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1、1 第七章第七章 酶工程制药酶工程制药234第一节第一节 概述概述一、一、酶工程酶工程简介（简介（Enzyme EngineeringEnzyme Engineering）酶工程是酶工程是酶学酶学和和工程学工程学相互渗透结合、相互渗透结合、发展而形成的一门新的技术学科。它是从发展而形成的一门新的技术学科。它是从应用的目的出发研究酶、应用酶的特异催应用的目的出发研究酶、应用酶的特异催化性能，并通过工程化将相应原料转化成化性能，并通过工程化将相应原料转化成有用物质的技术。有用物质的技术。6一一 、酶的基础知识、酶的基础知识（一）酶是生物催化剂（一）酶是生物催化剂酶是生物细胞产生的、具有催化能力的生
2、物催化酶是生物细胞产生的、具有催化能力的生物催化剂。剂。催化高效性催化高效性专一性专一性：结构专一性；结构专一性；立体异构专一性立体异构专一性酶具有不稳定性酶具有不稳定性7（二）酶的化学本质（二）酶的化学本质蛋白质蛋白质酶酶单纯酶单纯酶结合酶结合酶（全酶）（全酶）=酶蛋白酶蛋白+辅因子辅因子辅因子辅因子辅酶辅酶 与酶蛋白结合得比较松的小分子有机物。与酶蛋白结合得比较松的小分子有机物。辅基辅基 与膜蛋白结合得紧密的小分子有机物。与膜蛋白结合得紧密的小分子有机物。金属激活剂金属激活剂 金属离子作为辅助因子。金属离子作为辅助因子。8必需基团必需基团：这些基团若经化学修饰使其改变，则酶的活：这些基团若
3、经化学修饰使其改变，则酶的活性丧失。性丧失。活性部位活性部位：酶分子中直接与底物结合，并和酶催化作用：酶分子中直接与底物结合，并和酶催化作用直接有关的部位。直接有关的部位。必需基团必需基团活性部位活性部位维持酶的空间结构维持酶的空间结构结合基团结合基团催化基团催化基团专一性专一性催化性质催化性质105.5.有机相中酶反应有机相中酶反应的研究；的研究；6.6.酶的酶的抑制剂、激活剂抑制剂、激活剂的开发与应用研究；的开发与应用研究；7.7.抗体酶抗体酶、核酸酶核酸酶的研究；的研究；8.8.模拟酶、合成酶模拟酶、合成酶及酶分子的人工设计、合成研及酶分子的人工设计、合成研究。究。11三、酶的来源三、酶
4、的来源 酶的来源酶的来源：酶的生产目前多数直接从生物体中提：酶的生产目前多数直接从生物体中提取分离。非常少的是合成取分离。非常少的是合成,基因工程基因工程.早期酶的生产多以动植物为主要原料，如激肽释早期酶的生产多以动植物为主要原料，如激肽释放酶、菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶。近放酶、菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶。近1010年来，研年来，研究发展了动植物组织培养技术，但周期长、成本究发展了动植物组织培养技术，但周期长、成本高。工业生产一般都以微生物为主要来源。目前高。工业生产一般都以微生物为主要来源。目前使用的千余种商品酶，大多数是微生物生产的。使用的千余种商品酶，大多数是微生物生产的。其特点是：其特点是：
5、13目前常用的产酶微生物目前常用的产酶微生物E.coliE.coli ：是应用最广泛的产酶菌。分泌胞内酶，：是应用最广泛的产酶菌。分泌胞内酶，经细胞破碎分离得到。在工业上用于生产谷氨酸脱经细胞破碎分离得到。在工业上用于生产谷氨酸脱羧酶、天门冬氨酸酶、青霉素酰化酶、羧酶、天门冬氨酸酶、青霉素酰化酶、-半乳糖半乳糖苷酶苷酶枯草杆菌枯草杆菌：主要用于生产：主要用于生产-淀粉酶、淀粉酶、-葡萄糖氧葡萄糖氧化酶、碱性磷酸脂酶。化酶、碱性磷酸脂酶。15四、酶在医药领域的应用四、酶在医药领域的应用1.1.在疾病诊断方面的应用在疾病诊断方面的应用由于酶具有专一性强、催化效率高、作用条件温由于酶具有专一性强、催
6、化效率高、作用条件温和等显著的催化特点，酶学诊断已经发展成为可和等显著的催化特点，酶学诊断已经发展成为可靠、简便又快捷的诊断方法，具有广阔的应用前靠、简便又快捷的诊断方法，具有广阔的应用前景。景。酶学诊断方法包括两个方面，一是根据体内原有酶学诊断方法包括两个方面，一是根据体内原有酶活力的变化来诊断某些疾病，二是利用酶来测酶活力的变化来诊断某些疾病，二是利用酶来测定体内某些物质的含量，从而诊断某些疾病。定体内某些物质的含量，从而诊断某些疾病。16(1)(1)根据体内酶活力的变化诊断疾病根据体内酶活力的变化诊断疾病:一般健康人体内所含有的某些酶的量是恒定在某一般健康人体内所含有的某些酶的量是恒定在
7、某一范围的。当人们患上某些疾病时，则由于组织、一范围的。当人们患上某些疾病时，则由于组织、细胞受到损伤或者代谢异常而引起体内的某种或细胞受到损伤或者代谢异常而引起体内的某种或某些酶的活力发生相应的变化。故此，可以根据某些酶的活力发生相应的变化。故此，可以根据体内某些酶的活力变化情况，而诊断出某些疾病。体内某些酶的活力变化情况，而诊断出某些疾病。182.2.在疾病治疗方面的应用在疾病治疗方面的应用-酶类制剂酶类制剂 酶可以作为药物治疗多种疾病，用于治疗疾病的酶可以作为药物治疗多种疾病，用于治疗疾病的酶称为酶称为药用酶药用酶。药用酶具有疗效显著，副作用小。药用酶具有疗效显著，副作用小的特点，在疾病
8、的治疗方面的应用越来越广泛的特点，在疾病的治疗方面的应用越来越广泛19消化类消化类：研究最早，是品种最：研究最早，是品种最多的一类酶多的一类酶.在这一类酶中主要有胃蛋白酶、在这一类酶中主要有胃蛋白酶、胰酶、淀粉酶、纤维素酶、木胰酶、淀粉酶、纤维素酶、木瓜酶、凝乳酶、无花果酶、菠瓜酶、凝乳酶、无花果酶、菠萝酶等。萝酶等。健美生消化酶帮助肠胃蠕动20抗炎净创类抗炎净创类：目前在治疗上发展最快，用途最广：目前在治疗上发展最快，用途最广的一种。的一种。多数是多数是蛋白质水解酶蛋白质水解酶，分解发炎部位纤维蛋白的，分解发炎部位纤维蛋白的凝结物，消除伤口周围的坏疽、腐肉和碎屑。凝结物，消除伤口周围的坏疽、
9、腐肉和碎屑。其中有些酶能够分解脓液中的核蛋白使成简单的其中有些酶能够分解脓液中的核蛋白使成简单的嘌呤和嘧啶，降低脓液的粘性、达到净洁创口、嘌呤和嘧啶，降低脓液的粘性、达到净洁创口、消除痴皮、排除脓液抗炎消肿的目的。消除痴皮、排除脓液抗炎消肿的目的。主要有胰蛋白酶、糜蛋白酶、双链酶，主要有胰蛋白酶、糜蛋白酶、双链酶，-淀粉酶、淀粉酶、胰脱氧核糖核酸酶等。胰脱氧核糖核酸酶等。21血凝和解凝类血凝和解凝类：这类酶都是从血液中提取出来的。：这类酶都是从血液中提取出来的。凝血酶凝血酶的作用是促使血中纤维蛋白元变成不溶性的作用是促使血中纤维蛋白元变成不溶性纤维蛋白纤维蛋白,从而促使血液凝固，防止微血管出血
10、。从而促使血液凝固，防止微血管出血。纤维蛋白溶解酶纤维蛋白溶解酶的作用是溶解血块，为目前临床的作用是溶解血块，为目前临床上最新的一种酶制品上最新的一种酶制品,治疗血栓静脉炎、冠状动脉治疗血栓静脉炎、冠状动脉栓塞等。栓塞等。抑肽酶抑肽酶作为肽酶抑制剂，广泛应用于体外循环手作为肽酶抑制剂，广泛应用于体外循环手术，大剂量抑肽酶可明显减少心脏外科手术后的术，大剂量抑肽酶可明显减少心脏外科手术后的渗血，消除因心脏外科手术后渗血而导致的死亡渗血，消除因心脏外科手术后渗血而导致的死亡2224解毒类解毒类：主要作用是解除体内或因注射某种药物：主要作用是解除体内或因注射某种药物产生的一种有害物质。产生的一种有害
11、物质。主要品种有主要品种有青霉素酶青霉素酶、过氧化氢酶过氧化氢酶和和组织胺酶组织胺酶等。等。青霉素酶能够分解青霉素分子中的青霉素酶能够分解青霉素分子中的一内酰胺环，一内酰胺环，使变成青霉噻唑酸，消除因注射青霉素引起的过使变成青霉噻唑酸，消除因注射青霉素引起的过敏反应敏反应。253.3.在药物生产方面的应用在药物生产方面的应用利用酶的催化作用将前体物质转变为药物。这方利用酶的催化作用将前体物质转变为药物。这方面的应用日益增多。现已有不少药物包括一些贵面的应用日益增多。现已有不少药物包括一些贵重药物都是由酶法生产的重药物都是由酶法生产的 26284.4.在分析检测方面的应用在分析检测方面的应用酶法
12、检测或酶法分析酶法检测或酶法分析如：如：ELISA,ELISA,免疫组织化学，免疫组织化学，Western blotWestern blot中的中的HRPHRP291 1、细胞破碎、细胞破碎2 2、酶的提取、酶的提取3 3、酶的分离方法、酶的分离方法4 4、酶的组合分离纯化策略、酶的组合分离纯化策略5 5、酶的浓缩、干燥与结晶酶的浓缩、干燥与结晶第二节第二节 酶的分离纯化酶的分离纯化31二、酶的提取二、酶的提取（一）（一）细胞破碎细胞破碎许多酶存在于细胞内。许多酶存在于细胞内。为了提取这些胞内酶，为了提取这些胞内酶，首先需要对细胞进行破首先需要对细胞进行破碎处理。碎处理。1）机械破碎）机械破碎
13、2）物理破碎）物理破碎3）化学破碎）化学破碎4）酶解破碎）酶解破碎JY92-II D超声波超声波细胞粉碎机胞粉碎机细胞胞破破碎碎珠珠高高压细胞胞破破碎碎机机DY89-I型型 电动玻璃匀玻璃匀浆机机321.1.采用缓冲体系：防采用缓冲体系：防PHPH大幅度变化而失活大幅度变化而失活2.2.添加保护剂：防活性基集团活性中心受影响添加保护剂：防活性基集团活性中心受影响3.3.抑制水解酶的作用抑制水解酶的作用4.4.其他保护措施：温度，其他保护措施：温度，PHPH，搅拌，光照，氧化，搅拌，光照，氧化等影响等影响33（二）酶的抽提（二）酶的抽提提取方法提取方法使用的溶使用的溶剂剂或溶液或溶液提取提取对对
14、象象盐盐溶液提取溶液提取0.020.020.5M0.5M的的盐盐溶液溶液用于提取在低用于提取在低浓浓度度盐盐溶液中溶解溶液中溶解度度较较大的大的酶酶酸溶液提取酸溶液提取PH2PH26 6的水溶液的水溶液用于提取在稀酸溶液中溶解度大，用于提取在稀酸溶液中溶解度大，且且稳稳定性定性较较好的好的酶酶碱溶液提取碱溶液提取PH8PH81212的水溶液的水溶液用于提取在稀碱溶液中溶解度大用于提取在稀碱溶液中溶解度大且且稳稳定性定性较较好的好的酶酶有机溶有机溶剂剂提提取取可与水混溶的有机溶可与水混溶的有机溶剂剂用于提取那些与脂用于提取那些与脂质结质结合牢固或合牢固或含有含有较较多非极性基多非极性基团团的的酶
15、酶34(三）沉淀分离三）沉淀分离沉淀分离方法沉淀分离方法分离原理分离原理 盐盐析沉淀法析沉淀法不同蛋白不同蛋白质质在不同的在不同的盐浓盐浓度条件下溶解度不同，在度条件下溶解度不同，在酶酶液中添加一定液中添加一定浓浓度的中性度的中性盐盐，使，使酶酶或或杂质杂质从溶液中析从溶液中析出沉淀出沉淀等等电电点沉淀法点沉淀法两性两性电电解解质质在等在等电电点点时时溶解度最低，不同的两性溶解度最低，不同的两性电电解解质质有不同的等有不同的等电电点，通点，通过调节过调节溶液的溶液的pHpH值值，使，使酶酶或或杂杂质质沉淀析出沉淀析出有机溶有机溶剂剂沉淀法沉淀法酶酶与其它与其它杂质杂质在有机溶在有机溶剂剂中的溶
16、解度不同，添加一定中的溶解度不同，添加一定量的某种有机溶量的某种有机溶剂剂，使，使酶酶或或杂质杂质沉淀析出沉淀析出复合沉淀法复合沉淀法在在酶酶液中加入某些物液中加入某些物质质，使它与，使它与酶酶形成复合物而沉淀形成复合物而沉淀下来下来选择选择性性变变性沉性沉淀法淀法选择选择一定的条件使一定的条件使酶酶液中存在的某些液中存在的某些杂质变杂质变性沉淀，性沉淀，而不影响所需的而不影响所需的酶酶35三、酶的纯化三、酶的纯化过滤与膜分离过滤与膜分离电泳电泳离子交换层析离子交换层析36第三节第三节 酶和细胞的固定化酶和细胞的固定化（一）固定化酶的制备（一）固定化酶的制备1 1、固定化酶固定化酶（immob
17、ilized enzymeimmobilized enzyme）的定义）的定义:指指限制或固定于特定空间位置的酶。具体讲是指经限制或固定于特定空间位置的酶。具体讲是指经物理或化学方法处理，使酶变成不易随水流失即物理或化学方法处理，使酶变成不易随水流失即运动受到限制，而又能发挥催化作用的酶制剂。运动受到限制，而又能发挥催化作用的酶制剂。制备固定化酶的过程称为制备固定化酶的过程称为酶的固定化酶的固定化。固定化所。固定化所采用的酶，可以是纯化的酶，也可以是结合在菌采用的酶，可以是纯化的酶，也可以是结合在菌体（死细胞）或细胞碎片上的酶或酶系。体（死细胞）或细胞碎片上的酶或酶系。37 2 2、固定化酶的
18、特点、固定化酶的特点（1 1）可以多次使用，酶的稳定性提高；）可以多次使用，酶的稳定性提高；（2 2）反应后，酶与底物和产物易于分开，产物中）反应后，酶与底物和产物易于分开，产物中无残留酶，易于纯化。无残留酶，易于纯化。（3 3）反应条件易于控制，可实现转化反应的连续）反应条件易于控制，可实现转化反应的连续化和自动控制；化和自动控制；（4 4）酶的利用率高，单位酶催化的底物量增加，）酶的利用率高，单位酶催化的底物量增加，用酶量少；用酶量少；（5 5）比水溶性酶更适合于多酶反应。）比水溶性酶更适合于多酶反应。3839（1 1）载体结合法）载体结合法：将酶结合于不溶性载体上的固：将酶结合于不溶性载
19、体上的固定化方法。定化方法。A.A.物理吸附法物理吸附法：用物理方法将酶吸附于不溶性载：用物理方法将酶吸附于不溶性载体上的固定化方法。活性碳体上的固定化方法。活性碳,多孔玻璃多孔玻璃,树脂等树脂等优点：操作简单，可选用不同电荷和不同形状的优点：操作简单，可选用不同电荷和不同形状的载体，有可能固定化和纯化过程同时实现，酶失载体，有可能固定化和纯化过程同时实现，酶失活后载体仍可再生。活后载体仍可再生。缺点：最适吸附酶量无规律可循，吸附量与酶活缺点：最适吸附酶量无规律可循，吸附量与酶活力不一定呈平行关系，酶与载体结合力不强，酶力不一定呈平行关系，酶与载体结合力不强，酶易于脱落，导致酶活下降并污染产物
20、。易于脱落，导致酶活下降并污染产物。40 B B、离子结合法、离子结合法：酶通过离子键：酶通过离子键结合于具有离子交换基的水不溶结合于具有离子交换基的水不溶性载体上。性载体上。DEAE-DEAE-纤维素等纤维素等优点：操作简单，处理条件温和，优点：操作简单，处理条件温和，酶的高级结构和活性中心的氨基酶的高级结构和活性中心的氨基酸残基不易被破坏。酸残基不易被破坏。缺点：载体和酶的结合力弱，易缺点：载体和酶的结合力弱，易受缓冲液种类或受缓冲液种类或pHpH的影响，离子的影响，离子强度高时，酶易脱落。强度高时，酶易脱落。41C C、共价结合法、共价结合法：酶以共价键结：酶以共价键结合于载体上。即将酶
21、分子上非活合于载体上。即将酶分子上非活性部位功能团与载体表面反应基性部位功能团与载体表面反应基团进行共价结合的方法。团进行共价结合的方法。优点：酶与载体结合牢固，稳定优点：酶与载体结合牢固，稳定性好，不易脱落。性好，不易脱落。缺点：载体要活化，反应条件苛缺点：载体要活化，反应条件苛刻，操作复杂，反应条件剧烈，刻，操作复杂，反应条件剧烈，酶易失活和产生空间位阻效应酶易失活和产生空间位阻效应。42（2 2）交联法）交联法：用双功能或多：用双功能或多功能试剂使酶与酶或细胞功能试剂使酶与酶或细胞与细胞之间交联的方法。与细胞之间交联的方法。交联法又分：交联酶法、交联法又分：交联酶法、酶与辅助蛋白交联法、
22、吸酶与辅助蛋白交联法、吸附交联法和载体交联法。附交联法和载体交联法。常用的交联剂：戊二醛、常用的交联剂：戊二醛、双重氮联苯胺双重氮联苯胺-2-2、2-2-二磺二磺酸、酸、1,5-1,5-二氟二氟-2,4-2,4-二硝基二硝基苯。苯。43酶分子之间共价交联和与水不溶性载体共价偶联酶分子之间共价交联和与水不溶性载体共价偶联 酶分子；（酶分子；（a a）酶分子之间用双功能基团的化学交联试剂相）酶分子之间用双功能基团的化学交联试剂相互交联成水不溶性的固定化酶；（互交联成水不溶性的固定化酶；（b b）酶分子被偶联到水不溶）酶分子被偶联到水不溶性载体上形成水不溶性的固定化酶性载体上形成水不溶性的固定化酶4
23、4（3 3）包埋法：）包埋法：A A、网格型：、网格型：将酶或细胞包将酶或细胞包埋在高分子凝胶细微网格埋在高分子凝胶细微网格中。中。常用合成高分子化合物有常用合成高分子化合物有聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、光敏树脂。天然高分子化光敏树脂。天然高分子化合物有淀粉、明胶、胶原、合物有淀粉、明胶、胶原、海藻胶、角叉菜胶。多用海藻胶、角叉菜胶。多用于固定化细胞于固定化细胞45B B、微囊型：、微囊型：将酶或细胞包将酶或细胞包埋在高分子半透膜中。通埋在高分子半透膜中。通常为直径几微米到几百微常为直径几微米到几百微米的球状体。颗粒比网格米的球状体。颗粒比网格型要小得多，比较有利于型要小得多，
24、比较有利于底物与产物的扩散，但反底物与产物的扩散，但反应条件要求高，制备成本应条件要求高，制备成本也高。也高。4647（二）新型的酶固定化方法（二）新型的酶固定化方法温和的条件温和的条件下进行，减少酶活力损失，提高固定下进行，减少酶活力损失，提高固定化效率化效率光偶联法光偶联法：光敏性单体聚合物包埋固定化酶或带：光敏性单体聚合物包埋固定化酶或带光敏性基团的载体共价固定化酶光敏性基团的载体共价固定化酶等离子体法等离子体法：高度激发的原子、分子，自由基的：高度激发的原子、分子，自由基的聚集体，载体表面用等离子体修饰，引入活性基聚集体，载体表面用等离子体修饰，引入活性基团团48无载体固定化酶无载体固
25、定化酶直接用交联剂交联直接用交联剂交联 用交联剂交联溶解酶、晶体酶、物理聚集酶、和用交联剂交联溶解酶、晶体酶、物理聚集酶、和喷雾干燥酶等四种无载体酶体系，优点如下：喷雾干燥酶等四种无载体酶体系，优点如下：1.催化活性高，成本低催化活性高，成本低 2.具备较高的催化剂比表面具备较高的催化剂比表面 3.可加入多种酶可加入多种酶 4.底物扩散受限制少底物扩散受限制少 5.极端条件下稳定性高极端条件下稳定性高49（三）固定化细胞的方法（三）固定化细胞的方法1.1.固定化细胞的定义固定化细胞的定义 将细胞限制或定位于特定空间位置的方法将细胞限制或定位于特定空间位置的方法.第二代固定化酶第二代固定化酶.不
26、用载体，通过化学或物理的手段使细胞彼此不用载体，通过化学或物理的手段使细胞彼此附着相连附着相连 另外还有载体粘合，金属螯合等多种方法另外还有载体粘合，金属螯合等多种方法502 2、固定化细胞的制备技术、固定化细胞的制备技术（1 1）载体结合法制备技术）载体结合法制备技术：将细胞悬浮液直接与：将细胞悬浮液直接与水不溶性载体相结合。载体主要为阴离子交换树脂、水不溶性载体相结合。载体主要为阴离子交换树脂、阴离子交换纤维素、聚氯乙烯。阴离子交换纤维素、聚氯乙烯。优点：操作简单，符合细胞的生理条件，不影响优点：操作简单，符合细胞的生理条件，不影响细胞的生长及酶活性。细胞的生长及酶活性。缺点：吸附容量小结
27、合强度低。缺点：吸附容量小结合强度低。（2 2）包埋法制备技术：）包埋法制备技术：与包埋酶法相同。与包埋酶法相同。51（3 3）交联法制备技术：）交联法制备技术：由于所用交联剂戊二醛等由于所用交联剂戊二醛等对细胞有毒性，一般很少用。对细胞有毒性，一般很少用。（4 4）无载体法制备技术：）无载体法制备技术：靠细胞自身的絮凝作用靠细胞自身的絮凝作用制备固定化细胞的技术。通过助凝剂或选择性热制备固定化细胞的技术。通过助凝剂或选择性热变性的方法实现细胞的固定化。变性的方法实现细胞的固定化。此外还有粘合法，截留法等此外还有粘合法，截留法等52（四）常用的固定化酶载体材料（四）常用的固定化酶载体材料1.1
28、.固定化酶载体材料的性质要求固定化酶载体材料的性质要求(1)(1)功能基团功能基团(2)(2)渗透性和比表面：大的比表面和多孔结构渗透性和比表面：大的比表面和多孔结构(3)(3)溶解性：要求不溶于水溶解性：要求不溶于水(4)(4)机械刚性和稳定性：机械刚性和稳定性：(5)(5)组成和粒径：孔径小组成和粒径：孔径小(6)(6)对微生物的抵抗性对微生物的抵抗性(7)(7)经济环保经济环保532.2.固定化酶载体材料固定化酶载体材料(1)(1)高分子载体高分子载体1)1)天然高分子材料：天然高分子材料：优点：无毒，传质性好优点：无毒，传质性好缺点：易被微生物降解缺点：易被微生物降解一般用壳聚糖，海藻
29、酸钠一般用壳聚糖，海藻酸钠 541)1)合成有机高分子材料：合成有机高分子材料：强度大，抗微生物降解强度大，抗微生物降解聚苯乙烯聚苯乙烯55(2)(2)无机载体无机载体稳定性好，机械强度高，不易降解，耐酸，成本稳定性好，机械强度高，不易降解，耐酸，成本低，寿命长低，寿命长玻璃，硅凝胶，铝等玻璃，硅凝胶，铝等56（3 3）复合载体：）复合载体：无机有机材料复合组成的新型载体无机有机材料复合组成的新型载体磁性高分子微球磁性高分子微球:内部含有磁性金属或金属氧化物内部含有磁性金属或金属氧化物的超细粉末。的超细粉末。回收简单回收简单573 3、固定化方法的选择、固定化方法的选择（1 1）固定化酶应用的
30、安全性固定化酶应用的安全性：要按照药物和食品：要按照药物和食品领域的检验标准作必要的检查。所用试剂是否有领域的检验标准作必要的检查。所用试剂是否有毒性和残留。尽可能选择无毒性试剂。毒性和残留。尽可能选择无毒性试剂。（2 2）固定化酶在操作中的稳定性固定化酶在操作中的稳定性：在选择固定化：在选择固定化方法时要求固定化酶在操作过程中十分稳定，能方法时要求固定化酶在操作过程中十分稳定，能长期反复使用，在经济上有极强的竞争力。长期反复使用，在经济上有极强的竞争力。（3 3）固定化的成本固定化的成本：包括酶、载体、试剂的费用，：包括酶、载体、试剂的费用，也包括水、电、气、设也包括水、电、气、设 备和劳务
31、投资等备和劳务投资等。584 4、载体的选择、载体的选择为了工业化应用，最好选择工业化生产中已大量为了工业化应用，最好选择工业化生产中已大量应用的廉价材料为载体，如聚乙烯醇、卡拉胶、应用的廉价材料为载体，如聚乙烯醇、卡拉胶、海藻胶等。离子交换树脂、金属氧化物及不锈钢海藻胶等。离子交换树脂、金属氧化物及不锈钢碎屑等都是有应用前途的载体。碎屑等都是有应用前途的载体。此外，载体的选择要考虑底物的性质，如当底物此外，载体的选择要考虑底物的性质，如当底物为大分子时，只能用可溶性固定化酶，不能用包为大分子时，只能用可溶性固定化酶，不能用包埋型；埋型；若底物不完全溶解或黏度大，宜采用密度高的不若底物不完全溶
32、解或黏度大，宜采用密度高的不锈钢屑或陶瓷材料制备固定化酶，以便实现转化锈钢屑或陶瓷材料制备固定化酶，以便实现转化反应和回收固定化酶。反应和回收固定化酶。59二、固定化酶（细胞）的性质与指标二、固定化酶（细胞）的性质与指标1 1、固定化酶的形状、固定化酶的形状（1 1）颗粒状颗粒状：包括酶珠、酶块、酶片、酶粉。每种：包括酶珠、酶块、酶片、酶粉。每种固定化方法均可制备颗粒状，方法简单，比表面积固定化方法均可制备颗粒状，方法简单，比表面积大，转化效率高，适用各种反应器。如酵母酶珠。大，转化效率高，适用各种反应器。如酵母酶珠。（2 2）纤维状纤维状：三醋酸纤维素用适当的溶剂溶解后与：三醋酸纤维素用适当
33、的溶剂溶解后与酶混合，再用喷丝的方法就可制成酶纤维。比表面酶混合，再用喷丝的方法就可制成酶纤维。比表面积大，转化效率高，但只适用于填充床反应器。此积大，转化效率高，但只适用于填充床反应器。此外，纤维酶可以织成酶布用于填充床反应器。外，纤维酶可以织成酶布用于填充床反应器。60（3 3）膜状固定化酶膜状固定化酶：可通过共价结合的方法将酶：可通过共价结合的方法将酶偶联在滤膜上。也可用其他方法制膜酶。酶膜比偶联在滤膜上。也可用其他方法制膜酶。酶膜比表面积大，渗透阻力小，可用于酶电极，破碎后表面积大，渗透阻力小，可用于酶电极，破碎后也可用于填充床。目前已有木瓜酶、葡萄糖氧化也可用于填充床。目前已有木瓜酶
34、、葡萄糖氧化酶、过氧化物酶、脲酶等酶膜。酶、过氧化物酶、脲酶等酶膜。（4 4）管状固定化酶管状固定化酶：又称酶管，利用管状载体如：又称酶管，利用管状载体如尼龙、聚氯苯乙烯和聚丙烯酰胺，经活化后与酶尼龙、聚氯苯乙烯和聚丙烯酰胺，经活化后与酶偶联得酶管。酶管的机械强度大，切短后可用于偶联得酶管。酶管的机械强度大，切短后可用于填充床反应器，也可组装成列管式反应器。目前填充床反应器，也可组装成列管式反应器。目前已制备出糖化酶、转化酶、脲酶已制备出糖化酶、转化酶、脲酶 等酶管。等酶管。612 2、固定化酶的性质、固定化酶的性质 （1 1）酶活力的变化：酶活力的变化：酶经过固定化之后酶经过固定化之后活力大
35、都活力大都下降下降。其原因主要是酶活性中心的重要氨基酸与载。其原因主要是酶活性中心的重要氨基酸与载体发生结合，酶的空间结构发生变化或酶与底物结体发生结合，酶的空间结构发生变化或酶与底物结合时存在空间位阻效应。包埋法中还有底物与产物合时存在空间位阻效应。包埋法中还有底物与产物扩散阻力增大。扩散阻力增大。（2 2）酶稳定性的变化酶稳定性的变化：包括对温度、包括对温度、pHpH、蛋白酶、蛋白酶变性剂和抑制剂的耐受程度。固定化后，变性剂和抑制剂的耐受程度。固定化后，稳定性提稳定性提高，有效寿命延长高，有效寿命延长。其原因是限制了酶分子之间的。其原因是限制了酶分子之间的相互作用，阻止了其自溶，增加了酶构
36、型的牢固程相互作用，阻止了其自溶，增加了酶构型的牢固程度。度。621.1.热稳定性提高热稳定性提高：热稳定性越高热稳定性越高，工业化意义越，工业化意义越大。热稳定性高可以提高反应温度和反应速度，大。热稳定性高可以提高反应温度和反应速度，提高效率。提高效率。2.2.对有对有机试剂及酶抑制剂的稳定性提高机试剂及酶抑制剂的稳定性提高3.PH3.PH，蛋白酶等稳定性提高，蛋白酶等稳定性提高63A A、操作稳定性操作稳定性：通常半衰期达到：通常半衰期达到1 1个月以上个月以上时，即时，即具有工业应用价值。具有工业应用价值。B B、贮藏稳定性贮藏稳定性：一般不能长期贮存一般不能长期贮存，现做现用，现做现用
37、，否则活力逐渐下降。若需长期保存，可在贮存液中否则活力逐渐下降。若需长期保存，可在贮存液中添加底物、产物、抑制剂和防腐剂，并于低温保存。添加底物、产物、抑制剂和防腐剂，并于低温保存。C C、对蛋白酶的稳定性对蛋白酶的稳定性：大多数天然酶经固定化后：大多数天然酶经固定化后对蛋白酶的耐受力有所提高对蛋白酶的耐受力有所提高。可能的原因是由于空。可能的原因是由于空间位阻效应使蛋白酶不能进入固定化酶内部。间位阻效应使蛋白酶不能进入固定化酶内部。64（3 3）酶学特性的变化）酶学特性的变化 A A、底物专一性：、底物专一性：对底物的专一性下降下降。B B、最适、最适pHpH：最适pH可能变大，也可能变小；
38、pH-酶活曲线可能发生变化，其变化与酶蛋白和载体的带电性质有关。C C、最适温度、最适温度：一般升高一般升高。原因是固定化后空间结构更为稳定。D D、米氏常数、米氏常数(Km)Km)：Km值均发生变化，有的增加很小，有的增加很大，但不会变小。E E、最大反应速度（、最大反应速度（VmVm）：）：变化很小或不变。65(4)(4)评价固定化酶（细胞）的指标评价固定化酶（细胞）的指标l1.1.固定化酶活力测定固定化酶活力测定单位单位;每毫克干重每分钟转化底物的量每毫克干重每分钟转化底物的量活力回收率活力回收率=固定化酶总活力固定化酶总活力/加入酶的总活力加入酶的总活力相对活力固定化酶总活力相对活力固
39、定化酶总活力/（加入酶的总活力（加入酶的总活力上清液中未偶联的酶活力）上清液中未偶联的酶活力）l2.2.偶联率及相对活力的测定偶联率及相对活力的测定偶联率（加入酶活力上清液酶活力）偶联率（加入酶活力上清液酶活力）/加入蛋加入蛋白活力白活力66l3.3.半衰期半衰期，即酶的活力降为初活力一半时所经历，即酶的活力降为初活力一半时所经历的连续操作时间。的连续操作时间。T1/2T1/2表示表示l4.4.热稳定性：将固定化酶在不同温度下温育热稳定性：将固定化酶在不同温度下温育1h1h，在最适温度下测酶活力，一般保持在在最适温度下测酶活力，一般保持在60%60%以上以上67三、酶传感器三、酶传感器（一）原
40、理（一）原理它将活性物质酶覆盖在电极表面它将活性物质酶覆盖在电极表面,酶与被测的有机酶与被测的有机物或无机物反应物或无机物反应,形成一种能被电极响应的物质。形成一种能被电极响应的物质。19671967年年UpdickUpdick和和HicksHicks将固定化的葡萄糖氧化酶膜将固定化的葡萄糖氧化酶膜结合在氧电极上结合在氧电极上,做成了第一支葡萄糖电极；此后做成了第一支葡萄糖电极；此后,这类酶传感器通常是通过检测产物这类酶传感器通常是通过检测产物H H2 2O O2 2的浓度变化的浓度变化或氧的消耗量来检测底物。或氧的消耗量来检测底物。686970用葡萄糖氧化酶电极测定血液、尿、发酵液中的用葡萄
41、糖氧化酶电极测定血液、尿、发酵液中的葡萄糖浓度；葡萄糖浓度；用脲酶电极测定血液中的尿素浓度用脲酶电极测定血液中的尿素浓度7172（二）酶传感器主要类型（二）酶传感器主要类型酶催化特定底物发生反应酶催化特定底物发生反应,从而使特定生成物的量从而使特定生成物的量有所增减有所增减.用能把这类物质的量的改变转换为电信用能把这类物质的量的改变转换为电信号的装置和固定化酶耦合号的装置和固定化酶耦合,即组成酶传感器即组成酶传感器.依据信号转换器的类型依据信号转换器的类型,酶传感器大致可分为酶电酶传感器大致可分为酶电极极(主要包括离子选择电极、气敏电极、氧化还原主要包括离子选择电极、气敏电极、氧化还原电极等电
42、化学电极电极等电化学电极)、酶场效应晶体管传感器、酶场效应晶体管传感器(FET-(FET-酶酶)和酶热敏电阻传感器等和酶热敏电阻传感器等73（1 1）酶电极）酶电极固定化酶与各种电极结合的传感装置。一般用凝固定化酶与各种电极结合的传感装置。一般用凝胶包埋成薄膜，与电极相连。胶包埋成薄膜，与电极相连。74 电位型电极电位型电极1 1离子选择电极离子选择电极 对对特特定定的的离离子子呈呈选选择择性性响响应应的的电电极极，快快速速、灵灵敏敏、可可靠靠、价价廉廉，应应用用范范围围很很广广。在在生生物物医医学学领领域域也也常常直直接接用用它它测测定定体体液液中中的的一一些些成成分分（如如H+H+，K+K
43、+，Na+Na+，CaCa2+2+等）。等）。2 2氧化还原电极氧化还原电极不同于离子选择电极的另一类电位型电极这里不同于离子选择电极的另一类电位型电极这里指的主要是零类电极。指的主要是零类电极。75 电流型电极电流型电极 传感器中采用电流型电极为信号转换器的趋势日益传感器中采用电流型电极为信号转换器的趋势日益增加，与电位型电极相比有以下优点：增加，与电位型电极相比有以下优点：（1 1）电极的输出直接和被测物的浓度呈线性关系，）电极的输出直接和被测物的浓度呈线性关系，不像电位型电极那样和被测物浓度的对数呈线性关不像电位型电极那样和被测物浓度的对数呈线性关系系（2 2）电极输出值的读数误差所对应
44、的待测物浓度的）电极输出值的读数误差所对应的待测物浓度的相对误差比电位型电极的小相对误差比电位型电极的小（3 3）电极的灵敏度比电位型电极的高）电极的灵敏度比电位型电极的高 76 氧电极氧电极 有不少酶如氧化酶和加氧酶在催化底物反应时要用溶解氧为辅助试剂，反应中所消耗的氧量就用氧电极来测定 目前用得最多的氧电极是电解式的Clark氧电极，Clark氧电极是由铂阴极、Ag/AgCl阳极、KCl电解质和透气膜所构成。当将氧电极插入含有溶解氧的溶液后，溶液中的O2将扩散，透过透气膜到达铂阴极表面被还原，还原电流值与溶解氧的量有关7778（2 2）热敏电阻酶传感器）热敏电阻酶传感器将酶催化的热量转化为
45、电信号将酶催化的热量转化为电信号稳定性好，灵敏度高，价格低稳定性好，灵敏度高，价格低79（3 3）离子敏场效应晶体管酶传感器（）离子敏场效应晶体管酶传感器（ISFETISFET）对离子或分子敏感的半导体器件对离子或分子敏感的半导体器件ISFETISFET与常用的绝缘栅型场效应晶体管构造相同与常用的绝缘栅型场效应晶体管构造相同不过在输入栅极做了一些改进，以能与特定的化学不过在输入栅极做了一些改进，以能与特定的化学物质反应，产生电位的酶膜取代金属极让酶膜直物质反应，产生电位的酶膜取代金属极让酶膜直接与溶液接触，由于酶膜对溶液中的离子有选择作接与溶液接触，由于酶膜对溶液中的离子有选择作用，从而调制用
46、，从而调制ISFETISFET的漏电流变化，利用这个特性的漏电流变化，利用这个特性就能检测一溶液中的离子活度就能检测一溶液中的离子活度 8081（4 4）光纤传感器）光纤传感器酶固定在光学透明的载体上，构成生物敏感膜，酶固定在光学透明的载体上，构成生物敏感膜，酶与底物反应引起穿越酶膜的光的性质变化，检酶与底物反应引起穿越酶膜的光的性质变化，检测光信号测光信号82第四节第四节 固定化酶和固定化细胞的反应器固定化酶和固定化细胞的反应器用于酶进行催化反应的容器及其附属设备称为酶反应器。用于酶进行催化反应的容器及其附属设备称为酶反应器。酶催化反应过程示意图酶催化反应过程示意图过程调控过程调控生物反应器
47、生物反应器 消消毒毒原料原料预处理预处理 产物分产物分离提纯离提纯 产产品品生物催化生物催化剂制备剂制备空气空气除菌除菌能量能量热量热量83常见的酶反应器类型常见的酶反应器类型l按按结构结构区分区分搅拌罐式反应器（搅拌罐式反应器（Stirred Tank Reactor,STRStirred Tank Reactor,STR）鼓泡式反应器鼓泡式反应器(bubble column reactor,BCR)(bubble column reactor,BCR)填充床式反应器填充床式反应器(packed column reactor,PCR)(packed column reactor,PCR)流化
48、床式反应器流化床式反应器(Fluidized Bed Reactor,FBR)(Fluidized Bed Reactor,FBR)膜反应器膜反应器(Membrane Reactor,MR)(Membrane Reactor,MR)l按按操作方式操作方式区分区分分批式反应分批式反应(batch)(batch)连续式反应连续式反应(continuous)(continuous)流加分批式反应流加分批式反应(feeding batch)(feeding batch)l混合形式混合形式连续搅拌罐反应器（连续搅拌罐反应器（Continuous Stirred Tank Reactor,Continuo
49、us Stirred Tank Reactor,CSTRCSTR）分批搅拌罐反应器（分批搅拌罐反应器（Batch Stirred Tank Reactor,Batch Stirred Tank Reactor,BSTRBSTR）84一、反应器的类型和特点一、反应器的类型和特点间歇式搅拌罐反应器间歇式搅拌罐反应器用于游离酶反应后随即放料。用于游离酶反应后随即放料。又称为批量反应器（又称为批量反应器（Batch Batch Reactor Reactor BSTRBSTR）。）。特点特点：底物与酶一次性投入反应：底物与酶一次性投入反应器内，产物一次性取出；反应完器内，产物一次性取出；反应完成之后，
50、固定化酶（细胞）用过成之后，固定化酶（细胞）用过滤法或超滤法回收，再转入下一滤法或超滤法回收，再转入下一批反应。批反应。85优点优点：装置较简单，造价较低：装置较简单，造价较低缺点缺点：固定化酶经反复回收使用时，易失去活性，：固定化酶经反复回收使用时，易失去活性，故在工业生产中，间歇式酶反应器很少用于固定故在工业生产中，间歇式酶反应器很少用于固定化酶，但常用于游离酶。化酶，但常用于游离酶。86连续流动搅拌罐反应器连续流动搅拌罐反应器连续进料、连续出料连续进料、连续出料连续搅拌釜式反应器连续搅拌釜式反应器（CSTRCSTR）。）。向反应器投入固定化酶和底物溶向反应器投入固定化酶和底物溶液，不断搅