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1、中国药典中国药典2005版微生物限度版微生物限度检查法增修定内容检查法增修定内容中中国国药药典典2005版版微微生生物物限限度度检检查查法法在在检检查查项项目目、格式、语言表述等方面都有较多的增定和修订。格式、语言表述等方面都有较多的增定和修订。增增订订中中主主要要的的有有四四项项：一一是是三三菌菌数数测测定定的的方方法法验验证证；二二是是控控制制菌菌检检查查的的方方法法验验证证；三三是是大大肠肠菌菌群群检检查法；四是梭菌检查法。查法；四是梭菌检查法。前言前言增订增订微生物限度检查微生物限度检查在环境的洁净度在环境的洁净度10000级级和局部和局部100级级的单向流空气区域内进行，其全过程应严
2、格遵守无的单向流空气区域内进行，其全过程应严格遵守无菌操作，以防再污染。单向流空气区域、工作台面菌操作，以防再污染。单向流空气区域、工作台面及环境必须定期按国家医药工业洁净室及环境必须定期按国家医药工业洁净室(区区)悬浮悬浮粒子、浮游菌粒子、浮游菌和沉降菌测试方法现行标准进行洁和沉降菌测试方法现行标准进行洁净度验证。净度验证。隔离系统隔离系统按相关的要求进行验证，其内按相关的要求进行验证，其内部环境的洁净度须符合无菌检查的要求。部环境的洁净度须符合无菌检查的要求。培培养养基基、稀稀释释剂剂、实实验验器器具具等等的的灭灭菌菌，按按灭灭菌菌法法（见见附录附录XVII）的要求采用）的要求采用验证合格
3、的灭菌程序灭菌。验证合格的灭菌程序灭菌。(培养基配制、灭菌、质量与使用培养基配制、灭菌、质量与使用)培培养养温温度度细细菌菌和和控控制制菌菌的的培培养养温温度度未未改改动动。霉霉菌菌和和酵酵母菌的培养温度母菌的培养温度20-25改为改为23-28。抽样量和抽样量和检验量虽检验量虽分别单列，但突出的是分别单列，但突出的是检验量。检验量。以以检检验验量量为为标标题题，抽抽样样量量列列在在检检验验量量叙叙述述完完了了之之后后。即即一一般般随随机机抽抽样样不不少少于于检检验验用用量量（2个个以以上上最最小小包包装装）的的3倍量倍量。检验量检验量指供试品一次检验的用量。一般为指供试品一次检验的用量。一般
4、为10g或或10ml；化学药膜剂为；化学药膜剂为100cm2；贵重或微量包装的药；贵重或微量包装的药品可酌减（不得少于品可酌减（不得少于3g）。检查沙门菌的供试品其）。检查沙门菌的供试品其检验量增加检验量增加10g或或10ml。培培养养基基、试试药药、试试液液、指指示示液液、稀稀释释剂剂的的配配制制和和微微生生物物限限度度标标准准均均编编排排在在检检查查法法后后。英英美美药药典典将将培培养养基、稀释剂放在供试液制备之前。基、稀释剂放在供试液制备之前。供供试试液液的的制制备备用用pH7.0无无菌菌氯氯化化钠钠蛋蛋白白胨胨缓缓冲冲液液制制备备供供试试液液或或选选用用适适宜宜的的乳乳化化剂剂、分分散
5、散剂剂、中中和和剂剂制制备备供供试试液液；其其用用量量应应验验证证，在在该该检检验验条条件件无无抗抗菌菌作作用用。供试液制备妥后供试液制备妥后不得超过不得超过1h就加入检验用培养基。就加入检验用培养基。7类供试品供试液的制备，其中非水溶性供试品类供试品供试液的制备，其中非水溶性供试品供供试试品品5g，司司盘盘80、单单硬硬脂脂酸酸甘甘油油酯酯、聚聚山山梨梨酯酯80供供试试品品10g，20ml无无菌菌十十四四烷烷酸酸异异丙丙酯酯和和无无菌菌玻玻璃璃珠珠，必必要要时时再再加加适适量量十十四四烷烷酸酸异异丙丙酯酯，充充分分振振摇摇，使使供供试试品品溶溶解解。然然后后加加45100mlpH7.0蛋蛋白
6、白胨胨氯氯化化钠钠缓缓冲冲液液，振振摇摇5-10分分钟钟，萃萃取取，待待油油水水分分层层后后，水层过滤，贴膜培养。水层过滤，贴膜培养。气气雾雾剂剂、喷喷雾雾剂剂供供试试品品取取规规定定量量供供试试品品，置置冷冷冻冻室室冷冷冻冻1h，取取出出，迅迅速速消消毒毒供供试试品品开开启启部部位位周周围围，用用无无菌菌钢钢锥锥钻钻一一小小孔孔，放放置置室室温温，并并轻轻轻轻转转动动容容器器，使使抛抛射射剂剂全全部部抛抛出出。以以无无菌菌注注射射器器吸吸出出全全部部药药液液，按按标标示示量量加加稀稀释释剂剂至至足足量量（若若含含非非水水溶溶性性成成份份，加加适适量量无无菌菌聚聚山山梨梨酯酯-80液液），使使
7、匀匀，取取相相当当于于10g或或10ml的供试品，再稀释成的供试品，再稀释成1 10的供试液。的供试液。具抑菌活性的供试品具抑菌活性的供试品当当供供试试品品具具有有抑抑菌菌活活性性时时，应应将将供供试试液液中中的的抑抑菌菌活活性性消消除除后后，方方能能依依法法检检查查。常常用用的的方方法有：法有：培培养养基基稀稀释释法法取取规规定定量量的的供供试试液液，至至较较大大量量的的培培养养基基中中，使使单单位位体体积积内内的的供供试试品品含含量量减减少少至至不不具具抑抑菌菌作作用用。测测定定细细菌菌、霉霉菌菌及及酵酵母母菌菌的的菌菌数数时时，取取同同稀稀释释级级2ml供供试试液液等等量量分分注注多多个
8、个平平皿皿，按按浇浇碟碟法法操操作作，培培养养、计计数数。每每1ml供供试试液液所所注注各各平平皿皿生生长长的的菌菌数数之之和和即即为为1ml的的菌菌落落数数，取取平平均均菌菌落落数数乘乘以以稀稀释释倍倍数数的的值值按按菌菌数数报告规则报告菌数。报告规则报告菌数。控制菌检查时，可加大增菌培养基的用量。控制菌检查时，可加大增菌培养基的用量。离心沉淀集菌法离心沉淀集菌法取取规规定定量量的的供供试试液液，3000转转/分分离离心心20min（供供试试液液如如有有沉沉淀淀，先先以以500转转/分分离离心心5min，取取全全部部上上清清液液再再离离心心），弃弃去去上上清清液液，留留底部集菌液约底部集菌液
9、约2ml，加稀释剂至原规定量。，加稀释剂至原规定量。薄膜过滤法薄膜过滤法采用开放式薄膜过滤器。采用开放式薄膜过滤器。中中和和法法凡凡含含汞汞、砷砷或或防防腐腐剂剂等等具具有有抑抑菌菌作作用用的的供供试试品品，可可用用适适宜宜的的中中和和剂剂或或灭灭活活剂剂消消除除其其抑抑菌菌成成分分。中中和和剂剂或或灭灭活活剂剂可可加加在在所所用用的的稀释剂或培养基中。稀释剂或培养基中。验证用菌株及菌液的制备验证用菌株及菌液的制备菌株（代表性）菌株（代表性）大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念株菌、白色念株菌、黑曲霉菌黑曲霉菌。菌液制备（菌种传代、保存及使
10、用菌液制备（菌种传代、保存及使用5代）代）大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌接种营养肉汤，白色念株菌接种真菌培养基、接种营养肉汤，白色念株菌接种真菌培养基、黑曲霉黑曲霉接种真菌培养基斜面，置规定温度、时接种真菌培养基斜面，置规定温度、时间，培养。取培养物用间，培养。取培养物用0.9%无菌氯化钠溶液无菌氯化钠溶液稀释成稀释成1ml含含50100cfu的菌液。的菌液。（黑曲霉菌液制备、比浊法计数）（黑曲霉菌液制备、比浊法计数）验证方法验证方法 试试验验组组取规规定定量量最最低低稀稀释释级级的的供供试试液液1ml，和和50100cfu试试验验菌菌，每每株
11、株菌菌做做2个个平平板板，按按平平板板菌菌落落计计数数方方法法测测定定其其菌菌数数。采采用用薄薄膜膜过过滤滤法法计计数数时时，最最后一次冲洗液中加入后一次冲洗液中加入50-100cfu，过滤，培养，计数。，过滤，培养，计数。菌液组菌液组测定加入的试验菌液的菌数。测定加入的试验菌液的菌数。供供试试品品对对照照组组取取规规定定量量的的供供试试液液，按按平平板板法法测测定供试品稀释液本底的菌数。定供试品稀释液本底的菌数。稀释剂对照组稀释剂对照组取稀释液，加入试验菌，使菌浓取稀释液，加入试验菌，使菌浓度为每度为每1ml供试液含供试液含50100cfu，按试验组的供试液，按试验组的供试液制备方法和菌落计
12、数方法测定其菌数。制备方法和菌落计数方法测定其菌数。验证试验应独立平行进行验证试验应独立平行进行3次，分别计算各次试次，分别计算各次试验菌的回收率。验菌的回收率。2.检查法检查法（1）平皿法）平皿法增订增订阴性对照试验阴性对照试验取试验用的稀释剂取试验用的稀释剂1ml，于无菌平皿中，注培养基，于无菌平皿中，注培养基，凝固，培养。每种计数培养基各做凝固，培养。每种计数培养基各做2个平板，均不得个平板，均不得长菌。长菌。修订修订细菌、霉菌和酵母菌计数的培养时间。细菌一般细菌、霉菌和酵母菌计数的培养时间。细菌一般48h，真菌，真菌72h；必要时，可适当延长培养时间必要时，可适当延长培养时间5-7天。
13、天。（细菌培养时间（细菌培养时间USP48-72h，Ep5天；真菌培养时间天；真菌培养时间USP5-7天，天，EP5天。平皿法；天。平皿法；BP平皿法和涂抹法）平皿法和涂抹法）定量菌液滴种平皿法。影响计数的因素：定量菌液滴种平皿法。影响计数的因素：在特殊情况下，营养琼脂培养基上长霉菌、酵母菌或在特殊情况下，营养琼脂培养基上长霉菌、酵母菌或玫瑰红钠琼脂培养基上长细菌，则应分别点计霉菌、玫瑰红钠琼脂培养基上长细菌，则应分别点计霉菌、酵母菌、细菌菌落数，以菌落数高的培养基中的菌酵母菌、细菌菌落数，以菌落数高的培养基中的菌数为计数结果报告。数为计数结果报告。当当同同时时有有2个个稀稀释释级级的的菌菌落
14、落数数符符合合上上述述规规定定时时，视视两两者者比比值值（比比值值为为高高稀稀释释级级的的菌菌落落数数乘乘以以稀稀释释倍倍数数的的值值除除以以低低稀稀释释级级的的菌菌落落数数乘乘以以稀稀释释倍倍数数的的值值）而而定定。若若比比值值不不大大于于2，以以两两稀稀释释级级的的菌菌落落数数乘乘以以稀稀释释倍倍数数的的均均值值报报告告菌菌数数；若若比比值值大大于于2但但不不超超过过5时时，以以低低稀稀释释级级的的菌菌落落数数乘乘以以稀稀释释倍倍数数的的值值报报告告菌菌数数。当当出出现现比比值值大大于于5，或或高高稀稀释释级级的的菌菌落落数数大大于于或或等等于于低低稀稀释释级级的的菌菌落落数数等等异异常常
15、情情况况时时，应应查查明明原原因因再再行行检查，必要时，应进行方法的重新验证。检查，必要时，应进行方法的重新验证。当当各各稀稀释释级级的的平平均均菌菌落落数数均均小小于于30，以以最最低低稀稀释释级的平均菌落数乘以稀释倍数的值报告菌数。级的平均菌落数乘以稀释倍数的值报告菌数。各各稀稀释释级级的的平平板板均均无无菌菌落落生生长长，或或仅仅最最低低稀稀释释级级的的平平板板有有菌菌落落生生长长，但但平平均均菌菌落落数数小小于于1时时，以以1乘以最低稀释倍数的值报告菌数。乘以最低稀释倍数的值报告菌数。（2）薄膜过滤法）薄膜过滤法增订增订滤膜孔径直径、材质、过滤等相关的要求。滤膜孔径直径、材质、过滤等相
16、关的要求。取取相相当当于于1g或或1ml供供试试品品的的供供试试液液，加加至至100ml稀稀释释剂剂中中，混混匀匀，过过滤滤。用用pH7.0无无菌菌氯氯化化钠钠-蛋蛋白白胨胨缓缓冲冲液液或或其其它它适适宜宜的的冲冲洗洗液液冲冲洗洗滤滤膜膜，冲冲洗洗方方法法和和冲冲洗洗量量同同“方方法法的的验验证证”。冲冲洗洗后后取取出出滤滤膜膜，菌菌面面朝朝上上贴贴于于营营养养琼琼脂脂培培养养基基或或玫玫瑰瑰红红钠钠琼琼脂脂培培养养基基或或酵酵母母浸浸出出粉粉胨胨葡葡萄萄糖糖琼琼脂脂培培养养基基平平板板上上培培养养。每每种种培培养基至少制备一张滤膜。养基至少制备一张滤膜。控制菌检查控制菌检查 增订1.控制菌检
17、查方法的验证控制菌检查方法的验证对对供供试试品品进进行行控控制制菌菌检检查查时时，应应对对检检查查法法的的科科学学、准准确确性性进进行行验验证证，以以确确认认所所采采用用的的方方法法是是否否适适合合该该药药品品的的控控制制菌菌检检查查。若若药药品品的的组组分分或或原原法法的的检检验验条条件件有有改改变变可可能能影影响响检检验结果的准确性，检查法法应重新验证。验结果的准确性，检查法法应重新验证。验验证证时时按按各各品品种种项项下下微微生生物物限限度度规规定定控控制制菌菌选选择择相相应应菌菌株株验验证证，验验证证大大肠肠菌菌群群检检查查法法时时，应应用用大大肠肠埃埃希希菌菌作作为为验验证证菌菌株株
18、。验验证证试试验验按按供供试试液液的的制制备备和和控控制制菌菌检检查查法法的的规规定定及及下列要求进行。下列要求进行。菌菌株株大大肠肠埃埃希希菌菌、金金黄黄色色葡葡萄萄球球菌菌、乙乙型型副副伤伤寒寒沙沙门菌、铜绿假单胞菌、生孢梭菌。门菌、铜绿假单胞菌、生孢梭菌。菌菌液液制制备备将将大大肠肠埃埃希希菌菌、金金黄黄色色葡葡萄萄球球菌菌、乙乙型型副副伤伤寒寒沙沙门门菌菌、铜铜绿绿假假单单胞胞菌菌的的新新鲜鲜培培养养物物接接种种营营养养肉肉汤汤、生生孢孢梭梭菌菌新新鲜鲜培培养养物物接接种种硫硫乙乙醇醇酸酸盐盐流流体体培培养养基基，培培养养18-24h，取取培培养养物物1ml用用0.9%无无菌菌氯氯化化
19、钠溶液稀释至钠溶液稀释至1ml含含10-100cfu。验证方法验证方法试试验验组组：取取规规定定量量供供试试液液及及10100cfu试试验验菌菌加加入入增增菌菌培培养养基基中中，依依相相应应控控制制菌菌检检查查法法进进行行检检查查。当当采采用用薄薄膜膜过过滤滤法法时时，取取供供试试液液，过过滤滤、冲冲洗洗，试试验验菌菌应应加加在在最最后后一一次次冲冲洗洗液液中中，过过滤滤后后，取取出出滤滤膜膜接接入增菌培养基中。入增菌培养基中。阴阴性性菌菌对对照照组组：设设立立阴阴性性菌菌对对照照组组的的目目的的是是为为了了验验证证该该控控制制菌菌检检查查方方法法的的特特异异性性。方方法法同同试试验验组组，验
20、验证证大大肠肠埃埃希希菌菌、大大肠肠菌菌群群、沙沙门门菌菌检检查查法法时时的的阴阴性性对对照照菌菌采采用用金金黄黄色色葡葡萄萄球球菌菌；验验证证铜铜绿绿假假单单胞胞菌菌、金金黄黄色色葡葡萄萄球球菌菌检检查查法法时时的的阴阴性性对对照照菌菌采采用用大大肠肠埃埃希菌。阴性对照菌不得检出。希菌。阴性对照菌不得检出。结结果果判判定定阴阴性性菌菌对对照照组组不不得得检检出出阴阴性性对对照照菌菌。若若试试验验组组检检出出试试验验菌菌，按按此此供供试试液液制制备备法法和和控控制制菌菌检检查查法法进进行行供供试试品品的的该该控控制制菌菌检检查查；试试验验组组未未检检出出试试验验菌菌，应应采采用用稀稀释释法法、
21、离离心心沉沉淀淀集集菌菌法法、薄薄膜膜过过滤滤法法、中中和和法法等等方方法法或或联联合合使使用用这这些些方方法法消消除除供供试试品品的的抑抑菌活性，并重新验证。菌活性，并重新验证。验证试验可与供试品的控制菌检查同时进行。验证试验可与供试品的控制菌检查同时进行。2.检查法检查法供供试试品品的的控控制制菌菌应应按按已已验验证证的的方方法法进进行行控控制制菌菌检检查查，增增菌菌培培养养基基的的实实际际用用量量同同“方方法法的验证的验证”。阳性对照试验阳性对照试验供供试试品品进进行行控控制制菌菌检检查查时时，应应做做阳阳性性对对照照试试验验。阳阳性性对对照照试试验验的的加加菌菌量量为为10100cfu
22、，方方法法同同供供试试品品的的控控制制菌菌检检查查。阳阳性性对对照照试试验应检出相应的控制菌。验应检出相应的控制菌。阴性对照试验阴性对照试验取取稀稀释释剂剂10ml加加入入100ml（或或200ml）相相应应控控制制菌菌检检查查用用的的增增菌菌培培养养基基中中，培培养养，应应无菌生长。无菌生长。控制菌检查的步骤：控制菌检查的步骤：取取供供试试液液接接种种增增菌菌培培养养基基，增增菌菌、分分离离培培养养，革革兰兰染染色色、生生化化试试验验等等基基本本未未变变动动，仅仅一一些些控控制制菌菌保保留留了了前前几几项项主主要要生生化化鉴鉴别别试试验验，删删去去了了一一些些生生化化鉴鉴别别方方法法，这这样
23、样的的删删节节、简简写写，主主要要是是节节省省篇篇幅幅。并并不不是是删删去去，可可以以不不做做。如如有有可可疑疑菌菌落落，应应进进行行分分离离、纯纯化化、革革兰兰染染色色镜镜检检和和适适宜宜的的生生化化试试验验，确确认认是是否否是是要检查的控制菌。要检查的控制菌。如如MUG阳阳性性、靛靛基基质质阳阳性性，判判供供试试品品检检出出大大肠肠埃埃希希菌菌；如如MUG阴阴性性、靛靛基基质质阴阴性性，判判供供试试品品未未检检出出大大肠肠埃埃希希菌菌；如如MUG阳阳性性、靛靛基基质质阴阴性性，或或MUG阴阴性性、靛靛基基质质阳阳性性，则则应应取取胆胆盐盐乳乳糖糖培培养养基基的的培培养养物物划划线线接接种种
24、于于曙曙红红亚亚甲甲蓝蓝琼琼脂脂培培养养基基或或麦麦康康凯凯琼琼脂脂培培养养基基的的平平板板上上，培培养养1824小小时时。若若平平板板上上无无菌菌落落生生长长、或或生生长长的的菌菌落落与与表表1所所列列的的菌菌落落形形态态特特征征不不符符，判判供供试试品品未未检检出出大大肠肠埃埃希希菌菌。若若平平板板上上生生长长的的菌菌落落与与表表1所所列列的的菌菌落落形形态态特特征征相相符符或或疑疑似似，应应进进行行分分离离、纯纯化化、染染色色镜镜检检和和适适宜宜的的生生化化试试验验，确认是否为大肠埃希菌。（确认是否为大肠埃希菌。（ChP、BP、USP）沙门菌沙门菌修订修订取取供供试试品品10g或或10m
25、l加加至至200ml的的营营养养肉肉汤汤培培养养基基中中，用用匀匀浆浆仪仪或或其其他他适适宜宜方方法法混混匀匀，为为试试验验组组。取取10ml稀稀释释液液加加至至200ml营营养养肉肉汤汤培培养养基基中中，为为阴阴性性对对照照组组。培培养养18-24h，阴阴性性对对照应无菌生长。照应无菌生长。取取上上述述培培养养物物1ml，接接种种四四硫硫磺磺酸酸钠钠亮亮绿绿培培养养基基，培培养养后后，划划线线分分离离胆胆盐盐硫硫乳乳琼琼脂脂（或或SS）或或MacC(或或EMB)培培养养基基平平板板，培培养养1824小小时时（必必要要时时延延长长至至4048小小时时）。若若平平板板上上无无菌菌落落生生长长，或
26、或生生长长的的菌菌落落不不同同于于表表4所所列列的特征，判供试品未检出沙门菌。的特征，判供试品未检出沙门菌。若若平平板板上上生生长长的的菌菌落落特特征征与与表表4所所列列的的菌菌落落形形态态特特征征相相符符或或疑疑似似，用用接接种种针针挑挑选选23个个菌菌落落分分别别于于三三糖糖铁铁琼琼脂脂培培养养基基高高层层斜斜面面上上进进行行斜斜面面和和高高层层穿穿刺刺接接种种，培培养养1824小小时时，如如斜斜面面未未见见红红色色、底底层层未未见见黄黄色色；或或斜斜面面黄黄色色、底底层层无无黑黑色色，判判供供试试品品未未检检出出沙沙门门菌菌。否否则则，应应取取三三糖糖铁铁琼琼脂脂培培养养基基斜斜面面的的
27、培培养养物物进进行行适适宜宜的的生生化化试试验验和和血血清清凝凝集集试试验验，确确认认是是否否为为沙门菌。（沙门菌。（ChP、BP、USP预增菌时间）预增菌时间）金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)取取亚亚碲碲酸酸钠钠肉肉汤汤（或或营营养养肉肉汤汤）培培养养基基培培养养1824小小时时，必必要要时时可可延延至至48小小时时的的培培养养物物，划划线线接接种种于于卵卵黄黄氯氯化化钠钠琼琼脂脂培培养养基基或或甘甘露露醇醇氯氯化化钠钠琼琼脂脂培培养养基基的的平平板板上上，培培养养2472小小时时。若若平平板板上上无无菌菌落落生生长长或或生生长长的的菌菌落落不不同同
28、于于表表5所所列列特特征征，判判供供试试品品未未检出金黄色葡萄球菌。检出金黄色葡萄球菌。若若平平板板上上生生长长的的菌菌落落与与表表5所所列列的的菌菌落落特特征征相相符符或或疑疑似似，应应挑挑选选23个个菌菌落落，分分别别接接种种于于营营养养琼琼脂脂培培养养基基斜斜面面上上，培培养养1824小小时时。取取营营养养琼琼脂脂培培养养基基的的培培养养物物进进行行革革兰兰染染色色，并并接接种种于于营营养养肉肉汤汤培培养养基中，培养基中，培养1824小时，作血浆凝固酶试验。小时，作血浆凝固酶试验。增订增订大肠菌群和梭菌检查法。大肠菌群和梭菌检查法。大大肠肠菌菌群群（Coliform或或Coliformb
29、acteria）作作为为水水质质粪粪便便污污染染的的指指示示菌菌已已有有80多多年年的的历历史史。大大肠肠菌菌群群是是指指在在37生生长长时时能能发发酵酵乳乳糖糖，24h内内产产酸酸产产气气的的革革兰兰阴阴性性无无芽芽孢孢杆杆菌菌。符符合合上上述述定定义义的的细细菌菌除除大大肠肠埃埃希希菌菌属属外外，还还包包括括肠肠杆杆菌菌科科的的肠肠杆杆菌菌属属、枸枸橼橼酸酸菌菌属属、克克雷雷伯伯菌菌属属。大大肠肠菌菌群群基基本本上上包包括括了了正正常常人人畜畜肠肠道道内内的的全全部部需需氧氧的的革革兰兰阴阴性性杆杆菌菌，较较大大肠肠埃埃希希菌菌更更具具代代表表性性，且且存存活活时时间间较较长长。故故检检出
30、出大大肠肠埃埃希希菌菌，一一般般认认为为药药品品受受粪粪便便的的近近期期污污染染；而而检检出出大大肠肠菌菌群群，则则表表示示药药品品受受粪粪便便的的近近期期或或远远期期污污染染。以以大大肠肠菌菌群群作作为为口口服服药药品品微微生生物物限限度度标标准准的的控控制制菌菌，具具有有广广泛泛的卫生学意义，更能反映药品的卫生质量。的卫生学意义，更能反映药品的卫生质量。国际上用大肠菌群作为卫生指示菌，有三种不同体系：国际上用大肠菌群作为卫生指示菌，有三种不同体系：1.肠杆菌中能迅速发酵乳糖产气的肠杆菌中能迅速发酵乳糖产气的4类细菌，只有大肠类细菌，只有大肠埃希菌才能代表人和动物粪便的污染。样本中捡出埃希菌
31、才能代表人和动物粪便的污染。样本中捡出大肠菌群时，还得确认是否是大肠埃希菌。大肠菌群时，还得确认是否是大肠埃希菌。直接检直接检查查E.coli，一步到位，印度。，一步到位，印度。64年我国食品卫生亦采年我国食品卫生亦采用检查大肠埃希菌，一步到位。但多数采取检查大用检查大肠埃希菌，一步到位。但多数采取检查大肠菌群，然后确定是否是粪便来源，二步到位。肠菌群，然后确定是否是粪便来源，二步到位。2.检检查查大大肠肠菌菌群群乳乳糖糖发发酵酵的的4类类菌菌，其其卫卫生生学学意意义义是是相相同同的的，都都是是来来自自人人和和动动物物的的粪粪便便污污染染，检检查查大大肠肠菌菌群群即即可可。WHO50年年来来一
32、一贯贯的的方方法法，在在大大多多数数国国家家推推行行。为为了了与与国国际际接接轨轨，我我国国食食品品卫卫生生74年年开开始始采采用国际通用的大肠菌群检查法。用国际通用的大肠菌群检查法。3.只只要要是是发发酵酵型型的的细细菌菌，便便可可认认为为是是大大肠肠菌菌群群。采采用用葡葡萄萄糖糖发发酵酵试试验验检检测测，包包括括了了肠肠杆杆菌菌科科所所有有的的细细菌菌。前前苏苏联联20世世纪纪50年年代代引引入入我我国国，一一直直沿沿用用到到20世世纪纪60年代初期。年代初期。大肠菌群检查方法大肠菌群检查方法1.我国食品卫生国标方法我国食品卫生国标方法初初发发酵酵3管管或或5管管胆胆盐盐乳乳糖糖培培养养基
33、基，产产酸酸产产气气；EMB分离培养；分离培养；复复发发酵酵挑挑选选多多个个可可疑疑菌菌落落，复复发发酵酵确确证证，报报告告MPN。2.WHO假假定定试试验验MacC肉肉汤汤或或乳乳糖糖胰胰动动肉肉汤汤，产产气气假假定定阳阳性性；不不产产气气，再再培培养养24h，产产气气，假假定阳性假定阴性；不产气，假定阴性。定阳性假定阴性；不产气，假定阴性。证证实实试试验验阳阳性性管管接接种种煌煌绿绿乳乳糖糖胆胆盐盐肉肉汤汤2管管，1管管3748h，产产气气，报报告告检检出出大大肠肠菌菌群群。1管管4424h，产气，报告检出耐热大肠菌群，产气，报告检出耐热大肠菌群 大大肠肠菌菌群群的的检检查查方方法法是是成
34、成熟熟的的，在在食食品品大大肠肠菌菌群群检检查查中中已已广广泛泛使使用用。但但药药品品不不同同于于食食品品，有有些些药药品品有有抑抑菌菌作作用用，因因此此在在药药品品中中检检查查大大肠肠菌菌群群，必必须须采采用用适适当当的的方方法法对对供供试试品品进进行行处处理理，消消除除其其抑抑菌菌作作用用后后方方可可检检查查。同同时时从从方方法法学学的的可可信信度度考考虑虑，应应设设阳阳性性对对照照和和阴阴性性对对照照。因因此此，推推荐荐的的大大肠肠菌菌群群检检查查法法是是经经过过大量考察验证、准确可靠、简便易行的方法。大量考察验证、准确可靠、简便易行的方法。初初步步考考察察结结果果表表明明，大大肠肠菌菌
35、群群的的检检出出率率远远高高于于大大肠肠埃埃希希菌菌，粪粪大大肠肠菌菌群群的的检检出出率率为为零零。不不难难看看出出，以以大大肠肠菌菌群群作作为为口口服服药药品品的的控控制制菌较为合理，更具实际意义。菌较为合理，更具实际意义。取取乳乳糖糖胆胆盐盐发发酵酵管管3支支，分分别别加加入入1：10供供试试液液1ml(供供试试品品量量0.1g或或0.1ml)，1：100供供试试液液1ml(供供试试品品0.01g或或0.01ml)，1：1000供供试试液液1ml(供供试试品品0.001g或或0.001ml)。另另取取1支支乳乳糖糖胆胆盐盐发发酵酵管管，加加1ml稀稀释释剂剂，作作阴阴性性对对照照。各各管管
36、置置361培培养养18-24h，阴阴性性对照应无菌生长。对照应无菌生长。乳乳糖糖胆胆盐盐发发酵酵管管若若无无菌菌生生长长，或或有有菌菌生生长长但但不不产产酸酸产产气气（或或产产酸酸不不产产气气），报报告告供供试试品品未未检检出出大大肠肠菌菌群群；如如有有产产酸酸产产气气者者，应应将将产产酸酸产产气气的的发发酵酵管管分分别别划划线线接接种种于于曙曙红红亚亚甲甲蓝蓝琼琼脂脂或或麦麦康康凯凯琼琼脂脂平平板板上上，培培养养1824h，。如如平平板板上上无无菌菌落落生生长长，或或有有菌菌落落生生长长但但不不发发酵酵乳乳糖糖、非非革革兰兰阴阴性性无无芽芽孢孢杆杆菌菌的的菌菌落落，判判该该管管未未检检出出大
37、大肠肠菌菌群群；如如平平板板上上生生长长的的菌菌落落与与表表3所所列列的的菌菌落落形形态态特特征征相相符符或或疑疑似似，为为革革兰兰阴阴性性无无芽芽孢杆菌的菌落，应做确证试验。孢杆菌的菌落，应做确证试验。确证试验确证试验取取上上述述平平板板上上的的可可疑疑菌菌落落45个个，各各接接种种1支支乳乳糖糖发发酵酵管管，培培养养2448h。凡凡产产酸酸产产气气、革革兰兰阴阴性性无无芽芽孢孢杆杆菌菌判判该该管管检检出出大大肠肠菌菌群群。反反之之，判判该该管管未未检检出出大大肠肠菌菌群。群。根根椐椐检检出出大大肠肠菌菌群群的的管管数数，按按表表3报报告告供试品每供试品每1g或或1ml的大肠菌群数。的大肠菌
38、群数。（食品卫生确证试验取（食品卫生确证试验取12个菌落接种乳个菌落接种乳糖发酵管。混合菌培养。糖发酵管。混合菌培养。)梭菌（梭菌（Clostridium）取供试液取供试液10ml（相当于供（相当于供试品试品1g、1ml）2份，其中份，其中1份置份置80保温保温10分分钟后迅速冷却。上述钟后迅速冷却。上述2份供试液直接或处理后份供试液直接或处理后分别接至分别接至100ml的的0.1%新鲜庖肉培养基中。阴新鲜庖肉培养基中。阴性对照加入的稀释剂为性对照加入的稀释剂为10ml。各培养基管在。各培养基管在厌氧条件下培养厌氧条件下培养7296小时。如试验管不出现小时。如试验管不出现混浊、产气、消化碎肉、
39、臭气等现象，判供试混浊、产气、消化碎肉、臭气等现象，判供试品未检出梭菌；否则，应取上述培养物品未检出梭菌；否则，应取上述培养物0.2ml，涂抹接种于含庆大霉素的哥伦比亚琼脂培养，涂抹接种于含庆大霉素的哥伦比亚琼脂培养基平板上，在厌氧条件下培养基平板上，在厌氧条件下培养4872小时。若小时。若平板上无菌落生长，判供试品未检出梭菌；若平板上无菌落生长，判供试品未检出梭菌；若平板上有菌落生长，应挑选平板上有菌落生长，应挑选23个菌落分别进个菌落分别进行革兰染色和过氧化氢酶试验。行革兰染色和过氧化氢酶试验。过过氧氧化化氢氢酶酶试试验验取取上上述述平平板板上上的的菌菌落落，置置洁洁净净玻玻片片上上，滴滴
40、加加3%过过氧氧化化氢氢试试液液，若若菌菌落落表表面面有有气气泡泡产产生生，为为过过氧氧化化氢氢酶酶试试验验阳阳性性，否否则则为阴性。为阴性。若若上上述述可可疑疑菌菌落落为为革革兰兰阳阳性性梭梭菌菌，有有或或无无卵卵圆圆形形或或球球形形的的芽芽孢孢，过过氧氧化化氢氢酶酶阴阴性性，判判供供试试品检出梭菌，否则判供试品未检出梭菌。品检出梭菌，否则判供试品未检出梭菌。（BP：样品：样品2份，份，1份加热、份加热、1份不加热，厌氧份不加热，厌氧培养培养7296h，0.2ml加至含庆大霉素哥伦比亚加至含庆大霉素哥伦比亚琼脂平板，厌氧培养琼脂平板，厌氧培养4872h，划线不含庆大，划线不含庆大霉素哥伦比亚
41、琼脂平板，有氧、厌氧培养霉素哥伦比亚琼脂平板，有氧、厌氧培养48h，如在厌氧生长有菌，作过氧化氢酶试验。），如在厌氧生长有菌，作过氧化氢酶试验。）结果判断结果判断原原规规定定5条条，删删去去了了1条条。这这4条条的的先先后后顺顺序序做做了了调调整整，突出重点。突出重点。供供试试品品若若检检出出控控制制菌菌或或其其他他致致病病菌菌，按按一一次次检检出出为准，不再抽样复试。为准，不再抽样复试。3种种菌菌数数任任一一项项不不合合格格，应应从从同同一一批批样样品品中中随随机机抽抽样，复试样，复试2次，以次，以3次结果均值报告。次结果均值报告。眼眼科科用用药药的的霉霉菌菌和和酵酵母母菌菌菌菌数数复复试试
42、报报告告，须须以以2次复试结果均不得长菌，方可判供试品不合格。次复试结果均不得长菌，方可判供试品不合格。3种种菌菌数数和和控控制制菌菌任任一一项项不不合合格格，判判该该供供试试品品不不符合规定。符合规定。删删去去了了在在特特殊殊情情况况下下，营营养养琼琼脂脂培培养养基基上上长长霉霉菌菌、酵酵母母菌菌，玫玫瑰瑰红红钠钠琼琼脂脂培培养养基基上上长长细细菌菌，与与玫玫瑰瑰红红钠钠琼琼脂脂培培养养基基中中的的霉霉菌菌数数或或营营养养琼琼脂脂培培养养基基中中的的细细菌菌数数进进行行比比较较，以以菌菌落落数数多多的的培培养养基基中中的的菌菌数数判判断断结结果。果。培培养养基基增增订订乳乳糖糖胆胆盐盐发发酵
43、酵培培养养基基，乳乳糖糖发发酵酵培培养养基基；庖庖肉肉培培养养基基，0.1%葡葡萄萄糖糖庖庖肉肉培养基，哥伦比亚琼脂培养基。培养基，哥伦比亚琼脂培养基。原培养基中的错别字已订正。原培养基中的错别字已订正。试药试药一部一部增订增订11种；种；二部二部增订增订7种。种。试液试液增订增订4种。种。稀稀释释剂剂增增订订2种种。pH7.0无无菌菌氯氯化化钠钠-蛋蛋白白胨胨缓缓冲冲液液、无无菌菌聚聚山山梨梨酯酯80氯氯化化钠钠-蛋蛋白白胨胨缓缓冲液。冲液。名词统一名词统一震荡震荡-振摇，三角瓶振摇，三角瓶-锥形瓶，锥形瓶，大大肠肠杆杆菌菌-大大肠肠埃埃希希菌菌，绿绿脓脓杆杆菌菌-铜铜绿绿假假单单胞胞菌，菌
44、，破破伤伤风风杆杆菌菌-破破伤伤风风梭梭菌菌，混混匀匀-摇摇匀匀，平平皿皿与与平平板板，菌菌苔苔与与新新鲜鲜菌菌苔苔，生生药药与与药药材材，革革兰兰氏染色氏染色-革兰染色，沙门氏菌革兰染色，沙门氏菌-沙门菌，沙门菌，中国药典中国药典2005版版二部二部微生物限度标准微生物限度标准非非无无菌菌药药品品的的微微生生物物限限度度标标准准是是基基于于药药品品的的给给药药途途径径、对对患患者者健健康康潜潜在在的的危危害害而而制制订订的的。药药品品的的生生产产、储储存存、销销售售及及新新药药标标准准制制订订、进进口口药药品品标标准准复复核核、考考察察药药品品质质量量、仲仲裁裁、原原料料及及辅辅料料等等检检
45、验验中中，除除另另有有规规定定外外，其其微微生生物物限限度均以本标准为依据。度均以本标准为依据。1.制制剂剂通通则则、品品种种各各论论中中要要求求无无菌菌的的制制剂剂及及标标示示无菌的制剂无菌的制剂应符合无菌检查法的规定。应符合无菌检查法的规定。2.口服给药制剂口服给药制剂细菌数细菌数1g不得过不得过103个。个。1ml不得过不得过102个。个。霉菌和酵母菌数霉菌和酵母菌数1g或或1ml不得过不得过102个。个。含糖、蜂蜜、含糖、蜂蜜、王王浆的液体或半固体制剂，酵母浆的液体或半固体制剂，酵母菌和霉菌总数，菌和霉菌总数，1g或或1ml不得过不得过102个。个。大肠杆菌大肠杆菌1g或或1ml不得检
46、出。不得检出。3.局部给药制剂局部给药制剂3.1用用于于手手术术、创创伤伤的的局局部部给给药药制制剂剂，应应符符合合无无菌检查法要求。菌检查法要求。3.2一般局部给药制剂一般局部给药制剂细菌数细菌数1g、1ml或或10cm2不得过不得过102个。个。霉菌数霉菌数1g、1ml或或10cm2不得过不得过102个。个。金金黄黄色色葡葡萄萄球球菌菌、铜铜绿绿假假单单胞胞菌菌1g、1ml或或10cm2不得检出。不得检出。3.3眼部给药制剂眼部给药制剂细菌数细菌数每每1g、1ml不得过不得过10个。个。霉菌数酵母菌数霉菌数酵母菌数1g或或1ml不得检出。不得检出。金金黄黄色色葡葡萄萄球球菌菌、铜铜绿绿假假
47、单单胞胞菌菌、大大肠肠杆杆菌菌1g或或1ml不得检出。不得检出。3.4耳、鼻及呼吸道吸入给药的制剂耳、鼻及呼吸道吸入给药的制剂细菌数细菌数1g、1ml或或10cm2不得过不得过102个。个。霉菌和酵母菌数霉菌和酵母菌数1g、1ml或或10cm2不得过不得过10个。个。金金黄黄色色葡葡萄萄球球菌菌、铜铜绿绿假假单单胞胞菌菌1g、1ml或或10cm2不得检出。不得检出。大大肠肠杆杆菌菌鼻鼻及及呼呼吸吸道道给给药药的的制制剂剂，1g或或1ml或或10cm2不得检出。不得检出。3.5阴道给药制剂阴道给药制剂细菌数细菌数1g或或1ml不得过不得过102个。个。霉菌和酵母菌数霉菌和酵母菌数1g或或1ml不得检出。不得检出。谢谢谢！谢！