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1、会计学1植物植物(zhw)基因组基因组DNA的提取的提取第一页，共21页。植物植物(zhw)基因组基因组DNA的提取的提取 植物基因组DNA提取的方法主要有：SDS法CTAB法是一种阳离子去污剂，在高离子强度的溶液(rngy)里，CTAB与蛋白质和大多数酸性多聚糖以外的多聚糖形成复合物，只是不能沉淀核酸，重要用途提取DNA和RNA。第1页/共21页第二页，共21页。1、实验、实验(shyn)原理原理n nSDSSDS、CTABCTAB等等离离子子型型表表面面活活性性剂剂，能能溶溶解解细细胞胞膜膜和和核核膜膜蛋蛋白白，使使核核蛋蛋白白（DNPDNP）解解聚聚，从从而而使使DNADNA得得以以(d
2、y)(dy)游离出来。游离出来。n n再再加加入入苯苯酚酚和和氯氯仿仿等等有有机机溶溶剂剂，能能使使蛋蛋白白质质变变性性，并并使使抽抽提提液液分分相相，因因核核酸酸（DNADNA、RNARNA）水水溶溶性性很很强强，经经离离心心后后即即可可从从抽抽提提液液中中除除去去细细胞胞碎碎片片和和大大部部分分蛋蛋白白质质。上上清清液液中中加加入入冰冰无无水水乙乙醇醇或或者者异异丙丙醇醇使使DNADNA沉沉淀淀，沉沉淀淀DNADNA溶溶于于TETE溶溶液液中中，即即得得植植物物总总DNADNA溶液。溶液。第2页/共21页第三页，共21页。第3页/共21页第四页，共21页。CTAB法法 CTAB法，是198
3、0年Murray和Thompson修改而成的快速简便提取(tq)植物DNA的方法。第4页/共21页第五页，共21页。CTAB法法十六烷基三甲基溴化铵十六烷基三甲基溴化铵 (cetyltrimethyl ammomum bromide (cetyltrimethyl ammomum bromide，简称为，简称为CTAB)CTAB)，为阳离子去污剂，可，为阳离子去污剂，可溶解细胞膜，能与核酸溶解细胞膜，能与核酸(h sun)(h sun)形成复合物，在高盐溶液（形成复合物，在高盐溶液（0.7mol/L 0.7mol/L NaClNaCl）中可溶，当盐浓度降低到一定程度（）中可溶，当盐浓度降低到一
4、定程度（0.3mol/L NaCl0.3mol/L NaCl）时，可沉）时，可沉淀淀CTAB-CTAB-核酸核酸(h sun)(h sun)的复合物，通过有机溶剂抽提和离心沉淀即可除的复合物，通过有机溶剂抽提和离心沉淀即可除去蛋白质，多糖和酚等杂质。最后通过冰乙醇或异丙醇沉淀去蛋白质，多糖和酚等杂质。最后通过冰乙醇或异丙醇沉淀DNADNA，而，而CTABCTAB因溶于冰乙醇或异丙醇而被除去。因溶于冰乙醇或异丙醇而被除去。第5页/共21页第六页，共21页。2、材料、仪器、材料、仪器(yq)、试剂、试剂n n2.1 材料n n 水稻幼苗叶子(y zi)n n2.2 仪器n n高速冷冻离心机、台式离
5、心机、水浴锅、研钵、50mL离心管及1.5mL Eppendorf（EP）管、移液枪及枪头、药匙。第6页/共21页第七页，共21页。2、材料、仪器、材料、仪器(yq)、试剂、试剂n n2.3 试剂(shj)n nCTAB提取液：n n 2%CTAB，100mM Tris-HCl（pH8.0），20mM EDTA（pH8.0），1.4M NaCl，n n 0.1%PVP（聚乙烯吡咯烷酮），n n 2%-巯基乙醇；第7页/共21页第八页，共21页。第8页/共21页第九页，共21页。2.3 试剂试剂(shj)氯仿氯仿-异戊醇（异戊醇（24:124:1，v/vv/v）氯仿是使蛋白质变性并有助于液相与有
6、机相的分开，而异氯仿是使蛋白质变性并有助于液相与有机相的分开，而异戊醇可降低表面张力，从而可消除抽提过程戊醇可降低表面张力，从而可消除抽提过程(guchng)(guchng)中出现中出现的泡沫；的泡沫；异丙醇（异丙醇（-20-20预冷）；预冷）；70%70%乙醇（乙醇（-20-20预冷）预冷）洗去洗去DNADNA表面盐类等杂质；表面盐类等杂质；第9页/共21页第十页，共21页。2.3 试剂试剂(shj)TETE缓冲液（缓冲液（pH8.0pH8.0）：）：10mM Tris-HCl 10mM Tris-HCl，1mM EDTA 1mM EDTA（pH8.0pH8.0），121 121 高压蒸汽灭
7、菌高压蒸汽灭菌 TE TE中的中的EDTA EDTA 能螯合能螯合Mg2+Mg2+或或Mn2+Mn2+抑制抑制(yzh)DNase(yzh)DNase活性，且活性，且pHpH为为8.08.0，可防止，可防止DNADNA发生酸解；发生酸解；10mg/mL RNase A 10mg/mL RNase A；液氮液氮第10页/共21页第十一页，共21页。3、方法、方法(fngf)与步骤与步骤在CTAB提取液中加入2%-巯基乙醇，在65 水浴锅中预热（CTAB需在65 保温溶解，充分(chngfn)混匀后使用）；取幼嫩的水稻叶子0.5g，洗净、吸干、剪碎（冻存材料必须直接研磨，绝对不能化冻；研磨后的粉末
8、应在化冻前转移，否则内源性DNase有可能降解）第11页/共21页第十二页，共21页。3、方法、方法(fngf)与步骤与步骤 移入经过预冷的研钵中，加入液氮研钵至粉末状，用干净的移入经过预冷的研钵中，加入液氮研钵至粉末状，用干净的灭菌不锈钢药匙快速转移粉末至灭菌不锈钢药匙快速转移粉末至1.5mL1.5mL离心管中；加入离心管中；加入250L250L的的CTABCTAB提取液，总体积达到提取液，总体积达到500L500L，混匀后置，混匀后置65 65 磁力磁力(cl)(cl)搅拌水浴锅中保温搅拌水浴锅中保温60min60min；加入等体积的氯仿加入等体积的氯仿-异戊醇（异戊醇（24:124:1）
9、，轻轻地颠倒混匀，室温），轻轻地颠倒混匀，室温下下12000rpm12000rpm离心离心10min10min，移至上清至新，移至上清至新1.5mL EP1.5mL EP管；（可重复管；（可重复 ，抽提两次），抽提两次）第12页/共21页第十三页，共21页。3、方法、方法(fngf)与步骤与步骤 加入加入1 1倍体积倍体积(tj)(tj)的冰异丙醇或者的冰异丙醇或者2 2倍体积倍体积(tj)(tj)冰无水乙醇，颠倒混匀，冰无水乙醇，颠倒混匀，冰浴冰浴1h1h，或者，或者-20-20 放置放置30min30min，或，或-80-80 放置放置10min10min；室温下室温下12000rpm12
10、000rpm离心离心10min10min（可离心时间长一些）；（可离心时间长一些）；弃上清，用弃上清，用70%70%冰乙醇清洗沉淀两次；冰乙醇清洗沉淀两次；室温晾干约室温晾干约2030min2030min；加入加入100L TE 100L TE 缓冲液，加入缓冲液，加入2L RNase2L RNase，37 37 放置放置30min30min，或者室温放，或者室温放置置1h1h；-20 -20 保存。保存。第13页/共21页第十四页，共21页。4、注意事项、注意事项CTAB在低于15 时溶于沉淀，所以使用之前要65 时预热，用前再加巯基乙醇或者加入亚精胺（100L DNA加5L 0.1M的亚精
11、胺）；在研磨前，研钵里不得有任何水分，否则加液氮时容易(rngy)结冰；在用不锈钢灭菌后的药匙移取粉末时，可用枪头的大头移取；第14页/共21页第十五页，共21页。4、注意事项、注意事项在加入氯仿-异戊醇抽提离心后，拿出离心管时动作要轻缓，吸取上层溶液时所用的枪头要减去下面尖端部分，吸取时不要吸取中间的蛋白质层；用70%的乙醇洗DNA后，要使乙醇完全挥发，否则会对后续的PCR产生(chnshng)影响，甚至对限制性酶作用产生(chnshng)非特异性；第15页/共21页第十六页，共21页。4、注意事项、注意事项最后溶于TE缓冲液中：在无离子水溶液中，低浓度的核酸(h sun)由于磷酸基负电荷的
12、排斥作用会引起变性。第16页/共21页第十七页，共21页。第17页/共21页第十八页，共21页。星星(xngxng)活性n n星星活性（星星活性（star activitystar activity）：）：n n 在极端非标准条件下，限制酶能切割与识别序列相似的序列，这个改变的特殊性称星星活在极端非标准条件下，限制酶能切割与识别序列相似的序列，这个改变的特殊性称星星活性。性。n n影响星星活性的因素有很多：影响星星活性的因素有很多：n n 甘油浓度高（甘油浓度高（5%5%），酶过量（），酶过量（100U/L100U/L）,离子离子(lz)(lz)强度低（强度低（25mM8.08.0），或者加入
13、了有机溶剂），或者加入了有机溶剂DMSODMSO（二甲基亚砜），乙醇，乙二醇，或者用其他二价离（二甲基亚砜），乙醇，乙二醇，或者用其他二价离子子(lz)(lz)如如Mn2+Mn2+、Cu2+Cu2+、Co2+Co2+、Zn2+Zn2+代替了代替了Mg2+Mg2+。第18页/共21页第十九页，共21页。4、参考文献、参考文献1 钟卫鸿.基因工程技术实验指导M.北京：化学工业(huxu gngy)出版社，2007，7.2 王镜岩，朱圣庚，徐长法.生物化学教程M.北京：高等教育出版社，2008，6.3 孙明.基因工程M.北京:高等教育出版社，2006，5.4 彭学贤.植物分子生物技术应用手册M.北京：化学工业(huxu gngy)出版社，2006，2.第19页/共21页第二十页，共21页。第20页/共21页第二十一页，共21页。