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1、生 物 化 学 学 习 指 南第二部分 蛋白质化学I、内容提要一、20种常见氨基酸的通式、分类、物理性质和分离方法1.通式：L-型氨基酸2.分类：按 R 的化学结构分类：脂肪族氨基酸芳香族氨基酸按 R 的极性分类：非极性R 基氨基酸极性R 基氨基酸：不带电荷带正电荷带负电荷3.物理化学性质：旋光性、酸碱性、等电点及其计算、荀三酮反应、Edman反应、Sanger反应等。4.分离方法：分配层析法、高效液相色谱法、纸层析法、薄层析法、离子交换层析法、气相色谱二、蛋白质的结构1.一级结构：包含着决定高级结构的因素2.高级结构：二级结构（a-螺旋、折叠、转角、无规则卷曲）、超二级结构、结构域三级结构、
2、四级结构3.维持蛋白质结构的作用力：一级结构（共价键）、二级结构（氢键）、三级结构和四级结构（疏水作用、盐键、氢键、范德华力）4.-级结构的测定：N-末端和C-末端氨基酸残基的测定；氨基酸组成分析；多肽链特异性的部分断裂；肽段的氨基酸顺序测定（Edman法和酶解法）；氨基酸顺序排列，二硫键位置的确定。三、蛋白质的结构与功能的关系1.蛋白质一级结构与蛋白质生物学功能的关系：镰刀型细胞贫血症，-一 级结构的种属差异与分子进化。2.高级结构与蛋白质生物学功能的关系：肌红蛋白和血红蛋白的结构以及它们氧合曲线的差异。四、蛋白质的理化性质1.等电点及电泳2.胶体性质、盐析、盐溶3.变性与复性4.颜色反应：
3、双缩胭反应、水合荀三酮反应、米伦反应、Folin-酚试剂反应n、习题一、名词a-螺旋 B -折 叠 盐 析 盐 溶 等 电 点 亚 基 Sanger反 应 Edman反应超二级结构 结构域 次级键 酰胺平面 构型 构象二、符号GSSG PAGE DNP-AA SDS Arg Trp Asn Pro三、填空1.脯氨酸与羟脯氨酸同苗三酮反应产生_ _ _ _ _ 色的物质，而其它氨基酸与荀三酮反应产生_ _ _ _ _ _ _ 色物质。2.在下列空格中填入合适的氨基酸名称：是带芳香族侧链的极性氨基酸；和 是带芳香族侧链的非极性氨基酸；和是含硫的氨基酸，其中 是含硫的极性氨基酸；、是含羟基的氨基酸，
4、其中 是在一些酶活性中心起重要作用并含羟基的极性较小的氨基酸。3.定量测定蛋白质的方法包括：、和 等;分离蛋白质的方法主要有：、和 等。4.测定N-末端的方法有：、等，测定C-末端的方法有：、等，氨基酸顺序分析仪是根据 反应原理设计的。5.蛋白质紫外吸收高峰在 n m,而核酸在 nm。6.蛋白质的三级结构的稳定力量包括：、，其中主要是，蛋 白 质 的 二 级 结 构 的 主 要 稳 定 力 量 是,一级结构的主要稳定力量是 07.用紫外分光光度法测定P r 的 含 量 是 基 于 蛋 白 质 分 子 中 的、和 三种氨基酸的共舸双键具有紫外光的吸收能力。8.*螺旋通常在脯氨酸处中断，其原因是
5、o9.蛋 白 质 二 级 结 构 的 四 种 基 本 类 型 是、。10.序列测定常用的蛋白酶和试剂中，用 酶、酶和 酶水解肽链，专一性要比用 酶和(化学试剂)水解肽链差。11.蛋白质之所以出现各种内容丰富的构象是因为 键和 键能有不同程度地转动。12.构成P r的四级结构需要两条以上的肽链，每 条 肽 链 称 为 一 个，肽链与肽链之间靠 相连。13.去污剂如十二烷基磺酸钠(S D S)使蛋白质变性是由于SD S能破坏使疏水基团暴露到介质中。14.蛋白质变性主要是由于 键等次级键破坏所致，变性后、活性发生改变。15.8 一 转 角 的 最 大 特 点 为,一般含有 氨基酸。16.常用的拆开蛋
6、白质分子中的二硫键的方法有 和,常用的试剂有、等。17.在 pH6.0时将Gly、Ala、Glu Lys Arg和 Ser的混合物进行纸电泳向阳 极 移 动 最 快 的 是，向阴极移动最快的是 和,移动很慢接近原点的是 和，。18.20种氨基酸中，在稳定许多蛋白质结构中起重要作用，因为它可参与形成链内和链间的共价键。19.20种氨基酸中、和 的B-碳原子与两个以上的基团相连，它们可使a-螺旋的结构变得不稳定。20.蛋 白 质 的 磷 酸 化 可 以 发 生 在 下 列 主 要 氨 基 酸 残 基 的 位 点Jt：、O21.镰刀型红细胞贫血病是一种先天遗传分子病，其病因是由于正常血红蛋白分子中的
7、一个 被 所置换。22.蛋白质是两性电解质，当溶液的p H 在其等电点以上时蛋白质分子带电荷，而在pH等电点以下时，带 电荷。23.分离蛋白质混合物的各种方法主要是根据蛋白质在溶液中下列性:、o24.血红蛋白（Hb）与氧结合的过程呈现 效应，是通过H b 的现象实现的，它的辅基是 o25.肽链中的 氨基酸残基上的一个环氮上的孤对电子，像 Met 一样使之在结合血红蛋白的铁原子时成为起重要作用的潜在配体。26.在生理条件下，一般球蛋白的构象是 侧链在外面，侧链在内部；而非极性环境中，如膜蛋白在呈折叠状时，是 侧链在外面，而 侧链由于内部相互作用，呈中性状态。27.蛋白质水解时，切断，随之产生游离
8、的_ _ _ _ _ _ _ _基团和基团，可用 试剂鉴定。28.研究蛋白质构象的方法很多，但主要是应用。29.在 2 0 种氨基酸中，和 分子量小而且不含硫，在折叠的多肽链中能形成氢键。30.谷胱甘肽由三中氨基酸通过肽键联接而成，这三种氨基酸分别ZE、031.分子病是指 的缺陷，造成人体 的结构和功能的障碍，如32.氨基酸在等电点时，主要以 离子形式存在，在 pHPI的溶液中，大部分以 离子形式存在，在 pH5.0 B.=5.0 C.H i s 位于分子外部。(2)因两者的侧链都比较小，疏水性和极性都小，G l y 只有-个H+与a-C相连，A l a 只有C H 2 与a-C 相连，故它们
9、即可以出现在分子内部，也可以出现在分子外部。(3)它们在p H 7时含有不带电荷的极性侧链，参与分子内部的氢键形成，从而减少了它们的极性。(4)在球蛋白内部可见C y s,因为C y s 常常参与链内和链间的二硫键形成,使其极性减少。1 6 .蛋白质分子中主链骨架的重复单位称为肽单位，组成肽单位的6 个原子,-(C n-C O-N H-C n+l)-位于一个平面上所以也称其为肽平面，肽单位的基本结构是固定的，并且有以下特征：(1)肽键中的C-N 键比正常的C-N 单键短，比 C=N 键长，因此，具有部分双键的性质不能自由旋转。(2)肽单位是一个刚性平面结构，所以也可以说多肽链是由许多刚性平面连
10、接起来的，平面之间是a-碳原子，由小角和W 角决定了的构象不能轻易改变。(3)在肽平面上C=0 与N-N,或者C2-C -C 与 N2-C,可以是顺式也可是反式，在多肽链中的肽单位通常是反式。(4)除 P r o 外都是反式，反式构型比顺式构型能量低，因此比较稳定。P r o不含游离的氨基，不能形成真正的肽键，由于P r o 参与形成的肽键可以是顺式也可以是反式。1 7.随着蛋白质分子量的增加，它的体积也要增大，这样表面积与体积的比率也就是亲水残基与疏水残基比率必定减少。1 8.P r 溶液的胶体性质。扩充部分一、填空1.一般来说，球蛋白的 性氨基酸侧链位于分子内部，性氨基酸侧链位于分子表面。
11、2.凝集素能专一地识别细胞表面的 并与之结合，从而使细胞与细胞相互凝集。3.在正常生理条件下（pH 7左右）蛋白质中 和 的侧链儿乎完全带正电荷，但是 的侧链仅部分带正电荷。4.20种氨基酸中 是亚氨酸，可改变a-螺旋的方向。5.20种氨基酸中 是具有非极性侧链且是生成酪氨酸的前体。6.FDNB与 氨 基 酸 作 用 可 生 成 黄 色 的 ,简称 o7.用 对 多 肽 进 行 链 内 断 裂 比 用、和得到的肽片段少。8.溟化氢能使Gly-Arg-Met-Ala-Pro裂解为 和 两个肽段。9.在糖蛋白分子中，糖 基 或 寡 糖 基 可 与 蛋 白 质 的 和 残基侧链以。-型糖背键相连，或
12、与 残基侧链以N-型糖苜链相连。10.肽经溪化氢处理后，在 残基右侧的肽键被裂解，裂解后该残基变为 o11.一 一 条肽链：Asn-His-Lys-AsP-Phe-Ph-Glu-Ile-Arg-Glu-Tyr-Gly-Arg 经胰蛋白酶水解，可得到 个肽。12.胰蛋白酶的专一性就是在 残基右侧的肽键上水解，胰凝乳蛋白酶专一性地切断 和 的较基端肽键。13.竣肽酶B专一地从 蛋 白 质 的 竣 端 切 下 氨基酸。14.生 物 体 内P r的共价修饰有：、和等。15.当P r与配基结合后，改变了该蛋白的构象，从而改变该蛋白的生物活性的现象称为 O二、是非题1.某一生物样品，与荀三酮反应呈阴性，用
13、竣肽酶A和B作用后测不出游离氨基酸，用胰凝乳蛋白酶作用后也不失活，因此可肯定它属非肽类物质。2.含有四个二硫键的胰脏核糖核酸酶，若用筑基乙醇和尿素使其还原和变性，由于化学键遭到破坏和高级结构松散，已经无法恢复其原有功能。3.免疫球蛋白由两条轻链和两条重链所组成，抗体与抗原的结合只涉及轻链，因为它有可变区域，重链的序列基本上都是恒定的，只起维持结构稳定的作用。4.胶原蛋白质中有重复的疏水性氨基酸顺序出现，所以形成大面积的疏水区，相互作用使三股肽链稳定及整齐排列。5.因甘氨酸在酸性或碱性水溶液中都能解离，所以可作中性pH 缓冲液介质。6.用竣肽酶A 水解一个肽，发现从量上看释放最快的是L eu,其
14、次是Gly,据此可断定，此肽的C 端序列是Gly-Leu。7.竣肽酶A 不能水解C 末端是碱性氨基酸残基和脯氨酸残基的肽键。8.所有蛋白质的摩尔消光系数都是一样的。9.凝胶过滤法可用于测定蛋白质的分子量，分子量小的蛋白质先流出柱，分子量大的后流出柱。10.溟化氢能作用于多肽链中的甲硫氨酸键。11.胰蛋白酶专一地切在多肽链中碱性氨基酸的N 端位置上。12.丝氨酸是蛋白质的磷酸化位点，因此蛋白质中含有的丝氨酸残基均能被磷酸化。13.蛋白激酶属于磷酸转移酶类，催化磷酸根共价转移到蛋白质分子上的反应。14.膜蛋白的跨膜肽段的二级结构大多为a-螺旋。15.电泳和等电聚焦都是根据蛋白质的电荷不同，即酸碱性
15、质不同的两种分离蛋白质混合的方法。16.糖蛋白中的糖肽连接键，是一种共价键，简称为糖肽键。17.免疫球蛋白是一类血浆糖蛋白。18.用凝效电泳技术分离蛋白质是根据各种蛋白质的分子大小和电荷不同。19.三肽Lys、Lys、Lys的PI值必然大于Lys的任何一个个别的PKa值。20.蛋白质构象形成中，内部氢键的形成是驱动蛋白质折叠的主要相互作用力。21.活性多肽不一定都是由L 一氨基酸通过肽键连接而成的化合的。22.可用8M尿素拆开蛋白质分子中的二硫键。23.竣肽酶A 的分子外部主要是a-螺旋构象，分子内部主要是6-折叠的构象。24.CNBr 能裂解 Gly-Met-Pro 三肽。25.测定变构酶的
16、分子量可以用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。26.蛋白质构象是蛋白质分子中的原子绕单键旋转而产生的蛋白质分子中的各原子的空间排布。因此，构象并不是一种可以分离的单一立体结构形式。27.有一小肽，用测N-末端的方法未测出游离的a-NH2,则此肽必为环肽。28.当某一蛋白质分子的酸性氨基酸残基数目等于其碱性氨基酸残基数目时，此蛋白质的等电点为7.0。29.渗透压法、超离心法、凝胶过滤法及聚丙烯酰胺凝胶电泳法都是利用蛋白质的物理化学性质来测定蛋白质分子量的。30.在水介质中，蛋白质的折叠伴随着多肽链嫡的增加。31.血红蛋白和细胞色素C 的辅基相同，前者运输氧，后者用于组成呼吸链。它们的生物学功能本质是相
17、同的。32.抗体就是免疫球蛋白。33.免疫球蛋白就是抗体。三、选择题1.胰蛋酶的作用点是（X 代表氨基酸残基）A.精氨酰-X B.苯丙氨酰-XC.天冬氨酰-X D.X-精氨酸2.滨化氟作用于：A.甲硫氨酰-X C.精氨酰-XB.X-色氨酸 D.X-组氨酸3.组蛋白都是富含 残基：A.组氨酸 B.谷氨酸C.赖氨酸 D.丝氨酸4.生理状态下，血红蛋白与氧可逆结合的铁处于：A.还原性的二价状态 B.氧化性的三价状态C.与氧结合时是三价，去氧后成二价 D.以上都不对5.定性鉴定20种氨基酸的双向纸层析是：A.交换层析 C.分配层析B.亲合层析 D.薄层层析6.有一个二硫键-疏基交换酶，它能催化变性核糖
18、核酸酶的二硫键配对正确而恢复活力，但却反使正常胰岛素失活，这是因为胰岛素分子：A.没有足够的疏水面，所以不能被交换酶正确接触催化B.二硫键不能被还原C.由两条肽链组成D.通过二硫键与酶生成了共价化合物7.牛胰岛素由A、B 两条链组成，其中B 链是：A.30 肽 B.31 肽 C.20 肽 D.21 肽8.天然蛋白质组成中常见的一个氨基酸，它的侧链在pH7.2和 pH13都带电荷,这个氨基酸是：A.谷氨酸 B.组氨酸 C.酪氨酸 D.精氨酸9.研究蛋白质结构常用氧化法打开二硫键，所用的化学试剂是：A.亚硝酸 B.过氯酸 C.硫酸 D.过甲酸10.通常使用 测定多肽链的氨基末端：A.CNBr B.
19、丹磺酰氯 C.6mol/l HC1 D.胰蛋白酶11.下列蛋白质中 不是糖蛋白A.免疫球蛋白 B.溶菌酶 C.转铁蛋白 D.胶原蛋白12.蛋白质在下列哪一种水解过程中，由于多数氨基酸被遭到不同程度的破坏，产生消旋现象：A.酸水解 B.酶水解 C.碱水解 D.以上都不对13.要断裂由甲硫氨酸残基的竣基参加形成的肽键，可用：A.胰蛋白酶 B.尿素 C.溟化氟 D.胃蛋白酶14.在接近中性pH 的条件下，下列哪种基团既可为H+的受体，也可为H+的供体：A.His-咪哇基 B.Lys-氨基C.Arg-胭基 D.Cys-疏基15.胶原蛋白中最多氨基酸残基：A.脯氨酸 B.甘氨酸 C.丙氨酸 D.组氨酸1
20、6.下列的蛋白质分子量测定方法中，对蛋白质纯度要求最高的方法是A.根据化学组成测定最低分子量B.利用渗透压测定计算分子量C.沉降平衡法D.SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法17.下列哪种氨基酸可发生乙醛酸反应：A.色氨酸 B.缴氨酸 C.苏氨酸 D.丝氨酸18.在 pH67之间质子化程度改变最大的氨基酸是A.甘氨酸 B.谷氨酸 C.组氨酸 D.苯丙氨酸19.下列蛋白质中哪些含有铁离子：A.细胞色素C B.血红蛋白C.肌红蛋白 D.过氧化物酶20.下列哪些是结合蛋白质：A.粘蛋白 B.细胞色素CC.血红蛋白 D.清蛋白21.下列关于谷胱甘肽结构的叙述哪些是正确的A.有一个a 一 氨 基 B.有一个与通常
21、肽键不同的Y-肽键C.有一个易氧化的侧链基团 D.由谷氨酸、胱氨酸和甘氨酸组成的三肽22.在生理pH情况下，下列氨基酸中哪些带负电荷A.半胱氨酸 B.天冬氨酸C.赖氨酸 D.谷氨酸23.蛋白质的糖基化是翻译后的调控之一，糖基往往与肽链中哪一个氨基酸残基的侧链结合A.谷氨酸 B.赖氨酸C.酪氨酸 D.丝氨酸24.具有两个不对称碳原子的氨基酸有：A.甘氨酸 B.丝氨酸C.丙氨酸 D.苏氨酸25.下列哪些氨基酸具有疏水侧链A.亮氨酸 B.蛋氨酸C.脯氨酸 D.苯丙氨酸26.下列氨基酸中哪些有分支烂链A.缴氨酸 B.组氨酸C.异亮氨酸 D.色氨酸27.侧链为环状结构的氨基酸是A.酪氨酸 B.组氨酸C.
22、脯氨酸 D.精氨酸28.聚丙烯酰胺凝效电泳比一般电泳的分辨率高，因为具有下列哪些效应A.浓缩效应 B.电荷效应C.分子筛效应 D.粘度效应29.下列哪种氨基酸残基最有可能位于球状蛋白质分子表面A.Leu B.Phe C.Met D.AsP30.抗体IgG分子的重链和轻链可用下列哪种试剂分开A.乙醇胺 B.胃蛋白酶C.木瓜蛋白酶 D.疏基乙醇31.下列哪种蛋白质不含铁原子A.肌红蛋白 B.过氧化物酶C.过氧化氢酶 D.胰蛋白酶32.下列各项不符合纤维状蛋白理化性质的有A.易溶于水 B.不易受蛋白酶水解C.其水溶液粘度高 D.不适合用分子筛的方法测其分子量33.胰蛋白酶原在肠激酶作用下切去N-端的
23、一个儿肽后被激活成胰蛋白酶A.八肽 B.六肽 C.五肽 D.三肽34.下列有关肌球蛋白质的叙述，哪一个是正确的A.它是一种需要锌的酶B.它是一种球形对称分子C.它的a-螺旋含量较低D.它是一种与肌动蛋白结合的蛋白质35.为了充分还原RNA酶，除了应有B-疏基乙醇外，还需要A.过甲酸 B.尿素C.调节pH到碱性 D.调节pH到酸性36.用纸层析法分离丙氨酸、亮氨酸和赖氨酸的混合物，则它们之间R f的关系应为A.AlaLeulys B.LysAlaLeuC.LeuAla.Lys D.LysLeuAla37.稳定蛋白质空间结构的儿种作用力中，哪种与酰胺氮的存在有关A.氢键 B.离子作用C.疏水作用
24、D.共价键38.下列哪一项因素不影响蛋白质a-螺旋的形成A.碱性氨基酸相近排列 B.酸性氨基酸相近排列C.脯氨酸的存在 D.丙氨酸的存在39.聚L-亮氨酸在二氧已环中呈a-螺旋，而聚L-异亮氨酸则不能形成a-螺旋，这是因为与亮氨酸相比A.L-异亮氨酸链短 B.L-异亮氨酸有一个甲基在6-碳上C.L-异亮氨酸多一个甲基 D.L-异亮氨酸少一个甲基40.免疫球蛋白是一种A.糖蛋白 B.脂蛋白C.简单蛋白 D.铜蛋白41.应该加入多少克NaOH到 500ml已完全质子化的O.Olmol/lHis溶液中，才能配成 pH7.0 的缓冲液？(PK|=2.1 PK2=6.0 PK3=9.17)A.0.382
25、 B.0.764 C.0.857 D.0.98242.向 LOL,l.Omol/1处于等电点pH的甘氨酸溶液中加入0.3mol的NaOH,所得溶液的pH值是多少？(PK|=2.34 PK2=9.60)A.2.34 B.9.60 C.1.97 D.9.2343.三肽 Lys-Lys-Lys PI 值 为(PKi=2.18 PK2=8.95 PK3=10.53)A.5.57 B.8.95 C.10.53 D.大于 10.5344.下列哪种多聚氨基酸，在生理条件下易形成a-螺旋A.Poly-Val B.Poly-GluC.Poly-Lys D.Poly-Ala45.加入哪种试剂不会导致蛋白质的变性A
26、.尿素 B.盐酸胭C.SDS D.硫酸镇4 6.下列哪种蛋白质是水溶性的A.血红蛋白 B.酶蛋白C.卵清蛋白 D.骨胶原蛋白五、问答题1.蛋白质的分离纯化技术中凝胶过滤和超过滤有无共同处？它们各自根据什么原理？2.举例说明利用盐析法分离蛋白质的原理和方法3.测定蛋白质中氨基酸顺序的一般步骤应包括哪儿项？4.列举四种常用的蛋白质定量法，并说明各自的优缺点。5.用强酸型阳离了交换树脂分离下述每对氨基酸，当用pH7.0的缓冲液洗脱时，每对中先从柱上洗脱下来的是哪种氨基酸？(1)天冬氨酸和赖氨酸(2)精氨酸和甲硫氨酸(3)谷氨酸和缴氨酸(4)甘氨酸和亮氨酸(5)丝氨酸和丙氨酸6.下述每组混合物分别用正
27、丁醇：醋酸：水系统进行纸层析，指出每组中每组分的相对迁移率(假定水相的pH4.5)(1)Vai 和 Lys(2)Phe 和 Ser(3)Ala、Vai 和 Leu(4)Glu 和Asp(5)Tyr Ala 和 His(6)Lys-Lys 和 Lys(7)Cys-Cys-Ser 和 Ala-Ala-Ser7.胰岛素是由A、B 两条链组成的，两条肽通过二硫键连接。在变性条件下使二硫键还原，胰岛素的活性完全丧失。当疏基被重新氧化后，胰岛素恢复的活性不到天然活性的10%,请予以解释。8.从镰刀型红细胞贫血症病人中分离的脱氧血红蛋白，其等电点为6.9,相反，从一个正常的人体中分离到的脱氧的血红蛋白的等电
28、点是6.7。(1)请对这种差别提出结构基础；(2)若在pH7.5的条件下进行电泳，对血红蛋白的电泳行为发生什么样的影响？9.一个蛋白质混合物含有下面几种不同的组分：a.Mr=12000 PI=10 b.Mr=62000 PI=4c.Mr=28000 PI=7 c.Mr=9000 PI=5不考虑其他因素，分别指出在下述情况下流出的顺序：(1)该混合物用DEAE-纤维素柱层析时，以逐渐增高洗脱液的盐浓度方式进行洗脱。(2)该混合物用Sephalex-50凝效柱层析分析。10.构象指的是：一个由多个碳原子组成的分子因单键旋转而形成的不同的碳原子上各取代基或原子的空间排列，只需单键的旋转即可造成新的构
29、象。多肽链主链在形式上都是单键。因此可以设想-条多肽主链可能有无限多种构象。然而，一种蛋白质的多肽链在生物体正常的温度和pH下只有一种或很少几种构象，并为生物功能所必需。这种天然的构象是什么样的因素促成的？11.根据以下实验结果，推断肽的氨基酸排列顺序a.经酸水解分析该肽段含下列成分：(1)Ala2；Arg;Met;Phe;Ser?;Lys2b.经竣肽酶A 水解得：(2)Alac.经胰蛋白酶水解所得各肽段成分分别为：(3)Ala2；Arg;(4)Lys；Phe；Ser(5)Lys(6)Ala；Met；Serd.经 CNBr水解所得肽段成分为：(7)Ala；Arg；Lys；Met；Phe；Ser
30、(8)Ala；Sere.经嗜热菌蛋白酶水解所得肽段成分为：(9)Ala；Arg；Ser Ala；Lys；Met；Phe；Ser1 2.要测定蛋白质的二硫键位置，需用什么方法？请简述之。13.定出六种已知的蛋白质肽链生物合成后的共价修饰方式，并简述其生物学意义？14.大肠杆菌含有2000种以上的蛋白质，为了分离它所表达的一个外源基因的产物并保持它的活性，常有很大困难，但为了某种目的，请根据下列要求写出具体的方法。（1）利用溶解度差别进行分离（2）利用蛋白质分子大小进行分离（3）根据不同电荷进行分离（4）已制备有该产物的抗体进行分离（5）产物的浓缩（6）产物纯度的鉴定15.已知一个九肽的氨基顺序是
31、：Ala-Pro-Lys-Arg-Val-Tyr-Glu-Pro-Gly,在实验室只有氨基酸分析仪，而没有氨基酸顺序测定仪的情况下，如何使用（1）竣肽酶A 或 B；（2）氨肽酶；（3）2,4-二硝基氟苯田口力）；（4）胰蛋白酶；（5）胰凝乳蛋白酶来验证上述肽段的氨基酸顺序。16.有人纯化了一个未知肽，其氨基酸组成为：Asp 1,Ser 1,Gly 1,Ala 1,Met 1,Phe 1和 Lys 1,又做了一系列分析，结果如下：（1）FDNB与之反应再酸水解后得DNP-Ala（2）胰凝乳蛋白酶（CT）消化后，从产物中分出一个纯四肽，其组成为：Asp 1,Gly 1,Lys 2,Met 1,此四
32、肽的FDNB反应降解产物为DNP-Gly。（3）胰蛋白酶（T）消化八肽后又可得到组成分别为Lys 1,Ala 1,Ser 1及 Phe 1,Lys 1,Gly 1 的两个三肽及一个二肽。此二肽被CNBr处理后游离出自由天冬氨酸。请列出八肽全顺序并简示你的推理过程。17.有一蛋白质，在某组织内含量较低，很难分离提出，现已知其分子量，并从其它实验室要来该蛋白质的抗体，问用哪些实验方法可以初步证实组织内的确含有该蛋白质。18.简介信号肽及识别信号肽的信号识别体的结构特征？19.下面的数据是从一个8 肽降解和分析得到的：组成：Ala、Gly?、Lys、Met、Ser Thr、TyrCNBr：（1）Al
33、a、Gly、Lys Thr（2）Gly、Met Ser Tyr胰蛋白酶：（1）Ala、Gly（2）Gly、Lys Met、Ser Thr Tyr糜蛋白酶：（1）Gly、Tyr（2）Ala、Gly Lys Met、Ser、ThrN-末端：GlyC-末端：Gly请确定该肽的氨基酸顺序。20.用胰蛋白酶处理某多肽后获得一个七肽（非竣基端肽）。这个七肽经盐酸完全水解后获得Met、Glu、Phe、Ala、Pro、Lys各 1摩尔。该肽与二硝基氟苯反应后用盐酸水解不得到任何a-DNP-氨基酸。该肽用段肽酶B 处理不能得到任何更小的肽。该肽用CNBr处理得到一个四肽和一个三肽，四肽经酸水解后得到 Met、P
34、he和 G lu,这个七肽经糜蛋白处理也得到一个三肽和一个四肽，四肽的氨基酸组成是Ala、Met、Pro和 L ys,根据上述信息确定这个七肽的氨基酸顺序。21.某肽经分析具有如下的氨基酸组成：赖氨酸、脯氨酸、精氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、酪氨酸和丝氨酸各一分子。该物质与DNFB反应不能给出任何可采用的信.息，除非首先与胰凝乳蛋白酶反应，在这种情况下可产生DNP-丝氨氨酸和DNP-赖氨酸，它们分别是从由脯氨酸、酪氨酸、丝氨酸以及内氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、精氨酸所组成的两个肽中产生的。用胰蛋白酶处理也可产生分别由精氨酸、丙氨酸以及苯丙氨酸、酪氨酸、赖氨酸、丝氨酸、脯氨酸构成的两个肽，请确定该肽的氨基
35、酸顺序。22.酸水解Im ol某五肽，得到2mmolGlu,ImmolLys；用胰蛋白酶处理得到两个肽段，电泳时一个向阳极移动，另一个向阴极移动，两者之一用DNFB处理后，再用酸水解产生DNP-Glu,用胰凝乳蛋白酶水解五肽产生两个二肽和游离 G lu,写出五肽的氨基酸排列顺序。23.试述测定蛋白质分子量的主要方法和原理。24.凝胶柱层析分离Pr的原理。扩充部分参考答案一、填空1.疏 水 杀 水2.糖基3.Arg Lys His4.脯氨酸5.Phe6.二 硝 基 苯 基 氨 基 酸DNP7.溟 化 氢 胰 蛋 白 酶 胰 凝 乳 蛋 白 酶 胃 蛋 白 酶8.Gly-Arg-Met Ala-P
36、ro9.Thr Ser Lys10.甲硫氨酸 高丝氨酸11.31 2.赖氨酸和精氨酸1 3.碱性1 4.糖 基 化 磷 酸 化1 5.变构/别构效应二、是非题X X X X Xv v v v xx v x三、选择题A,A,A,A,CC,A,C,ABCD,AC,ABC,ABC,EC,C,D,B,A苯 丙 氨 酸 亮 氨 酸甲 基 化 乙 酰 化X V X X VV X V V XC A,A,D,BC ABC,D,D,A,A,D,D,D,B B,C,C,A,B3D,D,D,ABCDI,D,BDx x x v vv x x v x四、问答题1.凝胶过滤和超过滤都是蛋白质分离纯化过程中常用的技术，但是
37、其原理和操作两者都不相同。凝胶过滤是根据蛋白质分子的大小，将样品中的各种蛋白质分子分开，具体操作是将样品通过装有一定规格凝胶的凝胶过滤柱，小分子的蛋白质进入凝胶孔内，大分子的蛋白质留在外面，然后用洗脱液洗脱，蛋白质依分子大小被洗脱，大分子先被洗脱，然后是小分子的蛋白质。超过滤是利用蛋白质分子不能穿过半透膜的透性除去蛋白质混合物中的小分子物质，具体操作是将样品装入透析袋，然后利用高压或离心力，迫使蛋白质样品中的非蛋白的小分子溶质通过半透膜，蛋白质留在透析袋内。2.采用饱和硫酸钱从蛋清中分离卵清清蛋白，从胰脏分离各种蛋白质和酶,都是利用盐析法分离蛋白质的典型实例，其原理是大量中性盐的加入，使水的活
38、度降低，使溶液中的自由水与蛋白质分子水化层的水转变为盐离子的水化水，破坏蛋白质水化层，导致蛋白质沉淀析出。通过盐作用沉淀的蛋白质保持它的天然构象和活性，再溶解后，可以行使正常的功能。操作时，根据待分离蛋白质盐析浓度的要求，配制一定浓度饱和硫酸镀溶液加入样品中，蛋白质就会慢慢析出。例如将蛋清用水稀释，加入硫酸镂至半饱和，其中的球蛋白沉淀析出，除去滤液得到球蛋白，留在滤液中的卵清清蛋白，酸化,室温静止过一段时间后，可得到卵清清蛋白晶体。3.(1)蛋白质样品预处理：用于序列测定的样品必须纯化并测定分子量，再加入含疏基乙醇的高浓度尿素溶液，使蛋白质分子中的二硫键和非共价键断开。(2)测定氨基酸组成：通
39、常将蛋白质样品用6 m o l/l H C 1在1 1 0 C水 解2 4 h,再用氨基酸自动分析仪进行测定。据此可初步了解蛋白质的氨基酸种类及数量。(3)肽链末端氨基酸的测定：用S a n g e r反 应 或E d m a n反应，测 定N-末端氨基酸；用竣肽酶或腓解法测定C-末端氨基酸。(4)专一性部分裂解：为了便于测定，通常用蛋白酶或试剂将长的肽链专一性裂解成若干小的肽片段，每种样品至少用两种方法裂解，产生两套以上的片段，以便借助重叠法排列出完整的序列。(5)肽片段的分离纯化：用电泳或高效液相层析将部分裂解的样品分离纯化，得到两套或儿套肽片段。(6)各个肽段的氨基酸序列测定：目前主要用
40、E d m a n降解法，或序列仪进行测定。(7)确定整个肽链的氨基酸序列：利用两套或几套肽片段氨基酸序列彼此间的重叠，确定各肽段在多肽链中的位置，拼凑出完整的氨基酸序列。4.常用的方法有凯氏定氮法、L o w r y氏法、双缩胭法和紫外光谱吸收法。(1)凯氏法根据的是蛋白质中含氨量大体上是一 定 的(约1 6%),使样品在硫酸存在下加热使氮全变成氨，测定氨以确定含氮量。优点：适用范围广。缺点：须除去非蛋白含氮物的影响；含碱性氨基酸、酰胺多的蛋白质、含氮量过高，影响结果；操作复杂，须熟练掌握。(2)L o w r y 氏法：优点：操作简便，易于掌握；灵敏度高。缺点：试剂配制较复杂；受杂质影响大
41、，在此法测定时，必须注意清除杂质影响；各蛋白质的芳香族氨基酸含量有差异，不似凯氏法的含氮量一定，所以得的值依蛋白质会有变动。(3)双缩胭法：优点：试剂配制及操作简便。缺点：灵敏度不高，测定时需蛋白质的量较多；含糖多及脯氨酸多时显色差，值变低。（4）紫外吸收法：优点：不需特殊试剂，操作简便，可自动化分析。缺点：灵敏度差；有时蛋白质不同可能芳香族氨基酸含量变动大，得值差增大；须注意吸收同一紫外光谱的影响（如核酸等）。5.氨基酸从离子交换柱上被洗脱下来的速度主要受两种因素影响：（1）带负电荷的树脂磺酸基和氨基酸带正电荷的功能基团之间的离子吸附,吸附力大的在树脂上停滞的时间长，从柱上洗脱下来的速度慢；
42、（2）氨基酸的侧链基团与树脂强非极性的骨架之间的疏水相互作用。非极性大的侧链R基氨基酸与树脂骨架间的疏水作用力强，从树脂柱上洗脱下来的速度慢。根据氨基酸可电离基团的PK；J值，我们可以确定每组氨基酸的结构以及在pH7时它们的平均净电荷，如果平均净电荷相同，则取决于它们侧链基团的疏水性。（1）天冬氨酸净电荷为-1，赖氨酸净电荷为+1,赖氨酸与树脂磺酸基相反,离子吸附力大，因此，天冬氨酸先被洗脱下来。（2）精氨酸净电荷为+1,甲硫氨酸净电荷接近于零。因此，甲硫氨酸先被洗脱下来。（3）谷氨酸净电荷为-1,缴氨酸净电荷接近零；谷氨酸的负电荷与树脂带负电荷的磺酸基之间相互排斥，减少了谷氨酸与树脂的附着力
43、，故先被洗脱下来。（4）甘氨酸和亮氨酸的净电荷都接近于零。但亮氨酸庞大的非极性侧链与树脂骨架之间的非极性相互排斥，减小了谷氨酸与树脂的附着力，故先被洗脱下来。（5）丝氨酸和丙氨酸的净电荷都接近零，但丝氨酸的侧链非极性小，故先被洗脱下来。6.纸层析分离氨基酸或小肽是根据它们的极性。层析时，流动相是非极性的有机溶剂，而固定相则是滤纸吸附的水。氨基酸或小肽的侧链非极性越强，则与固定相的作用力越小，迁移速度越大；反之，侧链的极性越强，与固定相的作用力越大，迁移的速度就越小。因此：（1）Vai迁移的速度大于Lys；（2）Phe迁移的速度大于Ser；（3）Ala、Vai和Leu迁移速度的顺序是LeuVal
44、Ala；（4）Glu迁移速度大于A sp,因Glu的侧链的疏水性相对比Asp大，而 且Glu侧链在该pH下的非电离程度比Asp大;（5）迁移速度的大小顺序是：TysAlaSerHiSo Tyr的侧链虽含有-O H,但此时未电离，并且侧链的大部分是非极性苯环；Ala的侧链只是一个甲基，非极性相对小一些，故TyrAla；Ser的侧链小，并含有极性的-OH,His的侧链此时已大部分质子化，这两种氨基酸与固定相的作用较大，因而它们迁移速度小于Ala,但Ser和His两者的迁移速度基本相等。（6）Lys-Lys的迁移速度与Lys儿乎相同，尽 管Lys-Lys在此时质子化程度较高，与固定相的作用力较大，但
45、分子则链的非极性部分增高，因此出现这样的结果；（7）Ala-Ala-Ser迁移速度大于Cys-Cys-Ser,因为后者全由侧链具极性的氨基酸残基组成。7.胰岛素是以前体的形成合成的。前体分子是一条单一的肽链。在前体合成及折叠后，切除前体分子的一部分（包括连接肽C肽），留下由二硫键连的A和B两条肽链。这样，天然的胰岛素由于缺少C肽，因而也就缺乏指导肽链折叠的某此必需的信息。所以当胰岛素变性和还原，随之复性，二磷键的形成是随机的，在这种情况下是不能完全恢复到天然活性的。这并不与氨基酸顺序指导蛋白质折叠的基本原则相矛盾。8.（1）大多数蛋白质的等电点都接近中性，这反映出在蛋白质中酸性氨基酸和碱性氨基
46、酸的残基数大致相等。在低于等电点的p H下，蛋白质带正电荷，在高于等电点的p H下，蛋白质带负电荷。酸性残基的减少会增高蛋白质的等电点。由于不正常的血红蛋白（H b s）比正常血红蛋白（H b A）少一个酸性基团（B-亚基的第6位谷氨酸被缴氨酸取代），所 以H b s的酸性减少，碱性升高，等电点也随之升高。（2）在p H 7.5下，对H b A来说，该环境偏碱性，它会解离带负电荷。对于H b s来说，由于它的等电点比H b A高，虽 然p H 7.5对 于H b A来说也是碱性环境,但更接近于p H 7.5 o因此它解离所带的净负电荷相对减少。在电场的作用下，H b A和H b s都向阳极泳动
47、，但HbA比H b s泳动速度快。9.（1）D E A E-纤维素是一种常用于蛋白质分离的阴离子交换剂。在分离蛋白质样品之前，D E A E-纤维素先用较低的离子强度和p H为8的缓冲液平衡，蛋白质样品也溶于同样的缓冲液中。在这样的条件下，D E A E-纤维素大部分解离，并且带固定的正电荷。在这种p H下，蛋白质样品中有的组分带正电荷，有的组分带负电荷；这些带不同电荷的组分与D E A E-纤维素的结合力不同，洗脱液的离子强度影响带电颗粒与交换剂间的结合力。当升高洗脱液的离子强度时，会降低交换剂与被分离组分的静电吸引力。由上所述，该蛋白质混合物各组分被洗脱下来的先后顺序是：a c d b o
48、（2）S e p h a d e x是葡聚糖凝胶，它是具有不同交联度的网状结构，其颗粒内部的孔径大小可以通过控制交联剂与葡聚糖的比例来达到。因此，它具有筛分效应。用它作为填充材料制成层析柱，可以根据被分离物质的大小进行分离。已有不同型号的葡聚糖凝胶用于不同的物质的分离。当蛋白质混合样品随洗脱液向下流动时，比凝胶颗粒孔径大的蛋白质分子不能进入凝胶网格内，被排阻在凝胶颗粒的外部，比凝胶颗粒孔径小的蛋白质分子则能进入到网格内部。其结果是，分子大的蛋白质则随着洗脱液直接从柱上流出，分子比较小的蛋白质则因走了许多“弯路”而被后洗脱下来，分子愈小，“弯路”走得愈多，洗出的速度愈慢。据这一原则，上述蛋白质混
49、合物从S e p h a d e x-5 0洗脱出的顺序是：b c a d。1 0.（1）由于肽键因共振结构而使C-N键具有部分双键的性质，不能自由旋转，因而使得一条多肽主链构象的数目受到了极大限制。（2）与位于相邻刚性平面交线上的C 0相连接的侧链基团的结构，大小和性质对于主链构象的形成及稳定有很大的影响，使多肽链主链构象数目又受到很大限制。因 为C“与两个刚性平面连接的单键的旋转度不同程度受到侧链的限制。（3）各种侧链基团相互作用所形成的各种力使蛋白质在热力学上达到了一种最稳定的构象。11.（1）由a条酸水解所得肽段成分分析可知，该肽段为9肽；由b条竣肽酶A水 解 切 下 的 氨 基 酸
50、为Ala,所 以 此 肽C端 为Ala,即：一.Ala。（2）据胰蛋白酶水解所得各肽段成分分析（C条）可 得 出 含（Ala；Met；Ser）的肽段在C端，即：一 一,一,一,一 一 Met Ser Ala 或,Ser Met,Ala（3）由CNBr水解所得结果（d条）可进而得出：,Met Ser,Ala（4）由嗜热菌蛋白酶切下的片段（e条）可得出：一 一 一 Phe Lys,Lys,Met,Ser,Ala由（3）（9）（4）可重叠出：Ala,ArgAla Arg,SerSer Phe Lys所以从N端起肽顺序应为Ala,Arg,Ser,Phe,L ys,再 根 据（4）的结果，此肽的一级结构