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1、会计学 1染色体显带原理(yunl)与技术第一页，共80 页。一、染色体制备(zhbi)基础知识（一）细胞(xbo)及细胞(xbo)周期（二）从DNA 到染色体第1 页/共80 页第二页，共80 页。（一）细胞周期及有丝分裂（一）细胞周期及有丝分裂(y(yu s fn li)u s fn li)细胞：生物体结构和功能的基本单位，也是生命活动 细胞：生物体结构和功能的基本单位，也是生命活动(hu dng)(hu dng)的基本单位。图 的基本单位。图略。略。细胞周期：指由细胞分裂结束到下一次细胞分裂结束所经历的过程。细胞周期：指由细胞分裂结束到下一次细胞分裂结束所经历的过程。G1 期，指从有丝分
2、裂完成到期DNA 复制之前的间隙(jin x)时间；S 期，指DNA 复制的时期；G2 期，指DNA 复制完成到有丝分裂开始之前的一段时间；M 期，细胞分裂开始到结束。G0 期：间期细胞，细胞周期之外的细胞。第2 页/共80 页第三页，共80 页。有丝分裂 有丝分裂(y(y u s u s fn li)fn li)第3 页/共80 页第四页，共80 页。（二（二）从）从DNA到到染色体染色体DNA螺线管超螺线管染色(rns)单体核小体压缩(y su)7倍压缩(y su)40倍压缩6倍压缩5倍共计压缩8400倍第4 页/共80 页第五页，共80 页。核小体 nucleosome：染色质的基本(j
3、bn)结构第5 页/共80 页第六页，共80 页。DNA 分子的不同(b tn)存在形式：染色质和染色体n n 染色质：间期细胞核中遗传物质的存在形式。n n 染色体：分裂中期(zhngq)遗传物质的存在形式。一条染色体是一个DNA 分子。第6 页/共80 页第七页，共80 页。染色质：根据(gnj)在分裂期和间期的染色不同，分为n n 常染色质：在间期核中分布较稀 常染色质：在间期核中分布较稀疏，浅染色，是转录活跃的 疏，浅染色，是转录活跃的DNA DNA 部分，一般位于核中央。部分，一般位于核中央。在分裂期，位于染色体臂，深染 在分裂期，位于染色体臂，深染色。含大量功能基因。色。含大量功能
4、基因。n n 异染色质：是呈凝集状态的 异染色质：是呈凝集状态的DNA DNA 与组蛋白的复合物，由于 与组蛋白的复合物，由于螺旋 螺旋(luxun)(luxun)化程度高，又称 化程度高，又称为浓缩染色质，一般位于核内膜 为浓缩染色质，一般位于核内膜的边缘形成一薄圈，即称周围染 的边缘形成一薄圈，即称周围染色质。主要位于位于染色体的着 色质。主要位于位于染色体的着丝粒、次缢痕、端粒等位置。间 丝粒、次缢痕、端粒等位置。间期和分裂期都深染色。基本无功 期和分裂期都深染色。基本无功能基因。能基因。第7 页/共80 页第八页，共80 页。基本概念n n 在 在 细 细 胞 胞 周 周 期 期 的
5、的 有 有 丝 丝 分 分 裂 裂 中 中 期 期(zhngq)(zhngq)，染 染 色 色 体 体 的 的 形 形 态 态 结 结 构 构比 比 较 较 稳 稳 定 定，一 一 般 般 所 所 描 描 述 述 的 的 染 染 色 色 体 体 的 的 形 形 态 态 结 结 构 构 都 都 是 是 中 中 期 期(zhngq)(zhngq)染色体。染色体。n n 染 染 色 色 体 体 组 组 型 型：又 又 称 称 核 核 型 型Karyotype Karyotype，是 是 指 指 将 将 动 动 物 物、植 植 物 物、真 真 菌 菌等 等 的 的 某 某 一 一 个 个 体 体 或
6、或 某 某 一 一 分 分 类 类 群 群（亚 亚 种 种、种 种、属 属 等 等）的 的 体 体 细 细 胞 胞 内 内的整套染色体，按它们相对恒定的特征排列起来的图像。的整套染色体，按它们相对恒定的特征排列起来的图像。n n 核 核 型 型 模 模 式 式 图 图Idiogram Idiogram：是 是 指 指 将 将 一 一 个 个 染 染 色 色 体 体 组 组 的 的 全 全 部 部 染 染 色 色 体 体 逐 逐个 个 按 按 其 其 特 特 征 征 绘 绘 制 制 下 下 来 来，再 再 按 按 长 长 短 短、形 形 态 态 等 等 特 特 征 征 排 排 列 列 起 起 来
7、 来 的 的 图 图像。像。第8 页/共80 页第九页，共80 页。二、染色体显带技术(jsh)第9 页/共80 页第十页，共80 页。Q Q 带：喹丫因染色后，紫外照射下的明暗带（富含 带：喹丫因染色后，紫外照射下的明暗带（富含AT AT 的明带，富 的明带，富含 含GC GC 的暗带）；的暗带）；G G 带：带：Giemsa Giemsa 染料 染料(r(r nlio)nlio)染色后所呈现的染色体区带；（染色后所呈现的染色体区带；（AT AT 区是 区是深色）深色）R R 带：是中期染色体经碱性磷酸盐处理，丫啶橙或 带：是中期染色体经碱性磷酸盐处理，丫啶橙或Giemsa Giemsa 染
8、色后 染色后所呈现的带型，一般与 所呈现的带型，一般与G G 带正好相反；带正好相反；C C 带：显示着丝粒结构异染色质及其它染色体区段的异染色质。带：显示着丝粒结构异染色质及其它染色体区段的异染色质。T T 带：是染色体端粒部位经丫啶橙染色后呈现的区带；带：是染色体端粒部位经丫啶橙染色后呈现的区带；N N 带：带：Ag-As Ag-As 染色，主要染核仁组织者区域的酸性蛋白。染色，主要染核仁组织者区域的酸性蛋白。1975 1975 年建立了染色体高分辨显带技术。年建立了染色体高分辨显带技术。第10 页/共80 页第十一页，共80 页。几种 几种(j(j zh zh n n)显带的制作方法之间
9、的关系 显带的制作方法之间的关系第11 页/共80 页第十二页，共80 页。G 显带实验原理(yunl)基础G 显带：制备的染色体标本经胰蛋白酶消化、Giemsa 染色后，可在染色体纵轴上显示出着色深、浅相间的横纹带，表明每条染色体的特征。n n 只有可以分裂的活细胞，才能制备染色体。实验材料：人外周血淋巴细胞，植物血凝素 只有可以分裂的活细胞，才能制备染色体。实验材料：人外周血淋巴细胞，植物血凝素（PHA PHA）刺激血中的淋巴细胞转化成淋巴母细胞，使其恢复增殖能力。）刺激血中的淋巴细胞转化成淋巴母细胞，使其恢复增殖能力。n n 使用秋水仙素或者秋水仙碱破坏纺锤丝的形成，将细胞阻留在有丝分裂
10、 使用秋水仙素或者秋水仙碱破坏纺锤丝的形成，将细胞阻留在有丝分裂(y(y u s fn li)u s fn li)中期。从 中期。从而获得大量的细胞中期分裂相供染色体分析。而获得大量的细胞中期分裂相供染色体分析。-采取少量外周静脉血，做短期培养，培养至 采取少量外周静脉血，做短期培养，培养至 72 72小时细胞进入增殖旺盛期，此时加入秋水仙素抑制细胞分裂，使细胞分裂停止在中期以获得 小时细胞进入增殖旺盛期，此时加入秋水仙素抑制细胞分裂，使细胞分裂停止在中期以获得足够量的分裂期细胞。足够量的分裂期细胞。n n 细胞低渗技术使细胞中的染色体在玻片上铺散得更好，易于计数和观察。细胞低渗技术使细胞中的
11、染色体在玻片上铺散得更好，易于计数和观察。n n 甲醇 甲醇/冰醋酸固定液快速杀死和固定细胞。冰醋酸固定液快速杀死和固定细胞。第12 页/共80 页第十三页，共80 页。染色体检查(jinch)过程（G 显带）1.1.培养细胞；2.2.秋水仙素处理；抑制中期分裂相3.3.低渗；使细胞膨胀4.4.固定；染色体形态固定5.5.滴片；分散染色体。冰片法，熏蒸(xnzhng)法。6.6.显带和染色；7.7.显微镜下分析。第13 页/共80 页第十四页，共80 页。n n 实验步骤 实验步骤n n 1.1.采血及接种培养 采血及接种培养n n 1.1 1.1 采血：灭菌注射器抽取外周静脉血 采血：灭菌注
12、射器抽取外周静脉血35ml(35ml(绿帽肝 绿帽肝素抗凝管）素抗凝管）n n 1.2 1.2 接种 接种 在超净工作台中，注射器滴加 在超净工作台中，注射器滴加25 25 滴全血（滴全血（6 6 号 号针头）至外周血淋巴细胞培养液中（针头）至外周血淋巴细胞培养液中（5ml 5ml，含植物血，含植物血凝素 凝素60mg/ml 60mg/ml、10%10%小牛血清），水平摇动混匀。置 小牛血清），水平摇动混匀。置37 37 恒温培养箱中培养 恒温培养箱中培养6872 6872 小时。小时。n n 1.3 1.3 终止培养前 终止培养前3540min 3540min，加入秋水仙素，使终浓度，加入秋
13、水仙素，使终浓度达到 达到0.5g/ml 0.5g/ml。轻轻摇动培养瓶，使秋水仙素混匀。轻轻摇动培养瓶，使秋水仙素混匀。继续培养。继续培养。n n 秋水仙素主要作用在于能阻滞微管 秋水仙素主要作用在于能阻滞微管(纺锤丝 纺锤丝)形成，或 形成，或使已形成的微管 使已形成的微管n n 解聚，从而使染色体停留在中期。解聚，从而使染色体停留在中期。n n 秋水仙素浓度大，则处理时间短，如浓度小，则处理 秋水仙素浓度大，则处理时间短，如浓度小，则处理时间长。但若秋水仙素加入过量，或处理时间过长，时间长。但若秋水仙素加入过量，或处理时间过长，分裂细胞多，染色体凝集和收缩变小，或发生异常 分裂细胞多，染
14、色体凝集和收缩变小，或发生异常(ychng)(ychng)分裂现象，甚至染色体破碎，不宜用于观 分裂现象，甚至染色体破碎，不宜用于观察染色体的形态及计数；秋水仙素加入太少，或处理 察染色体的形态及计数；秋水仙素加入太少，或处理时间偏短，染色体形态偏长或无中期分裂相。时间偏短，染色体形态偏长或无中期分裂相。第14 页/共80 页第十五页，共80 页。n n 2 2 制片 制片n n 2.1 2.1 收集细胞：将全部培养物吸入刻度离心管中，收集细胞：将全部培养物吸入刻度离心管中，2000 rpm 2000 rpm 离心 离心5 5 分钟 分钟n n 2.2 2.2 低渗：弃上清液，加入 低渗：弃上
15、清液，加入37 37 预温的 预温的 0.075 mol/L KCl 0.075 mol/L KCl 溶液 溶液8 ml 8 ml，用吸管轻轻吹打细胞团混，用吸管轻轻吹打细胞团混匀后，置 匀后，置37 37 恒温水浴箱低渗处理 恒温水浴箱低渗处理2025 2025 分钟。分钟。n n 2.3 2.3 预固定：加入 预固定：加入 1ml 1ml 新配制的固定剂（甲醇 新配制的固定剂（甲醇(ji(ji chn)chn)：冰乙酸：冰乙酸=3=3：1 1）或清质剂）或清质剂300ul 300ul，用吸，用吸管小心吹打、混匀，管小心吹打、混匀，2000rpm 2000rpm 离心 离心5 5 分钟。分钟
16、。n n 2.5 2.5 固定：固定：n n 第一次：弃上清液，加入 第一次：弃上清液，加入3ml 3ml 固定剂，吹打细胞团制成细胞悬液后，室温下固定 固定剂，吹打细胞团制成细胞悬液后，室温下固定15 15 分钟，分钟，2000rpm 2000rpm 离心 离心5 5 分钟。分钟。n n 第二次：弃上清液，重复固定一次。第二次：弃上清液，重复固定一次。n n 第三次：第三次：弃上清液，根据细胞数量的多少适当加入数滴新配制的固定剂，吹打细胞制成悬 弃上清液，根据细胞数量的多少适当加入数滴新配制的固定剂，吹打细胞制成悬液。液。n n 2.6 2.6 滴片：滴片：吸取少量细胞悬液，滴 吸取少量细胞
17、悬液，滴2 2 3 3 滴于冰水浸泡过的载玻片上，吹散，水蒸气熏蒸，滴于冰水浸泡过的载玻片上，吹散，水蒸气熏蒸，70 70 2 2 小时烤片，待染色。小时烤片，待染色。第15 页/共80 页第十六页，共80 页。n n 3.G 显带n n 3.1 取2.5 胰酶溶液0.5ml，加入50 ml 生理盐水染色缸中（终浓度0.025%），用 1N HCl 或1N NaOH 调节PH7.0 左右，置 37OC预温。n n 3.2 将烤好的玻片标本放入胰酶溶液中处理60 秒钟左右（胰酶消化时间需不断调试，摸索。不同时间配制，不同批号胰酶，以及随着(su zhe)处理标本数量增加，胰酶逐渐消耗，胰酶作用时
18、间都会变化）n n 3.3 取出染色体玻片标本，置于37 预温的生理盐水中，终止胰酶的作用。n n 3.4 将玻片标本放入37 预温的1：10 稀释的Giemsa 染液中，染色5 10 分钟。n n 3.5 自来水冲洗，自然晾干。第16 页/共80 页第十七页，共80 页。第17 页/共80 页第十八页，共80 页。G 显带常见问题及处理(chl)：1.1.培 培 养 养 细 细 胞 胞:细 细 菌 菌 污 污 染 染。霉 霉 菌 菌(mjn)(mjn)污 污 染 染。细 细 胞 胞 收 收获量小。玻片上细胞间期核稀疏。获量小。玻片上细胞间期核稀疏。2.2.秋 秋 水 水 仙 仙 素 素：大
19、大 量 量 染 染 色 色 体 体 太 太 细 细 长 长，缠 缠 成 成 毛 毛 线 线 团 团 样 样。分 分裂 裂 相 相 很 很 多 多，但 但 染 染 色 色 体 体 短 短 小 小，分 分 叉 叉。几 几 乎 乎 没 没 有 有 分 分 裂 裂相。相。3.3.低渗：太分散。不分散。低渗：太分散。不分散。4.4.固定：太发毛。背景不干净。有大团块深染色物质。固定：太发毛。背景不干净。有大团块深染色物质。5.5.滴片；不分散。太分散。滴片；不分散。太分散。6.6.显 显 带 带 和 和 染 染 色 色；没 没 有 有 条 条 带 带。条 条 带 带 模 模 糊 糊。一 一 个 个 分
20、分 裂 裂 相 相 内 内，有 有 的 的 染 染 色 色 体 体 有 有 条 条 带 带，有 有 的 的 没 没 有 有。有 有 的 的 胰 胰 蛋 蛋 白 白 酶 酶 消 消 化 化太 太 过 过，有 有 的 的 分 分 裂 裂 相 相 则 则 不 不 足 足。Giemsa Giemsa 染 染 不 不 上 上 色 色。染 染 色 色太深。染色太浅。太深。染色太浅。第18 页/共80 页第十九页，共80 页。各种组织(zzh)标本的染色体制作不同的标本，不同的检查目的，需要调整染色体的制作过程。处理(chl)原则：使尽可能多的细胞进入细胞周期，旺盛生长，大量分裂，防止污染。第19 页/共8
21、0 页第二十页，共80 页。n n 外周血：外周血：5%5%小牛血清 小牛血清RPMI-1640 RPMI-1640，+PHA+PHA。检查。检查(ji(ji nch)nch)体细胞核型。体细胞核型。n n 骨髓：骨髓：10%10%小牛血清 小牛血清RPMI-1640 RPMI-1640，不含，不含PHA PHA。检查。检查(ji(ji nch)nch)肿瘤细胞核型。肿瘤细胞核型。n n 羊水：标本珍贵。专用羊水培养基，防止母体细胞 羊水：标本珍贵。专用羊水培养基，防止母体细胞污染。检查 污染。检查(ji(ji nch)nch)胎儿细胞核型。胎儿细胞核型。n n 绒毛组织：绒毛组织：同上。细胞
22、为细胞团（组织），防止 同上。细胞为细胞团（组织），防止细菌污染。清洗、剪碎后消化成单细胞或者细胞团 细菌污染。清洗、剪碎后消化成单细胞或者细胞团培养。检查 培养。检查(ji(ji nch)nch)胎儿核型。胎儿核型。n n 脐带血：血液细胞，性质同外周血。一定注意防止 脐带血：血液细胞，性质同外周血。一定注意防止母体污染！检查 母体污染！检查(ji(ji nch)nch)胎儿核型。胎儿核型。n n 活检组织：如实体瘤标本。活检组织：如实体瘤标本。n n 细胞系：永生细胞。直接常规制作染色体标本即可。细胞系：永生细胞。直接常规制作染色体标本即可。第20 页/共80 页第二十一页，共80 页。C
23、 显带 将染色(rns)体用碱或者去垢剂处理后，再用 Giemsa 染色(rns)，可以得到只显示着丝粒区域的带纹，称为 C 带。第21 页/共80 页第二十二页，共80 页。实验(shyn)原理 C 显 带 技 术 由 Arrighi 和 Hsu 于1971 年 发 明，是 显 带 技 术 中 最 简单(jindn)的 一 种 带 型。其 方 法的 本 身 是 起 源 于 原 位 杂 交。Arrighi 和Hsu 发 现 用 碱 处 理 载 玻 片上 的 染 色 体 使DNA 变 性 之 后，再在SSC 溶 液 中、65 的 条 件 下 使其 复 性，在 受 控 制 的 条 件 下 经Gie
24、msa 染 色 可 显 示 出 在 染 色 体 的一 定 部 位 是 深 染 的。70 年 代 用 原位 杂 交 的 方 法 证 明 深 染 的 区 域（C 带 区）是 结 构 异 染 色 质 的 区域，也 就 是 一 般 而 言 的DNA 高 度重 复 序 列 的 区 域。然 而，现 在 更为 流 行 的 看 法 认 为 氢 氧 化 钡 或 其它 碱 性 物 质 的 处 理 是 优 先 提 取 了非C 带 区 的DNA，SSC 的 处 理 有 助于带型的清晰。第22 页/共80 页第二十三页，共80 页。实验(shyn)用品 光学显微镜，恒温水浴箱，培养皿，小镊子，未染色的染色体标本片（片龄
25、一周(y zhu)内），5%氢氧化钡水溶液，2SSC 液，0.2mol/L HCl，PBS，吉姆萨染液。第23 页/共80 页第二十四页，共80 页。实验(shyn)方法1 1、制片：常规外周血法制备、制片：常规外周血法制备(zhbi)(zhbi)的标本。的标本。2 2、HCl HCl 处 处 理 理：取 取5-7 5-7 天 天 标 标 本 本 龄 龄 的 的 染 染 色 色 体 体 标 标 本 本，选 选 择 择 染 染 色 色 体 体 分 分 散 散 好 好 的 的 标 标本 本 在 在0.2mol/L 0.2mol/L HCl HCl 中 中 室 室 温 温 下 下 处 处 理 理10
26、 10 分 分 钟 钟-1-1 小 小 时 时，然 然 后 后 用 用 自 自 来 来（蒸 蒸馏 馏）水 水 冲 冲 洗 洗 干 干 净 净。这 这 一 一 处 处 理 理 是 是 使 使DNA DNA 脱 脱 嘌 嘌 呤 呤，但 但 没 没 有 有DNA DNA 骨 骨 架 架的断裂。（此步也可省略）的断裂。（此步也可省略）3 3、氢 氢 氧 氧 化 化 钡 钡 处 处 理 理：将 将 标 标 本 本 浸 浸 入 入60-65 60-65 的 的5%5%（饱 饱 和 和）氢 氢 氧 氧 化 化 钡 钡 液 液 中 中，10 10 秒 秒 至 至 几 几 分 分 钟 钟（随 随 标 标 本 本
27、 龄 龄 而 而 变 变 动 动，常 常 规 规：1-4 1-4 分 分 钟 钟；1 1 月 月 龄 龄 片 片：8-8-16 16 分 分 钟 钟，最 最 好 好 设 设 置 置 梯 梯 度 度），碱 碱 性 性 处 处 理 理 可 可 能 能 通 通 过 过 产 产 生 生 一 一 个 个 高 高 水 水 平 平的 的DNA DNA 变性，促进 变性，促进DNA DNA 溶解。溶解。第24 页/共80 页第二十五页，共80 页。4 4、2SSC 2SSC 处 处 理 理：在 在60-65 60-65 的 的2SSC 2SSC 液 液 中 中 处 处 理 理90 90 分 分 钟 钟 时 时
28、，用 用 自 自来 来 水 水 冲 冲 洗 洗 干 干 净 净，2SSC 2SSC 温 温 育 育 可 可 使 使DNA DNA 骨 骨 架 架 断 断 裂 裂 并 并 使 使 断 断 片 片溶解 溶解(rngji)(rngji)。5 5、染 染 色 色：用 用 蒸 蒸 馏 馏 水 水 配 配 制 制5%Giemsa 5%Giemsa，染 染 色 色5-10 5-10 分 分 钟 钟，用 用 自 自 来 来 水 水冲洗干净，室温下风干后即可镜检。冲洗干净，室温下风干后即可镜检。6 6、镜 镜 检 检：用 用 显 显 微 微 镜 镜 高 高 倍 倍 镜 镜 镜 镜 下 下 检 检 查 查 显 显
29、 带 带 标 标 本 本，如 如 着 着 丝 丝 粒 粒 区 区 域 域或 或 异 异 染 染 色 色 质 质 部 部 位 位（1,9,16 1,9,16 号 号 染 染 色 色 体 体 次 次 缢 缢 痕 痕）及 及Y Y 染 染 色 色 体 体 长 长臂 臂q12 q12 深 深 染 染，染 染 色 色 体 体 其 其 它 它 部 部 位 位 染 染 色 色 浅 浅，即 即 为 为 可 可 取 取 标 标 本 本。若 若观 观 察 察 到 到 染 染 色 色 体 体 均 均 呈 呈 白 白 色 色，那 那 么 么，可 可 能 能 是 是 碱 碱 处 处 理 理 或 或2SSC 2SSC温育
30、过度。温育过度。第25 页/共80 页第二十六页，共80 页。显带观察(gunch)严格地讲，C 带显示(xinsh)的是紧邻着丝粒的异染色质区。可见，在人体染色体C 带标本中，深染的有：1、绝大多数染色体的着丝粒区；2、第1，9 和16 号染色体的次缢痕；3、Y 染色体长臂的远侧端。第26 页/共80 页第二十七页，共80 页。巴黎会议（巴黎会议（1971 1971）对各条染色体的）对各条染色体的C C 带描述如下 带描述如下:1 1 号 号 大，从着丝粒扩展到 大，从着丝粒扩展到q q。2 2 号 号 小。小。3-8 3-8 号 号 中等 中等(zhngdng)(zhngdng)9 9 号
31、 号 大，从着丝粒扩展到 大，从着丝粒扩展到q q。10 10 号 号 中等 中等(zhngdng)(zhngdng)。11 11 号 号 中等 中等(zhngdng)(zhngdng)，但比，但比10 10 号或 号或12 12 号大些。号大些。12 12 号 号 中等 中等(zhngdng)(zhngdng)。13 13 号 号 中等 中等(zhngdng)(zhngdng)，有时分为二节。，有时分为二节。14 14 号 号-15-15 号 号 中等 中等(zhngdng)(zhngdng)。16 16 号大，从着丝粒向 号大，从着丝粒向q q 扩展。扩展。第27 页/共80 页第二十八页
32、，共80 页。17 号 中等。18 号 中等，但比17 号大些。19-22 号 中等。X 中等 Y 在着丝粒处有一条非常窄的带；q 的末端有一宽带(kun di)。1，9，16 号的C 带和Yq 上的宽阔的远侧带都有明显的形态变异及异态性。第28 页/共80 页第二十九页，共80 页。第29 页/共80 页第三十页，共80 页。第30 页/共80 页第三十一页，共80 页。R 显带 原理：在细胞的培养过程中加入碱基的类似物，然后用紫外线照射后再用 Giemsa 染料染色，可以得到(d do)和 G 显带相反的带纹，称为 R 带。即G 显带的深带变为浅带，浅带染成深带。当G 显带显示的染色体两臂
33、末端为浅带时，如果两臂末端发生缺失等异常，一般难以发现和识别，而R 带正好能将此处显示出易于识别的深带。所以，R 显带技术有利于检测染色体的末端缺失、重排等。第31 页/共80 页第三十二页，共80 页。光学显微镜、恒温水浴箱、紫外灯、培养皿、光学显微镜、恒温水浴箱、紫外灯、培养皿、常规 常规(chnggu)(chnggu)制片材料、制片材料、BrdU BrdU、秋水仙素、秋水仙素、2SSC 2SSC 溶 溶液（液（0.3mol/L NaCl+0.03mol/L 0.3mol/L NaCl+0.03mol/L 柠檬酸钠）、柠檬酸钠）、Gimesa Gimesa 染液等。染液等。实验(shyn)
34、用品第32 页/共80 页第三十三页，共80 页。实验(shyn)方法 1.常规培养细胞，终止前10 小时在培养基中加BrdU（使其终浓度为12g/ml）。2.继续培养6 小时后加秋水仙素20g/ml 的3 滴（7 号针头垂直竖滴，使终浓度为0.04-0.08g/ml）。3.常规收获、处理细胞，制片。4.在60 恒温水浴箱中，置一培养皿于水面上（皿内加1/3 2SSC溶液，将所制玻片浸泡在内）。距玻片10cm 处放置一20 瓦紫外灯，照射玻片30-45 分钟。5.待紫外处理时间结束后，用自来水冲净。6.Gimesa 染色5 分钟，自来水冲净，室温干燥(gnzo)后于镜下观察。第33 页/共80
35、 页第三十四页，共80 页。注意：1.Brdu 的浓度和作用时间是实验成败(chngbi)的关键。2.紫外灯照射距离玻片太远也不利于带型的显示。3.若为女性标本，还可见淡染的迟复制X。第34 页/共80 页第三十五页，共80 页。显带观察(gunch)各号染色体显现的带纹与G 显带相反(xingfn)，在G 带染色体标本出现的深带用R 显带法就是浅带，同时在G 显带染色体标本出现的浅带用R 显带法就是深带。与G 显带的对比图：第35 页/共80 页第三十六页，共80 页。R 显带总体(zngt)图第36 页/共80 页第三十七页，共80 页。第37 页/共80 页第三十八页，共80 页。G11
36、 技术(jsh)G11 式显带是一种(y zhn)特异性显示9 号染色体次缢痕的显带方法，一般用于9 号染色体次缢痕多态分析、家系调查，亲子鉴定等研究以及9 号染色体倒位的细胞遗传学分析。第38 页/共80 页第三十九页，共80 页。实验(shyn)用品 光学显微镜、恒温水浴箱、染色缸、自制新鲜(xn xin)染色体玻片、吸管、计时器、pH 试纸、蒸馏水、0.1N 氢氧化钠、Gimesa 染液等。第39 页/共80 页第四十页，共80 页。实验(shyn)方法1.1.3 ml Gimesa 原液中加入蒸馏水47 ml，混匀，用氢氧化钠调pH 至11。2.2.将染色体玻片放入其中染色5 分钟左右
37、。3.3.自来水冲洗，干燥。4.4.观察可见9 号染色体次缢痕染成紫红色，其它染色体长短(chngdun)臂均显示蓝色。第40 页/共80 页第四十一页，共80 页。注意事项：1、染色体玻片片龄一般不要超过一周(y zhu)，且在显 带之前最好再次75 烤片5 分钟。2、pH 值为11 是显带成功的关键。3、染色时间可先摸索，如整个背景为蓝色、次 缢痕未出现，可相应地延长染色时间；如整 个背景为紫红色、次缢痕不明显则可相应地缩短染色时间。第41 页/共80 页第四十二页，共80 页。显带观察显带观察(gunch)(gunch)：99号长臂次缢痕显紫色号长臂次缢痕显紫色 第42 页/共80 页第
38、四十三页，共80 页。Q 显带 70 70 年代初期，瑞典的化学家 年代初期，瑞典的化学家 Caspersson Caspersson 首先用荧光染料 首先用荧光染料喹丫因氮芥 喹丫因氮芥(Quinacrine Mustard)(Quinacrine Mustard)处理染色体标本，发现在 处理染色体标本，发现在荧光显微镜下每条染色体出现了宽窄 荧光显微镜下每条染色体出现了宽窄 和亮度不同的辉纹，和亮度不同的辉纹，即荧光带，而各条染色体有其独特的带，由此可以清楚地 即荧光带，而各条染色体有其独特的带，由此可以清楚地鉴别 鉴别(jinbi)(jinbi)人类的每一条染色体，称为 人类的每一条染色
39、体，称为 Q Q 带。带。第43 页/共80 页第四十四页，共80 页。实验(shyn)原理 染 染 色 色 体 体 用 用 一 一 种 种 易 易 结 结 合 合 于 于 富 富 含 含AT AT 的 的DNA DNA 的 的 荧 荧 光 光 染 染 料 料 染 染 色 色，如 如quinacrine quinacrine，DAPI DAPI 或 或Hoechst33258 Hoechst33258，通 通 过 过UV UV 荧 荧 光 光 显 显 微 微 镜 镜可 可 以 以 观 观 察 察 染 染 色 色 体 体 显 显 示 示 亮 亮 度 度(lingd)(lingd)不 不 同 同
40、的 的 带 带 纹 纹，Q Q 显 显 带 带 的 的带 带 纹 纹 与 与G G 显 显 带 带 的 的 非 非 常 常 相 相 似 似，亮 亮 带 带 相 相 当 当 于 于G G 显 显 带 带 的 的 深 深 带 带，暗 暗带相当于 带相当于G G 显带的浅带。显带的浅带。第44 页/共80 页第四十五页，共80 页。实验(shyn)用品 光学显微镜、恒温水浴 光学显微镜、恒温水浴(shu(shu y)y)箱、立式染色缸、箱、立式染色缸、人外周血淋巴细胞染色体玻片标本（人外周血淋巴细胞染色体玻片标本（75 75 中烤片 中烤片3 3 小 小时，未经染色）。时，未经染色）。pH6.0 p
41、H6.0 缓冲液，缓冲液，Soresens Soresens 缓冲液 缓冲液(pH6.0)(pH6.0)、pH6.0 pH6.0 的磷酸缓冲液。的磷酸缓冲液。第45 页/共80 页第四十六页，共80 页。实验(shyn)方法 将标本置于pH6.0 缓冲液中浸5 10 分钟 后，再转浸入用Soresens 缓冲液(pH6.0)配制 的0.2%的喹吖因、阿的平染液中染色5 10 分钟，用pH6.0 的磷酸缓冲液漂洗2 次，每次 5 分钟，于玻片上滴加1 2 滴新鲜(xn xin)缓冲液，加盖片，在荧光显微镜下观察。第46 页/共80 页第四十七页，共80 页。Caspersson Casperss
42、on等（等（19711971）的方法）的方法(fngf(fngf)：n n 取用空气干燥标本(biobn)的玻片 浸入95%、70%、50%的乙醇和蒸馏水使其吸水 浸入pH7 的柠檬酸/磷酸盐缓冲液中 用预温至20 芥子喹吖因（50ug/ml）染液染色20 分钟 在上述缓冲液中漂洗三次，每次5 分种 然后用缓冲液盖片封存 在荧光显微镜下观察。第47 页/共80 页第四十八页，共80 页。显带观察(gunch)带型与 带型与G G 显带标本一致，荧光显微镜下观察染色体上呈现出 显带标本一致，荧光显微镜下观察染色体上呈现出的亮带就相当于 的亮带就相当于G G 显带染色体标本的深带。显带染色体标本的
43、深带。1 1 号染色体：号染色体：短臂由远端的弱荧光节段逐渐 短臂由远端的弱荧光节段逐渐(zhjin)(zhjin)过渡到一中等 过渡到一中等荧光节端，后者可分为两条带。长臂有 荧光节端，后者可分为两条带。长臂有5 5 条中等荧光带，中央 条中等荧光带，中央一条最明显，次缢痕的荧光阴性。一条最明显，次缢痕的荧光阴性。第48 页/共80 页第四十九页，共80 页。第49 页/共80 页第五十页，共80 页。显带 此技术可以(ky)使13、14、15、21 和22 号染色体的随体和随体柄着色。第50 页/共80 页第五十一页，共80 页。实验实验(shyn)(shyn)原理原理 人类的近端着丝粒染
44、色体(即13、14、15、21 和22 号染色体)的副缢痕处与核仁形成有关，故称核仁形成区（nucleolus-organizing region，NOR），它是中期染色体上的明显结构(jigu)之一。应用DNA-RNA分子杂交技术,证明人类的18S和28S 核糖体RNA(rRNA 编码结构(jigu)的基因(rDNA)位于NOR。目前已有多种技术可以显示中期染色体上的核仁形成区。第51 页/共80 页第五十二页，共80 页。其其中中最最简简单单而而又又准准确确的的方方法法是是银银染染法法,即即利利用用硝硝酸酸银银将将具具有有转转录录活活性性的的核核仁仁形形成成区区(rRNA(rRNA基基因因
45、)特特异异性性地地染染成成黑黑色色,人人们们将将这这种种银银染染阳阳性性的的核核仁仁形形成成区区称称为为Ag-Ag-NOR,NOR,它们是具有转录它们是具有转录 活活性性的的18SrRNA18SrRNA基基因因和和28SrRNA28SrRNA基基因因所所在在的部位。的部位。由由于于具具有有转转录录活活性性的的rRNArRNA基基因因(rDNA)(rDNA)往往往往伴伴有有丰丰富富的的酸酸性性蛋蛋白白质质,该该类类蛋蛋白白质质含含有有巯巯基基（-SH-SH）和和二二硫硫键键（-S-S-S-S-）,能能使使AgNO3AgNO3中中的的Ag+Ag+还还原原成成AgAg颗颗粒粒,因因此此有有转转录录活
46、活性性的的核核仁仁形形成成区区常常被被镀镀上上银银颗颗粒粒而而呈呈现现黑黑色色,没没有有转转录录活活性性的的NORNOR则则不不着着色色。故故其其着着色色程程度度与与细细胞胞中中rRNArRNA基基因因的的转转录录活活性性相相一一致致。在在同同一一物物种种，Ag-NORAg-NOR的的数数目目以以及及它它们们在在染染色色体体上上的的位位置置是是相相对对恒恒定定的的，如如果果(rgu(rgu)发发生生了了改改变变就就意意味味着着rRNArRNA基基因因的的活活性性发发生生了了变变化化，故故此此项项技技术是目前探讨术是目前探讨rRNArRNA基因功能的方法之一基因功能的方法之一第52 页/共80
47、页第五十三页，共80 页。此 外，人 类 近 端 着 丝 粒 染 色体 的 随 体 间 易 发 生 联 合，这 种 联合 可 能 是 造 成 近 端 着 丝 粒 染 色 体不 分 离、断 裂 和 易 位 的 原 因。利用 银 染 技 术 可 在 发 生 联 合 的 染 色体间清楚地看 到 有 银 染 物 质 相 连。因 此，银 染近 端 着 丝 染 色 体 联 合（Ag-stained acrocentric association,Ag-AA）可以 作 为 准 确 地 判 断 人 体 细 胞 是 否存 在 近 端 着 丝 粒 染 色 体 随 体 联 合的客观标准。目 前，也 将 Ag-AA
48、看 作 反 映(fnyng)rRNA 基 因 活 性 大 小 的 一个 指 标。所 以 银 染 技 术 已 逐 渐 受到 重 视，并 已 开 始 广 泛 应 用 于 肿瘤 细 胞 遗 传 学、体 细 胞 遗 传 学、进 化 遗 传 学、临 床 细 胞 遗 传 学 及药 物、化 学 因 素 等 的 遗 传 效 应 的研究上。第53 页/共80 页第五十四页，共80 页。实验(shyn)用品光学显微镜、恒温水浴箱、移液枪、培养皿（干燥(gnzo)）、吸管、擦镜纸、小镊子、未染色的染色体标本片（片龄一周以内）、硝酸银、甲酸、Giemsa 染液、一次性离心管（15ml）、去离子水、锡箔纸等。第54 页
49、/共80 页第五十五页，共80 页。实验(shyn)方法1 1、设一、设一60 60 水浴箱；另置 水浴箱；另置Giemsa Giemsa 染液缸于 染液缸于37 37 水浴箱。水浴箱。2 2、临 临 时 时 配 配 制 制 新 新 鲜 鲜 的 的AgNO3 AgNO3 溶 溶 液 液：取 取 一 一 次 次 性 性 离 离 心 心 管 管（15ml 15ml）一 一 支 支，称 称 取 取AgNO3 AgNO3 5g 5g 溶 溶 于 于10ml 10ml 去 去 离 离 子 子 水 水 中 中，加 加10ul 10ul 甲 甲酸，混匀。将一干燥培养皿漂于 酸，混匀。将一干燥培养皿漂于60
50、60 水浴箱水面上。水浴箱水面上。3 3、将玻片用、将玻片用4 4 层干净擦镜纸（略小于玻片大小）盖好。层干净擦镜纸（略小于玻片大小）盖好。4 4、用 用 吸 吸 管 管 将 将AgNO3 AgNO3 溶 溶 液 液 慢 慢 慢 慢(mn(mn mn)mn)滴 滴 于 于 玻 玻 片 片 纸 纸 上 上，直 直 至 至擦 擦 镜 镜 纸 纸 呈 呈 棕 棕 黄 黄 色 色（黑 黑 色 色）为 为 止 止，一 一 般 般5ml 5ml 能 能 滴 滴 两 两 张 张 玻 玻片。片。5 5、擦 擦 镜 镜 纸 纸 变 变 黑 黑 后 后，用 用 镊 镊 子 子 轻 轻 轻 轻 启 启 开 开 擦