分子标记辅助选择育种课件.ppt

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1、 分子标记辅助选择育种一、概念：DNA 分子标记：指以DNA 遗传多态性为基础的一类遗传标记。二、分子标记的优点 能稳定遗传；多态性高、揭示的信息量大；无表型效应；不受环境影响；不受组织和发育阶段的影响；表现中性 三、分子标记种类（一）基于Southern 杂交的分子标记 RFLP(restrictionfragmentlengthpolymorphism，限制性内切酶酶切片段长度多态性)标记；（2）特异引物PCR 标记：SSR(simplesequencerepeats，简单序列重复，微卫星)标记；STS(sequencetagged-site，序列标签位点)标记；DD-PCR(differ

2、entialdisplayPCR，差异显示PCR)标记。PCR procedure5 amplicon 33 5945672Cycle 1 2分子（三）基于PCR 和限制性酶切的分子标记 AFLP(amplified fragment length polymorphism，PCR 扩增限制性内切酶酶切片段长度多态性)标记；主要类型DNA 分子标记的比较4.1RFLP标记 1980年，Botstein和White等构建了人类遗传连锁图，500多个RFLP位点，定位了Huntington病，CF（囊性纤维化）和癌相关基因（APC，DCC 等）。四、分子标记的原理和遗传特点RAPD(Randoml

3、y Amplified Polymorphism DNA)引物 1 2 3 4 510mer 序列随机商业购买种类无限4.3SSR 标记SSR是一类由2-4个核苷酸为重复单位组成的长达几十个核苷酸片段的串联重复序列，其两侧由特异序列构成。首先发现于人类基因组中，现已发现存在于许多真核生物中，如哺乳动物、鱼类、鸟类、昆虫类、单子叶植物、双子叶植物中SSR也广泛存在。基本原理：以重复序列及两侧的特异序列作模板，以与特异序列互补的特异引物来扩增SSR等位基因，扩增产物在高浓度的琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶上电泳检测。多态性来源:通常是SSR结构内部重复单元的数量变化或重复单元的序列变异引起的。A 9

4、repeatsB 5 repeatsC 13 repeatsPCRABCSSR多态性分析示意图ABC分别代表不同的基因型40共显性标记 优点：高多态性；SSR位点在染色体上分布均匀；引物具有一定的通用性；共显性标记；缺点：可用的位点数目少；设计引物的费用高，耗时长；物种专一性；引物的开发有一定难度。Simple Sequence Repeats SSR水稻RM163位点上的25个等位基因玉米回交群体的SSR图谱水稻25份种质的SSR分析394.5ISSR 标记（Inter-simplesequencerepeats）Zietkiewicz提出，检测的是两个SSR之间的一段短DNA序列上的多态性

5、。原理：利用真核生物基因组中广泛存在的SSR序列，设计出各种能与SSR序列结合的PCR引物，对两个相距较近、方向相反的SSR序列之间的DNA区段进行扩增。4.6 SSCP(单链构象的多态性)(Single Strand Conformation Polymorphism)ATGC变性 复性SSCP(单链构象的多型性)(Single Strand Conformation Polymorphism)家 猪 氟 烷 基 因 SSCP 图 谱 MNAAAAAAAAAAAmRNAMNAAAAAAAAAAANMTTTTTTTTTTTTT扩增 电泳回收，克隆测序，探针MNAAAAAAAAAAANMTTTT

6、TTTTTTTTTcDNA4.7 DD-PCR(Differential display-PCR)3端锚定引物:11个或12个连续的T加上两个3-端锚定的脱氧核苷酸组成10-mer的随机引物DD-PCR(基于PCR的差异显示)技术：cDNA 合成random primer PCR anchor primer PCR依赖：等位基因在转录水平上的差异表达；等位基因的结构变异；技术：Rare cutter RE(6 Nt site，EcoRI)Frequency cutter RE(4 Nt site，TaqI，MseI)adapter sequence primer(adapter+Cutting

7、 site)PCR&PAGE 依赖：RE切点的突变 切点3序列的突变4.8 AFLP标记 1993年 Zabeau 和Vos发明 是RFLP 和PCR相结合的一种技术。酶切连接预扩增选择性扩增电泳AgNO3染色基因组DNA的提取结果分析AFLP procedure AFLP引物1.核心碱基序列(core)：与接头互补2.限制性内切酶识别序列（ENZ)3.引物3末端的选择碱基(EXT)EcoRI adaptor:5-CTCGTAGACTGCGTACC-3 3-CTGACGCATGGTTAA5 E00:5-GACTGCGTACCAATTC3MseI adaptor:3AATGAGTCCTGAGTA

8、G5 M005 TACTCAGGACTCAT-3 3GAGTCCTGAGTAGCAG-552优点：只需要极少量的DNA模板；不需要Southern杂交；不需要预先知道DNA的序列信息；重复性好，可快速获得大量信息。缺点：受专利保护51 AFLP(Amplified Fragment Length Polymorphism)五、分子标记在生物技术中的应用1.建立高密度的遗传连锁图谱2.遗传多样性和物种亲缘关系3.利用DNA分子标记可以鉴别品种，评估 品种纯度4.育种中的分子标记辅助选择 第二节 重要农艺性基因连锁标记的筛选技术一、MAS 育种的分子标记具备的条件1.分子标记与目标基因紧密连锁2.

9、标记适用性强,重复性好,经济简便的检测大量个体3.不同遗传背景选择有效二、遗传图谱构建与重要农艺性状基因的标记 把分子标记定位在物种的染色体上或连锁群上而构建分子遗传连锁图谱的过程。C0061.1Satt0381.0B053V0.9Satt3092.1rhg1rhg10.5UMN-BACK91.0UMN-BAC118Bng122DcMSat_163Sat_141Satt61011、构建遗传图谱的意义：、构建遗传图谱的意义：确定不同分子标记在染色体上的相对位置或排列情况，为作物种质资源收集、目标基因定位、基因克隆、育种规模大小及相应育种方法的确定等提供理论依据。但是，由于分子标记数目的限制，目前

10、作图亲本的选用首先考虑亲本间的多态性水平，育种目标性状考虑较少。大豆SSR图谱4066第二同源群遗传连锁图672 2、遗传作图的原理、遗传作图的原理 与经典连锁检测一致，即基于染色体的交换与重组 用重组率来表示基因间的遗传距离。交换值是两个基因间发生交换的频率。重组率是重组型配子占总配子数的百分数1%的交换率作为一个遗传学图距单位（厘摩）centimorgan33、遗传图谱构建的主要环节、遗传图谱构建的主要环节首先，需要选择适合作图的DNA标记技术其次，选择合适的亲本组合然后，需要建立一个适合于作图的分离群体（F2、BC1、重组近交系、双单倍体群体等）随后，对分离群体中的每个个体的标记基因型进

11、行检测与分析 最后，对分离群体内的每个个体的标记基因型数据进行遗传连锁分析，构建分子标记遗传连锁图谱。4 4、用于分子标记的遗传作图群体、用于分子标记的遗传作图群体Mardler百农3217的近等基因系 确定育种性状确定有极端差异的亲本构建遗传分离群体表型分析遗传分离群体分子标记鉴定基因型构建分子连锁图谱获得与目标性状紧密连锁的分子标记70200个标记鉴定亲本多态性70300 lines F2、BC或RILMapMakerJoinMapVariance analysisMapMaker/QTLBSA法分子标记质量性状数量性状二、分子标记与基因定位 基 因 的 分 子 标 记 定 位RfDuQT

12、L971.NIL（Near-isogenic lines）分析法的原理：如果一对近等基因系在目标性状上表现差异，那么凡是能在这对近等基因系之间揭示多态性的分子标记就可能位于目标基因的附近。因此利用NIL材料，可以寻找与目标基因紧密连锁的分子标记。（一）质量性状的分子标记基本步骤：1）筛选与目标基因连锁的分子标记：利用分子标记技术分析一对近等基因系，筛选在两者间表现出多态性的引物或探针。2）进行标记与目的基因连锁的验证：利用多态性标记/探针对近等基因系间杂交分离群体中的单株进行筛选，确定每个单株的标记基因型。同步对分离群体中单株的目标性状进行调查。3）基因定位：利用Mapmaker等软件确定目标

13、性状与标记之间的连锁关系，并计算遗传距离和绘制连锁图。Michelmore（1991）“分离集团分析法”（Bulked Segregate Analysis BSA）1.BSA分析法的原理 在作图群体中，依据目标性状表型的相对差异将个体或株系分成两组，分别将两组中的个体或株系的DNA等量混合，形成相对的DNA池。这两个DNA池之间除了在目标基因座所在染色体区域的DNA组成上存在差异外，来自基因组其它部分的DNA组成应该是完全相同或基本相同的，即两DNA池间差异相当于两近等基因系基因组之间的差异，或者说构成了一对近等基因DNA池。因此在这两个DNA池之间表现出多态性的DNA标记，就有可能与目标基

14、因连锁。F1F2 群体AAaaAaA基因池a基因池BSA法2.基本步骤1）根据目标性状表型或基因型的相对差异构建两个近等DNA池或代表群，寻找在两者之间表现多态性的标记。2）利用分离群体验证候选标记是否与目标基因紧密连锁。3）根据标记基因型的分离比例和单株目标性状分离比例进行遗传作图。抗、感基因池间引物筛选F2代单株PCR扩增MAPMAKER/EXP（V3.0b）分析F2扩增结果亲本、F1、F2 DNA提取亲本间引物筛选Kosambi函数将重组值转换为遗传图距SSR体系建立（二）数量性状的分子标记数量性状的遗传是受多基因控制的，遗传基础复杂，易受环境因素影响，表现为连续变异，表现型与基因型之间

15、没有明确的对应关系。因此长期以来对数量性状的遗传研究只能借助于数理统计的手段，将控制数量性状的多基因系统作为一个整体来研究，使人们无法了解单个基因在基因组中的位置和效应，制约了人们在育种中对数量性状的遗传操纵能力。而分子标记的出现为深入研究数量性状的遗传基础提供了可能。控制数量性状的基因在基因组中的位置称为数量性状基因座（QTL）。借助与QTL连锁的分子标记，在育种中人们就能够对有关QTL的遗传进行追踪，提高对数量性状优良基因型选择的准确性和预见性。基于性状的分析法 基于性状的分析法（trait-based analysis，TB）以数量性状表型为依据进行分组。基于标记的分析法 基于标记的分析

16、法（marker-based analysis，MB）以标记基因型为依据进行分组1.主要途径：常用的主要有区间作图法、复合区间作图法、多元回归法、已知完整连锁图作图法等，并开发出一些功能很强的软件包，如Map Manager、Mapmaker/QTL、Linkage、WinQTLCart等。这些程序包都可以从因特网上免费下载（）。利用这些方法，可将控制某一数量性状的多个QTL进行分解，像研究质量性状一样，将它们分别定位于染色体上，并分析各个QTL的单个效应及互作效应。2.QTL定位的主要方法第三节 作物MAS 育种方法一、作物MAS 育种需具备的条件 分子标记与目标基因共分离或紧密连锁 具有在

17、大群体中利用分子标记进行筛选的有效手段 重复性好、经济、易操作二、MAS的回交育种方法（一）回交育种 受体亲本 受体亲本 供体亲本 供体亲本(不含优质基因 不含优质基因)()(含优质基因 含优质基因)F F1 1 受体亲本 受体亲本BC BC1 1目标基因定位 目标基因定位标记辅助选择 标记辅助选择 中选 中选BC BC1 1 受体亲本 受体亲本(含优质基因 含优质基因)BC BC2 2BC BC3 3标记辅助选择 标记辅助选择标记辅助选择 标记辅助选择中选 中选BC BC3 3(含优质基因 含优质基因)新育成的优质品种 新育成的优质品种(受体亲本遗传本背景 受体亲本遗传本背景+优质基因 优质

18、基因)自 自交 交目标基因的定位与标记辅助回交育种相结合程序图 中选 中选BC BC1 1 受体亲本 受体亲本(含优质基因 含优质基因)81（二）大范围群体内的单目标基因SLS-MAS（Single large-scale MAS)1.选择用于MAS 的优异亲本。2.确定该重要农艺性状QTL 标记 3.结合QTL 标记的筛选，对分离群体中单株进行SLS-MAS。4.根据中选位点选择目标材料单株自交育成新品种（三）MAS 聚合育种方法 受体亲本 受体亲本 供体亲本 供体亲本A A(无优质基因 无优质基因)()(含优质基 含优质基因 因A)A)受体亲本 受体亲本 供体亲本 供体亲本B B(无优质基

19、因 无优质基因)()(含优质基 含优质基因 因B)B)F1(F1(含优质基因 含优质基因A)F1(A)F1(含优质基因 含优质基因B)B)复杂杂种 复杂杂种(分离群体 分离群体)受体亲本 受体亲本 供体亲本 供体亲本C C(无优质基因 无优质基因)()(含优质基因 含优质基因C)C)中选杂种个体 中选杂种个体F1 F1(含优质基因 含优质基因A A和 和B)(B)(含优质基因 含优质基因C)C)复杂杂种 复杂杂种(分离群体 分离群体)中选杂种个体 中选杂种个体 受体亲本 受体亲本(含优质基因 含优质基因A A、B B和 和C)C)新育成的优质品种 新育成的优质品种(受体亲本遗传背景 受体亲本遗

20、传背景+优质基因 优质基因A A、B B和 和C)C)回交 回交12 12代，标记辅助选择 代，标记辅助选择自交 自交标记辅助选择 标记辅助选择标记辅助选择 标记辅助选择标 标记 记辅 辅助 助基 基因 因聚 聚合 合与 与品 品质 质改 改良 良相 相结 结合 合程 程序 序图 图84三、提高分子标记的筛选效率 多重PCR 方法 用斥相分子标记进行选择 克服连锁累赘 降低MAS 育种的成本（一）多重（一）多重PCRPCR方法方法 为了增加标记的筛选效率，当同时筛选到与2个或2个以上目标性状连锁的几个不同的分子标记时，如果这几个分子标记的扩增产物具有不同长度，则一对以上的引物可在同一PCR条件

21、下同时反应。（二）用相斥相分子标记进行育种选择（二）用相斥相分子标记进行育种选择 所谓相斥相分子标记指与目标性状相斥连锁的分子标记，即有分子标记，植株不表现目标性状；无分子标记，植株表现目标性状。通过相斥标记（特别是显性标记）的选择，可将群体中含标记而不含目标性状基因的纯合体、含目标性状基因的杂合体全部剔除，仅剩下无标记而含目标性状基因的植株。（三）克服连锁累赘（三）克服连锁累赘 回交育种是作物育种常用的育种方法，但回交育种中长期以来存在的问题是在回交过程中，目的基因与其附近的非目的基因存在连锁，一起导入受体，导致改良的品种与预期的目标不一致，这种现象称为连锁累赘(Linkage drag)。

22、利用与目标性状紧密连锁的分子标记进行辅助选择可以显著地减轻连锁累赘的程度。如利用目标性状基因左右两侧1cM之内的标记只需2个世代即可从分离群体中筛选出供体DNA片段最小但携带目标基因的个体，而传统的选育方法可能平均需要100代。（四）降低（四）降低MASMAS成本的策略成本的策略u样品DNA提取。采用微量提取法如利用小量组织或半粒种子且不需液氮处理的DNA提取技术。且不采用特殊化学药品，降低成本。u减少PCR反应时的体积。如将反应体积从25l降低到1015 l。u琼脂糖凝胶。实验表明同一琼脂糖凝胶可以多次电泳载样，而不会造成样品间互相干扰，因此可以多次重复使用。u扩增产物检测。通过改造染色系统，利用亚甲蓝、甲烯蓝染琼脂糖凝胶，可直接在可见光下检测。