125.3 免疫生物传感器反应原理1 1、免疫学分析：、免疫学分析：1 1）免疫沉淀测定法）免疫沉淀测定法免疫沉淀是利用抗原和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质免疫沉淀是利用抗原和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质如如“protein A”“protein A”特异性地结合到免疫球蛋白的特异性地结合到免疫球蛋白的FCFC片段，形片段，形成
9、蛋白成蛋白A A抗体目标蛋白的复合物。经沉淀洗涤后，通过抗体目标蛋白的复合物。经沉淀洗涤后，通过电泳使之达到分离提纯和检测抗原的目的。电泳使之达到分离提纯和检测抗原的目的。免疫沉淀电泳技术是经典的免疫学实验，最大的优势是分免疫沉淀电泳技术是经典的免疫学实验，最大的优势是分辨力强，敏感度高，结果易于分析。辨力强，敏感度高，结果易于分析。135.3 免疫生物传感器反应原理1 1、免疫学分析：、免疫学分析：1 1）免疫沉淀测定法）免疫沉淀测定法145.3 免疫生物传感器反应原理1 1、免疫学分析：、免疫学分析：2 2）放射免疫测定法）放射免疫测定法是利用放射性同位素（是利用放射性同位素（1414C
10、C等）示踪技术和免疫化学技术结等）示踪技术和免疫化学技术结合起来的方法，具有灵敏度高、特异性强、重复性好的特合起来的方法，具有灵敏度高、特异性强、重复性好的特点，灵敏度可以达到点，灵敏度可以达到ngng甚至甚至pgpg水平。本法特别适用于微量水平。本法特别适用于微量蛋白质的定量测定。蛋白质的定量测定。缺点是使用同位素，对使用者和环境有一定危害性。缺点是使用同位素，对使用者和环境有一定危害性。155.3 免疫生物传感器反应原理1 1、免疫学分析：、免疫学分析：2 2）放射免疫测定法（竞争法）放射免疫测定法（竞争法）图中黑圈表示标记抗原，白圈表示非标记抗原，长条代表抗体，每个抗体有两个结图中黑圈表
11、示标记抗原，白圈表示非标记抗原，长条代表抗体，每个抗体有两个结合位点，标记抗原与非标记抗原对抗体有同等的结合能力。合位点，标记抗原与非标记抗原对抗体有同等的结合能力。165.3 免疫生物传感器反应原理1 1、免疫学分析：、免疫学分析：3 3）免疫荧光测定法）免疫荧光测定法某些物质的分子能吸收能量而发射出荧光，称为荧光素。某些物质的分子能吸收能量而发射出荧光，称为荧光素。将荧光素标记在抗体（或抗原）上，与相应的抗原（或抗将荧光素标记在抗体（或抗原）上，与相应的抗原（或抗体）结合后，然后对荧光分子进行诱导激发使其发出荧光体）结合后，然后对荧光分子进行诱导激发使其发出荧光信号实现对物质的定性或定量测
12、量的方法，称为免疫荧光信号实现对物质的定性或定量测量的方法，称为免疫荧光分析法（分析法（fluorescence analysisfluorescence analysis）。）。免疫荧光分析法具有灵敏度高、选择性强、需样量少和方免疫荧光分析法具有灵敏度高、选择性强、需样量少和方法简便等优点法简便等优点 常用荧光素有异硫氰酸荧光素（常用荧光素有异硫氰酸荧光素（FITCFITC）等）等175.3 免疫生物传感器反应原理1 1、免疫学分析：、免疫学分析：3 3）免疫荧光测定法）免疫荧光测定法185.3 免疫生物传感器反应原理1 1、免疫学分析：、免疫学分析：4 4）酶联免疫测定法）酶联免疫测定法原
13、理：利用酶促反应的放大作用来显示颜色变化，实现对原理：利用酶促反应的放大作用来显示颜色变化，实现对待测物质的测量。待测物质的测量。步骤如下：步骤如下：（1 1）抗体（或抗原）物理性的吸附于固相载体表面；）抗体（或抗原）物理性的吸附于固相载体表面；（2 2）抗原（或抗体）与酶偶联，形成酶标抗原（或抗体）；）抗原（或抗体）与酶偶联，形成酶标抗原（或抗体）；（3 3）酶标抗原（或抗体）与相应的抗体（或抗原）结合后，然后通过）酶标抗原（或抗体）与相应的抗体（或抗原）结合后，然后通过酶催化底物产生颜色反应，颜色反应的深浅是与标本中相应抗原或抗体酶催化底物产生颜色反应，颜色反应的深浅是与标本中相应抗原或抗
14、体的量成正比例，从而实现定量测定。的量成正比例，从而实现定量测定。195.3 免疫生物传感器反应原理1 1、免疫学分析：、免疫学分析：4 4）酶联免疫测定法）酶联免疫测定法205.3 免疫生物传感器反应原理5）免疫电极测定法：以免疫物质作为敏感元件的电极测量方法具有很高的特异性分为直接免疫电极和间接免疫电极215.3 免疫生物传感器反应原理（1）直接免疫电极工作原理：抗原抗体是携带大量电荷的蛋白质，当二者发生结合时会发生电化学或电学变化，通过检测相应的参数变化来实现对免疫反应的检测。常用的参数：介电常数、电导率、膜电位等225.3 免疫电极235.3 免疫电极d d A A 电容式传感器245
15、.3 免疫生物传感器反应原理（2）间接免疫电极（ELISA电极）工作原理：利用酶标记物将免疫反应的信号放大后间接的测定抗原或抗体。255.3 免疫生物传感器反应原理以HCG的测定为例首先在氧电极表面固定抗体电极制得HCG抗体膜。测定过程分为三步：1）竞争免疫化学反应2）洗脱未经结合的游离HCG和酶标HCG3）酶活性测定，加入H2O2,测通过氧电极测量生成的O2的量酶量与待测样品中酶量与待测样品中HCGHCG的量成反相关的量成反相关26小结o免疫学概述o免疫学反应基础 抗原、抗体特点o免疫生物传感器反应原理 1）免疫沉淀测定法 2）放射免疫测定法 3）免疫荧光测定法 4）酶联免疫测定法 5）免疫电极测定法27