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1、会计学1植物植物(zhw)生物技术研分子克隆生物技术研分子克隆第一页，共58页。DNADNA克隆克隆克隆克隆(k ln(k ln)rr目的：建立繁殖目的基因的目的：建立繁殖目的基因的目的：建立繁殖目的基因的目的：建立繁殖目的基因的细胞系细胞系细胞系细胞系rr含义：建立目的含义：建立目的含义：建立目的含义：建立目的DNADNA分子分子分子分子(fnz)(fnz)繁殖体系的过程繁殖体系的过程繁殖体系的过程繁殖体系的过程rr三个要素三个要素三个要素三个要素:目的基因、载体、目的基因、载体、目的基因、载体、目的基因、载体、受体细胞受体细胞受体细胞受体细胞涉及DNA分子体外重组(zhn z)；转化受体细
2、胞第1页/共58页第二页，共58页。分子克隆步骤分子克隆步骤DNA分子体外重组分子体外重组转化转化(zhunhu)筛选筛选将核酸分子(DNA)插入到可在原核或真核细胞(xbo)中无性繁殖的载体中，携带外源DNA的载体在宿主细胞(xbo)内大量复制的过程经过筛选获得单一克隆第2页/共58页第三页，共58页。2.2 2.2 克隆克隆克隆克隆(k ln(k ln)载体载体载体载体要能够独立要能够独立(dl)地在宿主细胞中复地在宿主细胞中复制制第3页/共58页第四页，共58页。载体载体(zit)的功能的功能为外源基因提供复制能力或整合能力为外源基因提供复制能力或整合能力为外源基因的表达提供条件为外源基
3、因的表达提供条件载体的功能载体的功能(gngnng)(gngnng)及其特征及其特征第4页/共58页第五页，共58页。载体的特征（应具备的条件）载体的特征（应具备的条件）载体的特征（应具备的条件）载体的特征（应具备的条件）具有对受体细胞的可转移性具有对受体细胞的可转移性具有对受体细胞的可转移性具有对受体细胞的可转移性具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点长度长度长度长度(chngd)(chngd)尽可能小，以提高其载装能力尽可能小，以提高其载装能力尽可能小，
4、以提高其载装能力尽可能小，以提高其载装能力具有多种单一的酶切位点具有多种单一的酶切位点具有多种单一的酶切位点具有多种单一的酶切位点具有合适的选择性标记具有合适的选择性标记具有合适的选择性标记具有合适的选择性标记 第5页/共58页第六页，共58页。载体类型载体类型克隆克隆(kln)载体载体表达载体表达载体质粒质粒噬菌体噬菌体粘粒粘粒酵母人工染色体酵母人工染色体细菌细菌(xjn)F因子；因子；P因子因子目的(md)DNA在宿主细胞中复制目的基因在宿主细胞中复制、表达第6页/共58页第七页，共58页。质粒质粒质粒是存在于细菌细胞质中独立于染色体而自主复制的共质粒是存在于细菌细胞质中独立于染色体而自主
5、复制的共价、封闭、环状双链价、封闭、环状双链DNA分子（分子（CovalentlyclosedCircularDNA,cccDNA），并不是细菌生长所必需的，），并不是细菌生长所必需的，但可以赋予细菌某些抵御外界环境因素不利但可以赋予细菌某些抵御外界环境因素不利(bl)影响的影响的能力。分子量在能力。分子量在1-200kb之间。之间。一、质粒载体一、质粒载体(zit)第7页/共58页第八页，共58页。质粒的基本质粒的基本质粒的基本质粒的基本(jbn)(jbn)特性特性特性特性自主复制性自主复制性自主复制性自主复制性携带有自己的复制起始区（携带有自己的复制起始区（携带有自己的复制起始区（携带有自
6、己的复制起始区（oriori）一个控制质粒拷贝数的基因；一个控制质粒拷贝数的基因；一个控制质粒拷贝数的基因；一个控制质粒拷贝数的基因；能独立于宿主细胞的染色体能独立于宿主细胞的染色体能独立于宿主细胞的染色体能独立于宿主细胞的染色体DNADNA而自主复制而自主复制而自主复制而自主复制拷贝数少则几个，多则拷贝数少则几个，多则(duz)几百个不等，需几百个不等，需要使用宿主细胞复制染色要使用宿主细胞复制染色体体DNA的多种酶群的多种酶群第8页/共58页第九页，共58页。质粒质粒复制子复制子拷贝数拷贝数pBR322及其衍生质粒及其衍生质粒pMB11520pUC系列系列(xli)质粒及其衍生质粒质粒及其
7、衍生质粒突变的突变的pMB1500700pACYC及其衍生质粒及其衍生质粒p15A10212pSC101及其衍生质粒及其衍生质粒pSC1015ColE1ColE11520质粒按复制方式可分为两类：质粒按复制方式可分为两类：松弛松弛(snch)型复制型复制严谨型复制严谨型复制少于少于1010个拷贝个拷贝(kobi)(kobi)第9页/共58页第十页，共58页。q 可扩增性q氯霉素扩增：q在蛋白质合成中断时，质粒复制能持续合成，这样当用氯霉素抑制蛋白质合成并阻断细菌(xjn)染色体复制时，带有pMB1或ColEI复制子的质粒将利用丰富的原料大量复制，最后每个细胞可以积聚2000-3000个拷贝，这
8、叫做氯霉素扩增。q质粒psc101和p15A的复制受质粒上编码的蛋白因子的正调节。氯霉素抑制蛋白质合成后，这类质粒便不能持续复制。pMB1或ColEI类质粒复制子的复制完全依靠宿主细胞提供的半衰期较长的复制酶及蛋白(dnbi)因子（DNA聚合酶I，III，RNA聚合酶以及dnaB、dnaC、dnaD、dnaZ的产物）第10页/共58页第十一页，共58页。qq可转移性可转移性可转移性可转移性在天然条件下，有些天然质粒都可以通过细菌接合作用从一种宿主在天然条件下，有些天然质粒都可以通过细菌接合作用从一种宿主在天然条件下，有些天然质粒都可以通过细菌接合作用从一种宿主在天然条件下，有些天然质粒都可以通
9、过细菌接合作用从一种宿主细胞内转移到另外一种宿主内细胞内转移到另外一种宿主内细胞内转移到另外一种宿主内细胞内转移到另外一种宿主内qq要素要素要素要素(yos)(yos)：移动基因：移动基因：移动基因：移动基因mobmobqq转移基因转移基因转移基因转移基因tratraqq转移起始位点转移起始位点转移起始位点转移起始位点bombomqq内部的转移缺口位点内部的转移缺口位点内部的转移缺口位点内部的转移缺口位点nicnic顺式元件 bom 及其内部的转移缺口(quku)位点 nic，mob基因、tra基因都由质粒提供）第11页/共58页第十二页，共58页。人工构建的载体质粒人工构建的载体质粒人工构建
10、的载体质粒人工构建的载体质粒多拷贝多拷贝多拷贝多拷贝 复制子经过人工突变，除去控制拷贝数负调节复制子经过人工突变，除去控制拷贝数负调节复制子经过人工突变，除去控制拷贝数负调节复制子经过人工突变，除去控制拷贝数负调节(tioji)(tioji)基因，使质粒拷贝数达到基因，使质粒拷贝数达到基因，使质粒拷贝数达到基因，使质粒拷贝数达到每个细胞数千，用于扩增外源基因每个细胞数千，用于扩增外源基因每个细胞数千，用于扩增外源基因每个细胞数千，用于扩增外源基因整合质粒整合质粒整合质粒整合质粒装有整合促进基因整合特异序列，便于外源基因准确重组整合入受体细胞的染装有整合促进基因整合特异序列，便于外源基因准确重组
11、整合入受体细胞的染装有整合促进基因整合特异序列，便于外源基因准确重组整合入受体细胞的染装有整合促进基因整合特异序列，便于外源基因准确重组整合入受体细胞的染色体上色体上色体上色体上穿梭质粒穿梭质粒穿梭质粒穿梭质粒 含有两个不同的复制子，能在两种不同的受体细胞中复制含有两个不同的复制子，能在两种不同的受体细胞中复制含有两个不同的复制子，能在两种不同的受体细胞中复制含有两个不同的复制子，能在两种不同的受体细胞中复制表达载体表达载体表达载体表达载体 装有强的启动基因，合适的顺序以及有效的终止子，以便任何外源基因在受体装有强的启动基因，合适的顺序以及有效的终止子，以便任何外源基因在受体装有强的启动基因，
12、合适的顺序以及有效的终止子，以便任何外源基因在受体装有强的启动基因，合适的顺序以及有效的终止子，以便任何外源基因在受体细胞内的高效表达细胞内的高效表达细胞内的高效表达细胞内的高效表达第12页/共58页第十三页，共58页。实验室常用质粒实验室常用质粒pBR322该质粒具有以下优点该质粒具有以下优点分子大小分子大小4363bp，容易纯化，容易纯化;含有含有2个抗生素抗性基因，可以作为选择标记个抗生素抗性基因，可以作为选择标记;受体细胞内，受体细胞内，pBR322以多拷贝存在，一般一个细胞内可达到以多拷贝存在，一般一个细胞内可达到15个，而在蛋白质合成抑制剂存在条件下，可达到个，而在蛋白质合成抑制剂
13、存在条件下，可达到1000-3000拷贝，如氯霉素。可以产生大量拷贝，如氯霉素。可以产生大量(dling)的重组的重组pBR322分子。分子。质粒小、转化率高质粒小、转化率高质粒大、拷贝数低质粒大、拷贝数低15kb转化率成为转化率成为(chngwi)限限制因素制因素第13页/共58页第十四页，共58页。pBR322pBR322该质粒具有以下优点该质粒具有以下优点该质粒具有以下优点该质粒具有以下优点分子分子分子分子(fnz)(fnz)大小大小大小大小4363bp4363bp含有含有含有含有2 2个抗生素抗性基因，可以作为选择标记。个抗生素抗性基因，可以作为选择标记。个抗生素抗性基因，可以作为选择
14、标记。个抗生素抗性基因，可以作为选择标记。而且每一个标记基因都含有单一的酶切而且每一个标记基因都含有单一的酶切而且每一个标记基因都含有单一的酶切而且每一个标记基因都含有单一的酶切位点，可以插入位点，可以插入位点，可以插入位点，可以插入DNADNA，ampamp基因内可被基因内可被基因内可被基因内可被PstI,PvuI,SacIPstI,PvuI,SacI切开，而四环素抗性基切开，而四环素抗性基切开，而四环素抗性基切开，而四环素抗性基因可被因可被因可被因可被BamHI,HindIIIBamHI,HindIII切开，通过插入切开，通过插入切开，通过插入切开，通过插入失活筛选重组子。失活筛选重组子。
15、失活筛选重组子。失活筛选重组子。受体细胞内，受体细胞内，受体细胞内，受体细胞内，pBR322pBR322以多拷贝存在，一般一以多拷贝存在，一般一以多拷贝存在，一般一以多拷贝存在，一般一个细胞内可达到个细胞内可达到个细胞内可达到个细胞内可达到1515个，而在蛋白质合成个，而在蛋白质合成个，而在蛋白质合成个，而在蛋白质合成抑制剂存在条件下如氯霉素，可达到抑制剂存在条件下如氯霉素，可达到抑制剂存在条件下如氯霉素，可达到抑制剂存在条件下如氯霉素，可达到1000-30001000-3000拷贝。拷贝。拷贝。拷贝。实验室常用实验室常用(chnyn)质粒质粒第14页/共58页第十五页，共58页。pUC系列载
16、体 puc系列载体包括4个组成部分：来自质粒pBR322的复制(fzh)起点 氨苄青霉素抗性基因大肠杆菌-半乳糖苷酶基因(1acz)的启动子及编码-肽链的DNA序列（1acZ基因）1acz基因5端带有一段MCS，但它并不破坏lacZ基因的功能。在特定的受体细胞中可表现-互补作用，可通过(tnggu)-互补作用形成的蓝色和白色菌落筛选重组质粒。这两个质粒的结构几乎是完全一样的，只是多克隆位点的排列方向(fngxing)相反第15页/共58页第十六页，共58页。Figure 4.10.Map of plasmid vector pUC19.The origin of replication(ori
17、)was derived originally from a ColE1-like plasmid,pMB1.The ampicillin resistance gene(ApR)was derived originally from the plasmid RSF 2124 and permits selection for cells containing the vector molecule.A portion of the lacZ gene is included and is expressed to give an amino-terminal fragment of-gala
18、ctosidase.This is complemented by a mutant lacZ gene in the host cell:the products of the vector and host cell lacZ sequences,although individually inactive,can associate to form a functional product.The 54 bp polylinker multiple cloning site(capital letters)is inserted into the vector lacZ(lower ca
19、se letters)component in such a way as to preserve the reading frame and functional expression.However,cloning of an insert into the multiple cloning site(MCS)will cause insertional inactivation,and absence of-galactosidase activity.第16页/共58页第十七页，共58页。在特定的受体细胞中可表现在特定的受体细胞中可表现-互补作用，可通过互补作用，可通过-互补作用形成的
20、蓝互补作用形成的蓝色和白色色和白色(bis)菌落筛选重组质粒。菌落筛选重组质粒。第17页/共58页第十八页，共58页。pGEM-3Z/4ZpGEM-3Z,2743bppGEM-4Z,2746bp在多克隆位点的两端添加了噬菌体的转录在多克隆位点的两端添加了噬菌体的转录(zhun l)启动子，如启动子，如 Sp6 和和 T7 噬菌体的启动子噬菌体的启动子pGEM-3Z 和和 pGEM-4Z 的差别在于二者互换了两个启动子的位置。的差别在于二者互换了两个启动子的位置。作用：体外转录作用：体外转录(zhun l)第18页/共58页第十九页，共58页。质粒的制备质粒的制备质粒的制备质粒的制备(zhbi)
21、(zhbi)实验室常采用碱法制备实验室常采用碱法制备实验室常采用碱法制备实验室常采用碱法制备(zhbi)(zhbi)质粒质粒质粒质粒碱裂解法碱裂解法将菌体悬浮在含有将菌体悬浮在含有EDTA的缓冲液体中加溶菌酶裂解细菌的缓冲液体中加溶菌酶裂解细菌(xjn)细细胞壁胞壁加加NaOH与与SDS的混合溶液，去膜、释放内含物的混合溶液，去膜、释放内含物加高浓度的醋酸钾溶液沉淀染色体，去除染色体加高浓度的醋酸钾溶液沉淀染色体，去除染色体DNA及大部分及大部分蛋白质蛋白质离心取上清液，用苯酚氯仿溶液处理，灭活去除痕量蛋白质离心取上清液，用苯酚氯仿溶液处理，灭活去除痕量蛋白质及核酸酶及核酸酶乙醇或异丙醇沉淀水
22、相质粒乙醇或异丙醇沉淀水相质粒无无DNase的的RNase处理残余处理残余RNA第19页/共58页第二十页，共58页。二二二二 DNA DNA载体载体载体载体(zit(zit)噬菌体是大噬菌体是大肠肠杆菌杆菌(dchnnjn)的噬菌体的噬菌体裂解裂解(li ji)途径途径溶原途径溶原途径第20页/共58页第二十一页，共58页。噬菌体由外壳蛋白和噬菌体由外壳蛋白和噬菌体由外壳蛋白和噬菌体由外壳蛋白和-DNA-DNA组成组成组成组成(zchn)(zchn)；-DNA-DNA为线状双链为线状双链为线状双链为线状双链DNADNA分子，两端各有一个分子，两端各有一个分子，两端各有一个分子，两端各有一个1
23、212核苷酸的互补单链（粘性末端），核苷酸的互补单链（粘性末端），核苷酸的互补单链（粘性末端），核苷酸的互补单链（粘性末端），称为称为称为称为coscos区，全长区，全长区，全长区，全长48.5kb48.5kb。5GGGCGGCGACCTNNNN33NN NNCCCGCCGCTGGA5cos48502bpcos第21页/共58页第二十二页，共58页。q DNA DNA进入宿主细胞后，粘性末端连接，形成环型分子进入宿主细胞后，粘性末端连接，形成环型分子;q 噬菌体含基因噬菌体含基因(jyn)50(jyn)50个以上，功能相近的聚集成簇个以上，功能相近的聚集成簇Figure 4.12.Map of
24、 the genome,showing positions of genes(vertical bars).In replacement vectors,the nonessential region is removed by restriction endonuclease digestion,leaving a left arm and a right arm.A foreign DNA fragment can be ligated to the two arms in place of the original stuffer fragment,providing maximal i
25、nsert sizes of over 20 kb.Genesrequiredforlysogenicfunctionarelocatedinacentralsegmentofthegenome.第22页/共58页第二十三页，共58页。噬菌体通过特殊的生物学方式将其噬菌体通过特殊的生物学方式将其噬菌体通过特殊的生物学方式将其噬菌体通过特殊的生物学方式将其DNADNA导入宿主导入宿主导入宿主导入宿主(szh)(szh)细胞细胞细胞细胞吸附：吸附：吸附：吸附：注入注入注入注入DNADNA：吸附于大肠杆菌外膜上的LamB受体（正常功能是运转麦芽糖进入细胞(xbo)内），麦芽糖可诱导这些受体的合成，故
26、它也可促进噬菌体的吸附与感染（尾部吸附）噬菌体 DNA 进入宿主细胞后，其两端互补单链通过(tnggu)碱基配对形成环状 DNA 分子第23页/共58页第二十四页，共58页。此时，此时，噬菌体可选择进入噬菌体可选择进入(jnr)：裂解生长状态（裂解生长状态（lyticgrowth）溶源状态（溶源状态（lysogenicstate）将噬菌体基因组 DNA 通过位点专一性重组(zhn z)整合到宿主的染色体 DNA 中，并随宿主的繁殖传给子代细胞。大量复制并组装成子代噬菌体颗粒，导致宿主(szh)细胞裂解。经过 4045min 的生长循环，释放出约 100 个感染性噬菌体颗粒（每个细胞）；第24页
27、/共58页第二十五页，共58页。包装包装(bozhung)：包装包装(bozhung)蛋白在蛋白在宿主细胞内合成，包装宿主细胞内合成，包装(bozhung)蛋白首先结蛋白首先结合在合在cos区的附近，形成包区的附近，形成包装装(bozhung)启动复合启动复合物，因此物，因此cos区对包装区对包装(bozhung)是至关重要是至关重要的。的。包装包装(bozhung)时由一时由一个蛋白因子将个蛋白因子将cos区切开，区切开，从而保证只有一个从而保证只有一个DNA线线状分子被包装状分子被包装(bozhung)，每个宿主，每个宿主细胞可包装细胞可包装(bozhung)多达多达100个成熟的个成熟的
28、-DNA分分子。子。第25页/共58页第二十六页，共58页。包装与包装与DNA本身的性质无关，但对其大小要求比较本身的性质无关，但对其大小要求比较(bjio)严格，它只能包装严格，它只能包装-DNA分子的分子的75%-105%，也就是说可以包装，也就是说可以包装36.4kb-50.9kb范围内的范围内的DNA，包装，包装好了的好了的-DNA便形成成熟的噬菌体颗粒。便形成成熟的噬菌体颗粒。第26页/共58页第二十七页，共58页。裂解裂解每个细胞内容纳了多达每个细胞内容纳了多达100个成熟的噬菌体，这时两种负个成熟的噬菌体，这时两种负责裂解宿主细胞的蛋白被合成，细菌细胞被裂解，成熟责裂解宿主细胞的
29、蛋白被合成，细菌细胞被裂解，成熟的噬菌体释放出去，又去感染另外的噬菌体释放出去，又去感染另外(lnwi)的宿主细胞，的宿主细胞，直至大肠杆菌细胞全部被裂解。直至大肠杆菌细胞全部被裂解。第27页/共58页第二十八页，共58页。Figure 4.13.In vitro DNA packaging in a phage protein coat can be performed using a mixed lysate of two mutated lysogens.Normal in vivo packaging of DNA involves first making pre-heads,str
30、uctures composed of the major capsid protein encoded by gene E.A unit length of DNA is inserted in the pre-head,the unit length being prepared by cleavage at neighboring cos sites.A minor capsid protein D is then inserted in the pre-heads to complete head maturation,and the products of other genes s
31、erve as assembly proteins,ensuring joining of the completed tails to the completed heads.A defect in producing protein E,resulting from an amber mutation introduced into gene E(Eam),prevents pre-heads being formed by BHB2688.An amber mutation in gene D(Dam)prevents maturation of the pre-heads,with e
32、nclosed DNA,into complete heads.The components of the BHB2688/BHB2690 mixed lysate,however,complement each others deficiency and provide all the products for correct packaging.Some of the gene products lyse the host cell,allowing the virions to escape and infect new cells.第28页/共58页第二十九页，共58页。噬菌体生活周期
33、的决定噬菌体生活周期的决定(judng)噬菌体噬菌体:溶原周期；裂解周期溶原周期；裂解周期prophagestateLyticstatecI激活自身的表达；激活自身的表达；关闭关闭cro基因的表达；基因的表达；多数基不因表达多数基不因表达Cro激活自身的表达激活自身的表达;关闭关闭cI基因；基因；多数基因表达多数基因表达Innormallygrowinghostcells,thelysogenicstateisfavoredandthegenomereplicatesalongwiththehostchromosomalDNA.cellsfavorsDamagetohostatransitio
34、ntothelyticcycle,enablingthevirustoescapethedamagedcellandinfectnewcells第29页/共58页第三十页，共58页。Thedecisiontoenterthelyticcycleorthelysogenicstateiscontrolledbytworegulatorygenes,cIandcro.第30页/共58页第三十一页，共58页。DNADNA载载载载体体体体(zit(zit)载体载体(zit)的应用得益于体外包装系统的应用得益于体外包装系统J基因到N基因之间的DNA序列(xli)对噬菌体的生长不是绝对必需的，可以缺失或被
35、外源基因取代，P基因与Q基因之间的序列(xli)缺失也仍然可以作为噬菌体使用。第31页/共58页第三十二页，共58页。插入型载体插入型载体插入型载体插入型载体 经改造后的长度为经改造后的长度为经改造后的长度为经改造后的长度为37kb37kb，为包装的下限，它本身也能被包装，其，为包装的下限，它本身也能被包装，其，为包装的下限，它本身也能被包装，其，为包装的下限，它本身也能被包装，其允许的插入片段最大为允许的插入片段最大为允许的插入片段最大为允许的插入片段最大为13.9kb13.9kb（50.9-37kb50.9-37kb）由于由于由于由于(yuy)(yuy)该类载体重组与否均可包装，因而为区分
36、重组子与非重组子必须该类载体重组与否均可包装，因而为区分重组子与非重组子必须该类载体重组与否均可包装，因而为区分重组子与非重组子必须该类载体重组与否均可包装，因而为区分重组子与非重组子必须携携携携带标记基因。带标记基因。带标记基因。带标记基因。Insertion vectorsLambda vectors used for making cDNA libraries do not require a large insert capacity(most cDNAs are 300 kb).The resulting recombinants can be transferred with co
37、nsiderable efficiency into bacterial cells using electroporation(a method of exposing cells to high voltages in order to relax the selective permeability of their plasma membranes).However,because the resulting bacterial artificial chromosomes(BACs)contain a low copy number replicon,only very low yi
38、elds of recombinant DNA can be recovered from the host cells(Shizuya et al.,1992).第55页/共58页第五十六页，共58页。Bacteriophage P1 vectors and PACsCertain bacteriophages have relatively large genomes,thereby affording the potential for developing vectors that can accommodate large foreign DNA fragments.One such
39、 is bacteriophage P1 which,like phage ,packages its genome in a protein coat,and 110115 kb of linear DNA is packaged in the P1 protein coat.第56页/共58页第五十七页，共58页。P1 cloning vectors have therefore been designed in which components of P1 are included in a circular plasmid.The P1 plasmid vector can be cl
40、eaved to generate two vector arms to which up to 100 kb of foreign DNA can be ligated and packaged into a P1 protein coat in vitro.The recombinant P1 phage can be allowed to adsorb to a suitable host,following which the recombinant P1 DNA is injected into the cell,circularizes and can be amplified(Sternberg,1992).第57页/共58页第五十八页，共58页。