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1、会计学1核酸核酸(h sun)分析技术分析技术第一页，共44页。n样品的电荷(dinh)效应n 带电多，迁移快琼脂糖凝胶电泳凝胶的筛选(shixun)效应 分子量小，阻力小，迁移快n主要用于分离(fnl)鉴定核酸第1页/共43页第二页，共44页。琼脂糖凝胶电泳是一种非常简便、快速、最常用的分离纯化和鉴定核酸的方法琼脂糖是从海藻中提取的一种线状高聚物根据琼溶解温度，把琼脂糖分为一般(ybn)琼脂糖和低熔点琼脂糖低熔点琼脂糖熔点为6265，溶解后在37下维持液体状态约数小时，主要用于DNA片段的回收，质粒与外源性DNA的快速连接等第2页/共43页第三页，共44页。+_Power第3页/共43页第四
2、页，共44页。琼脂糖凝胶电泳分离(fnl)DNAn n凝胶制备凝胶制备(zhbi)(zhbi)n n上样上样n n电泳电泳n n染色染色n n结果观察结果观察第4页/共43页第五页，共44页。琼脂糖凝胶电泳分离(fnl)DNA1.凝胶制备(zhbi)浓 度（%）标 准(kb)高强度(kb)低熔点(kb)低黏度低溶点(kb)0.31500.50.7250.80.5150.8100.8101.00.25120.480.481.20.1560.370.371.50.0840.240.242.00.130.133.00.0510.514.00.10.56.00.010.1第5页/共43页第六页，共44
3、页。琼脂糖类型琼脂糖类型凝结温度凝结温度/熔化温度熔化温度/标准琼脂糖标准琼脂糖35389095不同厂家不同厂家生产的不生产的不同商品其同商品其凝结温度凝结温度和熔化温和熔化温度有一定度有一定差异差异40428590 高强度琼脂糖高强度琼脂糖34438595 修饰的低熔点修饰的低熔点/凝凝点琼脂糖点琼脂糖253563653565 超低熔点超低熔点8154045 低黏性低熔点琼脂低黏性低熔点琼脂糖糖25307038853075不同(b tn)类型琼脂糖的性质第6页/共43页第七页，共44页。电泳电泳(din yn)缓冲液缓冲液常用三种缓冲液 Tris-硼酸(TBE)、Tris-乙酸(TAE)、T
4、ris-磷酸(TPE)TBE与TPE：缓冲容量高，DNA分离效果好，但TPE在DNA片段回收时含磷酸盐浓度高，容易使DNA沉淀TAE：缓冲容量低，但价格较便宜，因而推荐选用TAE。缓冲液中的 EDTA 可螯合二价阳离子，从而(cng r)抑制DNA酶的活性，防止PCR扩增产物降解第7页/共43页第八页，共44页。琼脂糖凝胶电泳分离(fnl)DNA加热后加热前1.凝胶制备(zhbi)第8页/共43页第九页，共44页。琼脂糖凝胶电泳分离(fnl)DNA2.上样第9页/共43页第十页，共44页。三个作用：1）增加样品密度保证DNA沉入加样孔内；2）使样品带有颜色便于简化上样过程；3）其中的染料在电场
5、中以可以预测的泳动速率向阳极(yngj)迁移。核酸(h sun)电泳的上样缓冲溶液第10页/共43页第十一页，共44页。6凝胶载样缓冲液凝胶载样缓冲液类型类型6 缓冲液缓冲液贮存温度贮存温度I0.25%溴酚蓝溴酚蓝40.25%二甲苯氰二甲苯氰FF40%(m/V)蔗糖水溶液蔗糖水溶液II0.25%溴酚蓝溴酚蓝室温室温0.25%二甲苯氰二甲苯氰FF15%Ficoll(Type400)水溶液水溶液III0.25%溴酚蓝溴酚蓝40.25%溴酚蓝溴酚蓝%二甲苯氰二甲苯氰FF30%甘油水溶液甘油水溶液IV0.25440%(m/V)蔗糖水溶液蔗糖水溶液第11页/共43页第十二页，共44页。核酸核酸(h su
6、n)电泳的指示剂电泳的指示剂指示剂：溴酚兰、二甲苯青溴酚兰：在碱性液体中呈紫兰色，电泳(din yn)中，溴酚兰的迁移率与双链线性DNA片段二甲苯青：水溶液呈兰色，电泳(din yn)时，其迁移速率与双链线性DNA大致相当琼脂糖凝胶浓度琼脂糖凝胶浓度0.6%1%1.4%2%迁移率迁移率1Kb0.6Kb0.2Kb0.15Kb琼脂糖凝胶浓度琼脂糖凝胶浓度1%1.4%迁移率迁移率2Kb1.6Kb第12页/共43页第十三页，共44页。琼脂糖凝胶电泳分离(fnl)DNA3.电泳(din yn)第13页/共43页第十四页，共44页。琼脂糖凝胶电泳分离(fnl)DNA4.DNA染色(rns)溴化乙锭第14页
7、/共43页第十五页，共44页。核酸核酸(h sun)(h sun)电泳的染色剂电泳的染色剂溴化乙锭溴化乙锭一种荧光染料，EB分子可嵌入核酸双链的碱基对之间，在紫外线激发下，发出红色荧光可在凝胶电泳液中加入终浓度为0.5ug/ml的EB，有时亦可在电泳后，将凝胶浸入该浓度的溶液中染色1015min琼脂糖凝胶EB染色，肉眼可见(kjin)核酸电泳带，其DNA量一般5ng溴化乙锭太多，凝胶染色过深，核酸电泳带看不清时，可将凝胶放入蒸馏水浸泡30min后再观察ethidium bromide，EB第15页/共43页第十六页，共44页。第16页/共43页第十七页，共44页。琼脂糖凝胶电泳分离(fnl)D
8、NA5.结果(ji gu)观察第17页/共43页第十八页，共44页。第18页/共43页第十九页，共44页。DNADNA的迁移的迁移(qiny)(qiny)速率决定因素速率决定因素第19页/共43页第二十页，共44页。1 DNA 1 DNA分子分子(fnz)(fnz)的大小的大小 双链双链DNADNA分子分子(fnz)(fnz)迁移的速率与其迁移的速率与其碱基对数的常用对数近似成反比；碱基对数的常用对数近似成反比；2 2 琼脂糖浓度琼脂糖浓度 浓度越低，相同核酸分子浓度越低，相同核酸分子(fnz)(fnz)迁迁移越快；移越快；第20页/共43页第二十一页，共44页。3 DNA 3 DNA 3 D
9、NA 3 DNA的构象的构象的构象的构象 超螺旋环状线状切口环状。超螺旋环状线状切口环状。超螺旋环状线状切口环状。超螺旋环状线状切口环状。4 4 4 4 凝胶和电泳缓冲液中的溴化乙锭凝胶和电泳缓冲液中的溴化乙锭凝胶和电泳缓冲液中的溴化乙锭凝胶和电泳缓冲液中的溴化乙锭 溴化乙锭（溴化乙锭（溴化乙锭（溴化乙锭（EBEBEBEB）插入双链）插入双链）插入双链）插入双链DNADNADNADNA造成造成造成造成(zo chn)(zo chn)(zo chn)(zo chn)其负电其负电其负电其负电荷减少、刚性和长度增加。荷减少、刚性和长度增加。荷减少、刚性和长度增加。荷减少、刚性和长度增加。第21页/共
10、43页第二十二页，共44页。5 5 所用的电压所用的电压(diny)(diny)低电压低电压(diny)(diny)时时DNADNA片段迁移率片段迁移率与所用的电压与所用的电压(diny)(diny)成正比。成正比。6 6 琼脂糖种类琼脂糖种类 常见的有两种：标准琼脂糖和低熔常见的有两种：标准琼脂糖和低熔点琼脂糖；点琼脂糖；第22页/共43页第二十三页，共44页。样品的电荷效应和凝胶的筛选效应是分离(fnl)的主要依据n凝胶是由丙烯酰胺聚合(jh)而成聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）第23页/共43页第二十四页，共44页。在在TEMED(TEMED(四甲基乙二胺四甲基乙二胺)催化过硫酸铵催化过硫
11、酸铵还原产生的自由基的存在下，丙烯酰胺单还原产生的自由基的存在下，丙烯酰胺单体体(dn t)(dn t)的乙烯基聚合形成聚丙烯酰胺的乙烯基聚合形成聚丙烯酰胺的线状长链。的线状长链。在双功能交联剂如在双功能交联剂如N N，N-N-亚甲双丙烯酰亚甲双丙烯酰胺的参与下的共聚合反应中，聚丙烯胺的胺的参与下的共聚合反应中，聚丙烯胺的交联形成三维带状网格结构。交联形成三维带状网格结构。网格孔径的平均直径决定于丙烯酰胺和网格孔径的平均直径决定于丙烯酰胺和双功能交联剂的浓度。双功能交联剂的浓度。（一）聚丙烯酰胺凝胶的本质(bnzh)第24页/共43页第二十五页，共44页。n n优点优点n n 聚丙烯酰胺凝胶具
12、有机械强度好，有弹性，聚丙烯酰胺凝胶具有机械强度好，有弹性，透明，化学性质稳定，对透明，化学性质稳定，对pHpH和温度变化小，没有吸和温度变化小，没有吸附和电渗作用小的特点，是一种很好的电泳附和电渗作用小的特点，是一种很好的电泳(din(din yn)yn)支持介质。支持介质。第25页/共43页第二十六页，共44页。（二）（二）聚丙烯酰胺凝胶电泳种类聚丙烯酰胺凝胶电泳种类(zhngli)(zhngli)1 1 变性聚丙烯酰胺凝胶变性聚丙烯酰胺凝胶 用于单链用于单链DNADNA片段的分离或纯化。片段的分离或纯化。变性的变性的DNADNA在这些在这些(zhxi)(zhxi)凝胶中的凝胶中的迁移率几
13、乎与其碱基组成及序列完全无迁移率几乎与其碱基组成及序列完全无关。关。用途：放射性用途：放射性DNADNA探针的分离、探针的分离、DNADNA测序测序反应等。反应等。第26页/共43页第二十七页，共44页。2 非变性聚丙烯酰胺凝胶非变性聚丙烯酰胺凝胶 用于双链用于双链DNA片段片段(pin dun)的分离和纯化。的分离和纯化。注：迁移率受其碱基组成和序列注：迁移率受其碱基组成和序列的影响。的影响。用途：制备高纯度的用途：制备高纯度的DNA片段片段(pin dun)。第27页/共43页第二十八页，共44页。染色染色考马斯亮蓝染色考马斯亮蓝染色 考马斯亮兰考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中染料，
14、在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰(lmax)的位置的位置(wi zhi)，由，由465nm变变为为 595nm，溶液的颜色也由棕黑色变，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。通过测定为兰色。通过测定595nm处光吸收的处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。研增加量可知与其结合蛋白质的量。研究发现，染料主要是与蛋白质中的碱究发现，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸性氨基酸(特别是精氨酸特别是精氨酸)和芳香族氨和芳香族氨基酸残基相结合。基酸残基相结合。第28页/共43页第二十九页，共44页。银染色银染色 银染色液中的银离子银染色液中的银离子(Ag)可与核酸形成可
15、与核酸形成稳定的复合物，然后用还原剂如甲醛稳定的复合物，然后用还原剂如甲醛(ji qun)使使Ag 还原成银颗粒，可把还原成银颗粒，可把核酸电泳带染色黑褐色。主要用于聚丙核酸电泳带染色黑褐色。主要用于聚丙烯酰胺凝胶电泳染色。烯酰胺凝胶电泳染色。也用于琼脂糖也用于琼脂糖凝胶染色。其灵敏度比凝胶染色。其灵敏度比EB高高200倍。但倍。但银染色后，银染色后，DNA不宜回收。不宜回收。第29页/共43页第三十页，共44页。DNA DNA在聚丙烯胺凝胶中的有效分离在聚丙烯胺凝胶中的有效分离(fnl)(fnl)范围范围丙烯酰胺浓度丙烯酰胺浓度（%）有效分离范围有效分离范围（bp）二甲苯氰二甲苯氰FF溴酚蓝
16、溴酚蓝3.5100020004601005.080500260658.0604001604512.040200702015.025150601520.061004512注:N,N-亚甲双丙烯酰胺的浓度(nngd)为丙烯酰胺的1/30;第30页/共43页第三十一页，共44页。PAGE电泳装置第31页/共43页第三十二页，共44页。PAGE的结果(ji gu)观察考马斯蓝染色(rns)凝胶成像仪扫描(somio)第32页/共43页第三十三页，共44页。第33页/共43页第三十四页，共44页。末端(m dun)终止法Sanger2，3双脱氧核苷三磷酸（ddNTP）是DNA合成链延伸的抑制剂。核苷酸序
17、列(xli)测定第34页/共43页第三十五页，共44页。第35页/共43页第三十六页，共44页。第36页/共43页第三十七页，共44页。第37页/共43页第三十八页，共44页。第38页/共43页第三十九页，共44页。第39页/共43页第四十页，共44页。DNA序列分析仪：四色荧光(ynggung)基团标记的dNTP第40页/共43页第四十一页，共44页。（二）DNA的化学法测序：由Maxam和Gilbert所发明。其基本原理是用特异的化学试剂作用于DNA分子中的不同碱基，然后用哌啶切断反应碱基的多核苷酸链。用4组不同的特异反应，可使末端标记的DNA分子切成不同长度的片断，其末端都是该特异的碱基。经变性胶电泳和放射(fngsh)自显影得到测序图谱 第41页/共43页第四十二页，共44页。n基本介绍 利用电泳现象对混合物进行分离分析的技术n工作原理 样品的电荷效应 凝胶的筛选效应n介绍常用方法 琼脂糖凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳n常用核酸(h sun)测序方法nSANGER双脱氧链终止法的原理作业(zuy)第42页/共43页第四十三页，共44页。感谢您的观看(gunkn)。第43页/共43页第四十四页，共44页。