-电离辐射的细胞效应课件.ppt

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1、第四章电离辐射的细胞效应第一节细胞的放射敏感性衡量辐射敏感性的指标 个体，常用存活率或半致死剂量 细胞，多数情况下都用克隆形成率(成灶率)表示其存活率，对肿瘤细胞也用SF2(2Gy照射后的存活率)；此外，染色体畸变率也是常用的评价指标。一、哺乳动物细胞辐射敏感性的差异1、不同细胞群体的放射敏感性 体内细胞群体依据更新速率分为：（1）不断分裂更新的细胞群体敏感（2）不分裂的细胞群体抗性（3）一般状态不分裂或分裂很慢抗性；但刺激后迅速分裂敏感。Bergonie&Tribondeau定律：组织的放射敏感性与其细胞的分裂活动成正比而与其分化程度成反比。一般适合 有许多例外 如胸腺、淋巴细胞肿瘤细胞的辐

2、射敏感性 敏感性有明显差异 对射线高度敏感的肿瘤有：恶性淋巴瘤、精原细胞瘤、肾母细胞瘤等；中度敏感的，如多种鳞状上皮癌、分化差的腺癌、脑胶质瘤等；对放射治疗表现抗性的如恶性黑素瘤、胃癌、软骨肉瘤等二、不同细胞周期时相的放射敏感性 G1 细胞间期 S DNA合成期 G2细胞间期 M细胞分裂期 对辐射的敏感性：M G2 G1 S早S晚三、环境因素对细胞放射敏感性的影响细胞所处环境影响:氧分压 防护和增敏作用的化学因子 密集抑制的稳相细胞培养：细胞处于拥挤状态，其生长、增殖受抑，放射敏感性降低 潜在致死性损伤（potential lethal damage,PLD)照射后，使细胞处于次佳生长环境下，

3、染色体已受损的细胞若不立即进入分裂期，有丝分裂的延迟有利于DNA的修复。凡是有双链重接缺陷的细胞，其敏感性都是高的；然而敏感性高的细胞却不一定有明显的重接修复异常。原因有：（1）修复效率变化的幅度较小，现有的测定方法不够灵敏，不能测知。（2）重接速率虽无变化，但修复不正确。如AT。（3）各时相细胞内天然存在的SH化合物水平不同，G2/MS。（4）存在别的机理。第二节 电离辐射对细胞周期过程的影响检查点（check points)细胞周期进程中向各个时相过渡的点 周期蛋白c主要在果蝇及人的细胞中发现；周期蛋白D则主要存在于鼠类及人的细胞，它在休止细胞中不表达，经生长因子刺激后表达增加；周期蛋白D

4、的表达水平在细胞周期任何时点都不锐减，其合成和活性在GI后期亦仅达一较低峰值；周期蛋白D活性依赖细胞内生长因子的存在，除去生长因子则周期蛋白D水平即刻降低，周期蛋白D与cDK4CDK6形成复合物，调节G1期进展；周期蛋白E是人类的GI周期蛋白，其mRNA和蛋白质水平在G1s交界处急剧升高达峰值，进入s期后降解，周期蛋白ECDK2复合物调节细胞周期进入S期，并在人类细胞的DNA合成启动中起重要作用。2、M期周期蛋白和CDKs M-周期蛋白是指在G2 M 期转换时发挥作用、诱导细胞分裂的一类周期蛋白。包括周期蛋白A 和周期蛋白B。周期蛋白A 主要在S 期发挥作用，它合成始于G1 后期、进入S 期后

5、形成周期蛋白ACDK2 复合物，调节S 期进展。周期蛋白B 表达水平至G2 期达峰值，周期蛋白BCDC(cell division cycle gene)复合物调节细胞周期进人M期 周期蛋白A在S期发挥作用，与DNA复制的完成有关；周期蛋白B在G2M交界处发挥作用，诱发细胞分裂.二、几个参与细胞周期调控的重要基因 三条相互联系的细胞周期调节系统：(1)Ras介导的MAPK信号转导系统；(2)CIP1KIP1家族介导P53P2lWAF1/CIP1周期蛋白ECDK2，周期蛋白DCDK4pRB途径：(3)INK4家族介导的P16INK4a周期蛋白DCDK4一pRB途径。1、pRB（nuclear p

6、hosphoprotein）pRB作为细胞周期和基因转录调控的枢纽，通过调整E2F等转录因子的功能在细胞增殖和分化的控制中发挥关键作用。在某一给定细胞中pRB水平相对恒定，而其磷酸化/去磷酸化状态则随着细胞周期的进展而变化：在G1早期，pRB主要以脱磷酸化的活性形式存在，pRB的磷酸化主要发生在G1中期，到S期和G2M期则主要以高度磷酸化形式存在。G1期pRB磷酸化主要由周期蛋白DCDK4CDK6复合物催化完成。pRB的去磷酸化在M及s期由蛋白磷酸酶1催化进行。在周期蛋白CDK复合物与蛋白磷酸酶1的协同作用下，pRB的磷酸化去磷酸化之间的动态平衡有效控制着G1限制点的“开启和关闭”，从而保证细

7、胞周期的有序运行及细胞的正常增殖。2、p21WAF1/CIP1 p21基因定位于第六号染色体短臂上(6p21.2），P21蛋白定位于细胞核中，属CKI分子（CDK抑制分子），能广泛抑制各种周期蛋白CDK复合物。野生型P53蛋白作为转录因子可诱导p21WAF1/CIP1基因的表达，抑制CDK2和CDK4对pRB蛋白的磷酸化失活，进而导致G1、G1/S和S期延迟，使DNA损伤有时间得以修复。4、Ras Ras蛋白介导的MAPK信号转导途径是具有酪氨酸激酶活性的大多数生长因子及其受体传递信息的主要通路，是细胞周期正常运行的信号指令系统之一、主要由Ras蛋白 Ras转换因子(如Raf1)丝裂原活化蛋白

8、激酶(MAPK)等部分组成。与丝氨酸和苏氨酸残基的磷酸化有关。二、细胞周期进程的调控 三个检查点，G1S,SG2,G2M 调控因素：周期素及其相应蛋白激酶、p53 和p105Rb 等抑癌基因及其基因表达的蛋白 周期素（cyclins)家族：A,B,C,D,E,G 等G2M检查点调节机制 有丝分裂促进因子（mitosis promoting factor,MPF）：周期素BP34cdc2(cdc2 基因编码的34000的磷蛋白，简称p34,具激酶活性）三、电离辐射影响细胞周期进程的机制1、G2阻滞（G2 arrest)机制：细胞由G2期进入M期受MPF调控 Cyclin B激酶P34cdc2Th

9、r161 磷酸化、Thr14,Tyr15 脱磷酸化激活IRCyclinB的mRNA和蛋白水平下调P34磷酸化发生变化MPF2、G1阻滞（G1 arrest）取决于细胞系的P53状态：只有表达野生P53的细胞，受照后才发生G1期阻滞。P53是作为转录因子，通过与其下游效应分子基因的靶序列结合从而激活这些基因转录的。再通过这些下游效应分子发挥调控G1期进程。1）p53、P21及Gadd45在G1阻滞中的作用 P53有多种下游效应分子：如MDM2，P21WAFl，Gadd45，Bax,IGFBP3，Fas等。MDM2通过与P53蛋白氨基末端结合来阻止P53蛋白转录激活，形成一个“负反馈环”。因此认为

10、MDM2的正常功能是限制GI期阻滞的时间，使DNA损伤修复后的细胞重新进入细胞周期。2、G1阻滞（G1 arrest）2、G1阻滞（G1 arrest）Gadd45和P21WAFl是参与辐射所致细胞G1期阻滞的重要分子。P53P21wAF1通路是通过CDK周期蛋白活性抑制，Rb脱磷酸化而发挥作用的。Gadd（growth arrest and DNA damage）是一些生长抑制和DNA损伤诱导的基因，Gadd45是其中一员，也是野生型P53诱导G1期阻滞的一条通路。2、G1阻滞（G1 arrest）2)ATM基因在细胞周期检查点调控中的作用 AT：毛细血管扩张性共济失调症 ATM基因是AT唯

11、一致病基因；对AT纯合子突变细胞的研究表明，这类突变细胞缺乏细胞周期检查点调控对辐射损伤的正常反应，缺乏辐射诱导P53蛋白增加、p21wAFl和Gadd45转录和翻译水平增强的动态变化，表明ATM很可能是DNA损伤反应途径中p53的上游分子。3、S相延迟（S phase delay）与DNA合成速率下降有关 IR对DNA合成的抑制呈现双相的剂量效应关系：较低剂量范围内剂量效应曲线斜率较大（辐射敏感），较高剂量，斜率变小（辐射抗性）与cyclin A及P53的表达有关4、巨细胞形成 巨细胞：IR引起某些细胞体积增大，成为巨细胞（giant cell);内载几套染色体而不分裂；细胞可以存活一定时间

12、，具有功能活性，但最总凋亡；可能与少数细胞P21缺失或其上游调控者P53基因表达有关。四、电离辐射影响细胞周期进程的生物学意义 1、机体对外界刺激的一种保护性反应，目的在于保证基因组的遗传稳定性 2、研究进程影响规律有利于设计合理的肿瘤治疗方案，提高化疗和放疗疗效第三节 电离辐射引起细胞死亡及其机制一、辐射引起细胞死亡的类型1、增殖死亡（proliferative death)又名代谢死亡或延缓死亡 是指受照细胞丧失了持续增殖的能力、在经过一个或几个有丝分裂周期后丧失代谢活动和细胞功能而死亡。2、间期死亡（Interphase death）指受照射细胞未经分裂就死亡。通常测定增殖死亡采用体外细

13、胞成集落培养法，即观察单个细胞在培养条件下经多次分裂后形成一个克隆的能力。如果细胞在一次或数次分裂后不能形成一个克隆，即计为死亡；能够生长成克隆者则计为存活。而对间期死亡辨认最常用的是染料排斥法即采用伊红、台盼蓝或氨基黑等染料染色，活细胞不着色，死细胞可被染色。照射剂量很大（100Gy以上）二、细胞凋亡（apoptosis）概念 维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序死亡。细胞凋亡不是一件被动的过程，而是主动过程，它涉及一系列基因的激活、表达以及调控等的作用；它并不是病理条件下，自体损伤的一种现象，而是为更好地适应生存环境而主动争取的一种死亡过程。它包括生理性的程序死亡PCD(progra

14、mmed cell death）（程序化细胞死亡)：在机体生理过程中，在一定信号的启动下，凋亡相关基因有序地表达，制约着对整体无用的或有害细胞的清除，因此，这种活动被命名为PCD特征：即散在的、逐个地从正常组织中死亡和消失，机体无炎症反应，而且对整个机体的发育是有利和必须的。因此认为动物发育过程中存在的细胞程序性死亡是一个发育学概念，而细胞凋亡则是一个形态学的概念，描述一件有着一整套形态学特征的与坏死完全不同的细胞死亡形式。但是一般认为凋亡和程序性死亡两个概念可以交互使用，具有同等意义。细胞的坏死(necrosis)通常是由突然及严重的损伤所造成的细胞意外死亡，这类损伤包括电离辐射、严重的感染

15、、剧烈的炎症、烧伤或其他形式的创伤以及化学损伤等：坏死细胞的损伤往往在细胞膜表面，使得细胞膜失去了调节渗透压的能力，造成细胞的肿胀，其线粒体在损伤早期即出现病理改变，功能受到损伤，细胞的能量代谢出现障碍。死亡的细胞破裂成碎片散布在周围组织中，往往引起明显的炎症反应，损伤的器官或组织出现功能障碍。细胞凋亡与细胞坏死的比较细胞凋亡形态学特征细胞凋亡形态学上的变化大致可分为三个阶段：第一阶段：凋亡细胞首先明显皱缩，体积变小，失去粘附力，从附着处脱落下来或与周围细胞分离；而最突出的变化发生在细胞核；染色质密集、位于皱缩的核膜下，核仁消失，核的体积缩小。第二阶段：染色体核小体间连接区遭核酸内切酶攻击，D

16、NA链断裂，核膜内陷，包裹致密、断裂的染色质，形成许多细小的、由膜包裹的核碎片，完整的细胞核消失。细胞膜进一步内陷皱褶，形成一些泡状结构，包裹胞浆形成颗粒，最后整个细胞都裂解成这种由细胞膜包裹着内含核碎片、细胞器和胞浆成分的颗粒凋亡小体(apoptosis body)。第三阶段：凋亡小体被周围巨噬细胞等识别和吞噬。凋亡的生化特征是染色体DNA裂解细胞凋亡的判定方法1反映细胞形态改变的方法(1)细胞染色：凋亡细胞发生了一系列的形态改变，如体积缩小、核固缩、染色质凝集等都可以细胞染色明显地观察出来。(2)电镜观察：利用电镜可观察细胞的超微结构，能同时反映细胞膜的完整性、胞浆中细胞器、细胞核和染色质

17、的改变，以及凋亡小体的形成。细胞凋亡的形态学变化2、反映细胞膜完整性的方法 细胞完整性是区分细胞凋亡与坏死的重要指标之一，可用染料，如台盼蓝进行染色，如果细胞膜破裂，染料进入细胞，细胞变蓝。反之，对于细胞膜完整的正常细胞和凋亡细胞，台盼蓝染色阴性。当然，电镜也可以较准确地判定细胞膜的完整性。3生化指标一DNA梯状语的检测(1)DNA电泳：将凋亡细胞的基因组DNA进行琼脂糖凝胶电泳，可以发现其DNA片段呈间隔180一200bp的阶梯状电泳条带。这种典型改变常被认为是细胞凋亡的可靠指标。(2)片段化DNA的定量：方法为：细胞在低渗缓冲液作用下高速离心，上溶液中含有酶解的低分子量DNA，沉淀中含高分

18、子量DNA，分别用二苯胺显色，比色法定量。计算出片段化DNA所占百分比。4、流式细胞术5、酶学标志 凋亡细胞除核酸内切酶活化外，蛋白酶和谷氨酰胺转移酶等也被激活。6、凋亡细胞的原位标记 由于凋亡细胞DNA降解产生缺口和30H，故可以用原位缺口翻译或末端标记法显示凋亡细胞。2、细胞凋亡的分子调控DNA 损伤细胞因子P53触发CED-3/ICE 蛋白酶BaxBcl-2激活细胞凋亡3、辐射所致细胞凋亡的生理控制 1）引发性刺激 IR 细胞表面的受体或其他分子DNA 链断裂、修复 2）滞后（log)阶段的调节 辐射和细胞凋亡发生之间的一段时间 不同的细胞之间这种滞后时期长短不一 发生在滞后期的分子事件

19、包括DNA修复、基因的表达、分化、蛋白质的合成，以及效应蛋白的激活。癌基因表达，能影响细胞凋亡的进程以及细胞对辐射刺激的敏感性。3）死亡反应 辐射诱发的细胞凋亡，在经历了滞后阶段后，还要发生一系列特征性生物形态学的改变以及生物化学变化。先是染色质固缩成一团，紧贴着核膜，接着DNA链断裂，在715h后，细胞凋谢变得不可辨认，最后被吞噬。第四节 细胞存活的剂量效应关系一、细胞存活的概念 存活细胞（survival cell）&死细胞（death cell）对有增殖能力的细胞，保留其增殖能力，无限产生子代的细胞为存活细胞。凡失去增殖能力，不能产生大量子代的细胞，称为死细胞；对那些不再增殖的已分化的细

20、胞，则以其是否丧失特殊功能来衡量细胞是否存活，保留机能者为存活细胞，失去功能者为死亡细胞。克隆（clone)（或集落,colony）离体培养，一个存活细胞可繁殖成一个细胞群体 细胞存活曲线（cell survival curve)测量受不同辐射剂量照射后，有增殖能力的细胞在体内、外克隆或集落形成的能力，即存活率的变化所绘制剂量效应曲线二、细胞存活的体内、外测量 1、体外测量（cell survival measurment in vitro）Single survival cell colony SF=culture某一剂量照射后形成的集落数接种的单个细胞数PESF（surviving fra

21、ction)：细胞存活分数PE(plating efficincy):系数接种效率用体外培养细胞建立 X射线照射后的细胞活存曲线 2、体内测量（survival cell measurment in vivo）脾结节计数法 SF Nx/CxNc/CcNx 和Cx：代表受某一剂量照射，供体细胞形成的结节数及注入细胞数Nc和Cc：代表未受照射，供体细胞形成的结节数及注入细胞数三、细胞存活曲线类型常用的哺乳动物细胞存活曲线有三种 1、简单的多靶单击模型 2、修正的多靶单击模型 3、线性平方模型指数“单击”曲线 细胞（或生物大分子）的存活分数为辐射剂量的简单函数。见于病毒或酶的灭活，以及少数哺乳动物细

22、胞的杀灭。属于单击单靶模型。D37的倒数即为存活曲线斜率。D37：引起细胞（或酶分子）63死亡（或失活）的照射剂量。多靶“单击”模型 假设在细胞死亡前有两个或多个靶受到一次击中。剂量存活曲线的直线部分斜率的倒数为D0-平均致死剂量。曲线初始斜率不等于0，即在很低剂量时仍有一些细胞死亡。这个模型对许多哺乳动物细胞都适用。D0值：细胞的平均致死剂量（mean lethal dose）剂量存活曲线的直线部分斜率的倒数 D0愈小，斜率愈大 D0值大小代表细胞放射敏感性的高低 从存活曲线对数坐标0.1和0.037各作一条与横坐标相平行的线与曲线相交，从这两个交点分别作垂直线与剂量轴相交。相交点剂量之差即

23、为D0值，多在12Gy细胞存活曲线的参数 Dq值 准阈剂量（quasithreshould dose）细胞积累亚致死性损伤的能力，与损伤修复有关。克服肩区所需的剂量 由纵坐标1.0处作一条与横坐标的平行线，与外推线的交点在横坐标上投影点的数值即为Dq 多在0.52.5Gy n值 代表细胞内靶的个数或所需击中靶的次数 将直线部分外推与纵坐标相交点的数值即为外推n值（extrapolation number)多为13 D37值 引起细胞（或酶分子）63死亡的照射剂量 D37D0+Dq 单靶单击时，剂量存活曲线无肩区，Dq为0，此时D37就等于D0第五节 辐射诱导的细胞损伤及其修复一、细胞放射损伤的

24、分类 1、致死性损伤（lethal damage,LD）2、亚致死性损伤（sublethal damage,SLD）3、潜在致死性损伤（potentially lethal damage,PLD）二、细胞放射损伤的修复 1、潜在致死性损伤修复（PLDR）常用方法；密集抑制稳相细胞培养法 2、亚致死性损伤修复（SLDR）细胞内某些靶被击中，细胞受到SLD 供给能量、营养，间隔一定时间，细胞修复 可能与DNA单链断裂有关 验证：分割剂量照射 3、缓慢修复 如毛细血管内皮 类似PLDR，但时间长三、影响细胞放射损伤及修复的因素 1、射线种类 损伤LET 曲线斜率变陡 肩区变小 n值降低SLD、LD

25、不同LET 辐射作用后细胞剂量存活曲线 2、剂量率 3、氧效应 4、辐射增敏剂 5、辐射防护剂 6、增温 对于正常细胞来说，总剂量一定时，剂量率越低，照射时间越长，生物效应就越轻。其机制是在拖延照射的过程中发生亚致死性损伤的修复和细胞增殖。不同肿瘤细胞的剂量率效应有所差别，但总的看来剂量率效应不明显。正常及肿瘤细胞剂量率效应的差别将成为低剂量率分次照射治疗肿瘤的理论基础。正常细胞与肿瘤细胞剂量率效应的差别，意味着在肿瘤放射治疗中，低剂量率照射将获得较好的治疗效果。因此低剂量率照射与单次剂量相比，可明显减轻对正常组织细胞的损伤作用，而达到抑制肿瘤生长，保护正常组织的目的。Lamerton和Cou

26、rtenay提出决定更新组织在连续照射下反应的因素：干细胞的敏感性：肩区越宽，对低剂量越不敏感 细胞周期的长短：细胞损伤周期长周期短 组织在连续照射过程中对新的损伤的适应能力增敏剂（sensitive enhancement ratio,SER）SER=D0(无增敏剂）D0(有增敏剂）具备条件：1、对正常细胞无毒2、对正常细胞增敏作用小或无3、渗透性强，能向无毛细血管区细胞渗透4、适当的生物半排期，保证药物浓度及到达肿瘤组织5、使增殖和静止细胞均可致敏6、在常用的放疗分次剂量内有效 1、剂量降低系数（dose reduction factor,DRF）2、DRF=有防护剂时引起致死效应所学剂量

27、无防护剂时引起致死效应所学剂量3、理想的辐射防护剂应具备以下条件：1）DRF值2以上，如WR-2721,2.7 2）毒副作用低，有效剂量范围宽 3）照前使用有效时间至少6小时，照后使用也有效 4)即可口服，又能肌注 5）化学性质稳定，合成生产容易 包括热水浴、短波透热、微波、超声和射频 细胞效应取决于温度的高低及增温时间的长短 机制不清 与X射线的敏感性互补，在晚S期最敏感 影响因素：PH、营养条件、氧 热增强比（thermal enhancement ratio TER）TER=不增温时引起一定效应的辐射剂量增温时引起相同效应的辐射剂量第七节 辐射诱导的细胞突变及恶性转化一、辐射致突变效应

28、突变频率与辐射剂量成正比 无剂量阈值 效应与剂量率有关或无 高LET效应大于低LET 二、细胞恶性转化 1、饱和密度增加 2、对生长因子的需求降低 3、生长抑制性丧失 4、生长停泊依赖性丧失 5、接触抑制性丧失 6、细胞形态学和生长习性改变 7、细胞表面成分变化 8、易被凝聚素所凝集 9、葡萄糖转运增加 10、表面纤连蛋白减少或丧失 11、肌动蛋白的微丝丧失 12、转化生长因子的分泌 13、蛋白酶的分泌 14、永久性生长复习思考题 1、下列缩写的中英文全称 DDI、PCD、SF、LD、SLD、PLD SLDR、PLDR、SER、DRF、TER 2、解释下列术语 G1阻滞，G2阻滞，增殖死亡，间

29、期死亡，细胞凋亡，存活分数，致死性损伤，亚致死性损伤，潜在致死性损伤，亚致死性损伤修复，潜在致死性损伤修复，增敏剂，剂量降低系数，热增强比。3、问答题 1）举例说明不同群体细胞的放射敏感性。依据是什么？2）试述细胞周期不同时相细胞的放射敏感性。3）试述辐射诱导G1阻滞的条件。4）试述辐射诱导G1阻滞的基因调控。5）试述辐射诱导G2阻滞的基因调控。6）试述辐射诱导胸腺细胞凋亡的剂量效应关系。7）试述D37，D0，Dq及N值的概念、求法及生物学意义8）试述四种指数曲线的形式、适用范围及靶学说的解释。9）试述细胞辐射损伤的分类。10）举例说明影响PLDR的环境条件。11）试述射线种类对细胞PLDR及SLDR的影响及其生物学意义。12）试述正常与肿瘤细胞剂量率效应的差别及其生物学意义。13）试述增温能增强辐射细胞效应的机制及其生物学意义。