《发酵——参数检测.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《发酵——参数检测.ppt（78页珍藏版）》请在taowenge.com淘文阁网|工程机械CAD图纸|机械工程制图|CAD装配图下载|SolidWorks_CaTia_CAD_UG_PROE_设计图分享下载上搜索。
1、第七章第七章 微生物培养过程的参数检测微生物培养过程的参数检测 在线检测必须用专门的传感器（也叫电极或探头）在线检测必须用专门的传感器（也叫电极或探头）放入发酵系统，将发酵的一些信息传递出来，为发酵控放入发酵系统，将发酵的一些信息传递出来，为发酵控制提供依据。制提供依据。黑箱黑箱 灰箱灰箱检测仪器：气相色谱、高效液相、离子色谱、检测仪器：气相色谱、高效液相、离子色谱、双向电泳、毛细管电泳、红外光谱、基因测序仪等双向电泳、毛细管电泳、红外光谱、基因测序仪等检测代谢中间物，分析代谢流向、检测代谢中间物，分析代谢流向、RNA检测检测一一 参数在线检测参数在线检测由于微生物培养过程是纯培养过程，无菌由
2、于微生物培养过程是纯培养过程，无菌要求高，因此对传感器有特殊要求：要求高，因此对传感器有特殊要求：l插入罐内的传感器必须能经受高压蒸汽插入罐内的传感器必须能经受高压蒸汽灭菌（材料、数据）灭菌（材料、数据）l传感器结构不能存在灭菌不透的死角，传感器结构不能存在灭菌不透的死角，以防染菌（密封性好）以防染菌（密封性好）l传感器对测量参数要敏感，且能转换成传感器对测量参数要敏感，且能转换成电信号。（响应快、灵敏）电信号。（响应快、灵敏）l传感器性能要稳定，受气泡影响小。传感器性能要稳定，受气泡影响小。带计算机数据采集与控制的生物反应系统带计算机数据采集与控制的生物反应系统P188原理：化学或物理信号原
3、理：化学或物理信号 电信号电信号 放大放大 记录显示仪记录显示仪 控制器（与设定参数比较）控制器（与设定参数比较）发出调节信号发出调节信号 控制器动作控制器动作介绍几种常用的在线检测的传感器及其工介绍几种常用的在线检测的传感器及其工作原理作原理 lpH电极电极l溶氧电极溶氧电极它们是基础电极，以它们为基础可以它们是基础电极，以它们为基础可以制作各种离子电极和酶电极制作各种离子电极和酶电极（一）（一）pH pH测量测量pH值的测量在生物反应中普遍进行，对于值的测量在生物反应中普遍进行，对于生物过程控制是一个非常重要的参数。生物过程控制是一个非常重要的参数。1 1、pHpH的定义的定义影响化学平衡
4、的往往是活度，而不是浓度，影响化学平衡的往往是活度，而不是浓度，但对于稀溶液为了避免在氢离子活度很小但对于稀溶液为了避免在氢离子活度很小时表达方式上的麻烦时表达方式上的麻烦引进引进pH=-lgH+H+=0.00001时时 用用pH5表示表示2 2、pHpH测量方法测量方法 pH试纸曾经是一种广泛采用的方法试纸曾经是一种广泛采用的方法优点：方便，易操作优点：方便，易操作缺点：它主观性较强缺点：它主观性较强 质量差异，不同厂家不同批号的质量差异，不同厂家不同批号的pH试纸测出的试纸测出的pH值会有较大的差别，有时甚至达值会有较大的差别，有时甚至达0.51。对于一些要求较高的场合就适用对于一些要求较
5、高的场合就适用pH试纸试纸pH电极电极（1）pH电极测量原理电极测量原理pH电极实际上是由参比电极电极实际上是由参比电极与指示电极组成的一个自发电与指示电极组成的一个自发电池，该电池的表达式可写为：池，该电池的表达式可写为：参比电极参比电极 溶液溶液X 指示电极指示电极该电池的参比电极的输出电位该电池的参比电极的输出电位恒定，指示电极的输出电位随恒定，指示电极的输出电位随被测体系中氢离子活度而变化。被测体系中氢离子活度而变化。因此整个自发电池的电动势就因此整个自发电池的电动势就是被测体系中氢离子活度的函是被测体系中氢离子活度的函数。数。E=E0-ln1/=E0-2.303 pH式中式中E0对某
6、一给定电极为常数，是温度的函数，因此从对某一给定电极为常数，是温度的函数，因此从电位差计的电位差计的E值可测出值可测出pH值。值。甘汞电极（甘汞电极（a）232型（型（b）217型型1导线；导线；2加液口；加液口；3-KCl溶液；溶液；4素烧瓷芯；素烧瓷芯；5铂丝；铂丝；6Hg；7Hg2Cl2一般的参比电极是甘汞电极。电极的外壳是玻璃管，里面套一根小一般的参比电极是甘汞电极。电极的外壳是玻璃管，里面套一根小玻璃管，其顶部伸出电极引线，引线的下端浸没在汞中，汞的下端玻璃管，其顶部伸出电极引线，引线的下端浸没在汞中，汞的下端有糊状甘汞，汞和甘汞用棉花堵住，只有离子才能通过，而汞和甘有糊状甘汞，汞和
7、甘汞用棉花堵住，只有离子才能通过，而汞和甘汞不会漏失，小管和大管之间充满汞不会漏失，小管和大管之间充满KCl溶液，末端用多孔陶瓷渗入溶液，末端用多孔陶瓷渗入到溶液中，实现电极引线与溶液间的电导通。到溶液中，实现电极引线与溶液间的电导通。u参参比比电电极极 由此可见，甘汞电极是由金属汞及其难溶盐由此可见，甘汞电极是由金属汞及其难溶盐氯氯化亚汞以及含氯离子的电解质溶液组成。这种半电化亚汞以及含氯离子的电解质溶液组成。这种半电池可表示为池可表示为Hg(L)Hg2Cl2(S)Cl-(L)电极电位产生电极电位产生于汞和甘汞的界面，其电极反应为：于汞和甘汞的界面，其电极反应为：2Cl-+2Hg Hg2Cl
8、2+2e-其电极电位为其电极电位为Cl/HgCl,Hg=+ln1/由此可见甘汞电极的电极电位只与氯化钾的活由此可见甘汞电极的电极电位只与氯化钾的活度有关而不受被测溶液的酸碱度影响度有关而不受被测溶液的酸碱度影响（2）指示电极）指示电极对指示电极的电位值随被测溶液氢离子活度的变对指示电极的电位值随被测溶液氢离子活度的变化而变化。原则上讲，任何与氢离子可逆反应的化而变化。原则上讲，任何与氢离子可逆反应的电极都可用来测定溶液的电极都可用来测定溶液的pH。l离子选择性电极的结构离子选择性电极的结构离子选择性电极的结构离子选择性电极的结构其中敏感性膜部分随组成其中敏感性膜部分随组成材料的不同而各有特色。
9、材料的不同而各有特色。测定测定pH值的玻璃电极的值的玻璃电极的敏感膜是厚度为敏感膜是厚度为101103mm的玻璃薄膜，其的玻璃薄膜，其电阻为电阻为50500m。生化过程常用检测方法及仪器生化过程常用检测方法及仪器v 主要参数检测原理及仪器主要参数检测原理及仪器 取样系统取样系统生化过程常用检测方法及仪器生化过程常用检测方法及仪器 主要参数检测原理及仪器主要参数检测原理及仪器 pH的检测的检测常用常用pH检定仪为复合检定仪为复合pH电极，具有结构紧凑，可蒸汽加热灭菌的优点。电极，具有结构紧凑，可蒸汽加热灭菌的优点。工作原理工作原理：利用玻璃电极与参比电极浸泡于某一溶液时具有一定的电：利用玻璃电极
10、与参比电极浸泡于某一溶液时具有一定的电位，其位，其pH可表示为：可表示为：生化过程常用检测方法及仪器生化过程常用检测方法及仪器 主要参数检测原理及仪器主要参数检测原理及仪器 pH的检测的检测生化过程常用检测方法及仪器生化过程常用检测方法及仪器 主要参数检测原理及仪器主要参数检测原理及仪器 pH的检测的检测生化过程常用检测方法及仪器生化过程常用检测方法及仪器 主要参数检测原理及仪器主要参数检测原理及仪器 pH的检测的检测生化过程常用检测方法及仪器生化过程常用检测方法及仪器 主要参数检测原理及仪器主要参数检测原理及仪器 pH的检测的检测生化过程常用检测方法及仪器生化过程常用检测方法及仪器 主要参数
11、检测原理及仪器主要参数检测原理及仪器 溶氧浓度的检测溶氧浓度的检测常用检测方法为溶氧电极法。常用检测方法为溶氧电极法。阴极还原阴极还原:O2+2H2O+4e-4OH-阳极氧化阳极氧化:4Ag+4Cl-4Ag+4Cl-+4e-总反应总反应:O2+2H2O+4Ag+4Cl-4OH-+4AgCl生化过程常用检测方法及仪器生化过程常用检测方法及仪器 主要参数检测原理及仪器主要参数检测原理及仪器 溶氧浓度的检测溶氧浓度的检测生化过程常用检测方法及仪器生化过程常用检测方法及仪器 主要参数检测原理及仪器主要参数检测原理及仪器 溶氧浓度的检测溶氧浓度的检测生化过程常用检测方法及仪器生化过程常用检测方法及仪器
12、主要参数检测原理及仪器主要参数检测原理及仪器 溶解溶解CO2浓度的测定浓度的测定 溶解溶解CO2浓度的检测原理是浓度的检测原理是利用对利用对CO2分子有特殊选择渗分子有特殊选择渗透性的微孔膜，并使扩散通过透性的微孔膜，并使扩散通过的的CO2进入饱和碳酸钠缓冲液进入饱和碳酸钠缓冲液中，平衡后显示的中，平衡后显示的pH与溶解的与溶解的CO2浓度成正比，由此可测出浓度成正比，由此可测出溶解溶解CO2浓度。浓度。CO2电极结构电极结构生化过程常用检测方法及仪器生化过程常用检测方法及仪器主要参数检测原理及仪器主要参数检测原理及仪器n 氧化还原电位（氧化还原电位（ORP）的检测的检测 ORP的检测原理是基
13、于溶液中的金属电极上进行的电子交换达到的检测原理是基于溶液中的金属电极上进行的电子交换达到平衡时，具有相应的氧化还原电位值。表示式为：平衡时，具有相应的氧化还原电位值。表示式为：n 排气的氧分压的测定排气的氧分压的测定生化过程常用检测方法及仪器生化过程常用检测方法及仪器主要参数检测原理及仪器主要参数检测原理及仪器 气体中氧浓度的检测方法主气体中氧浓度的检测方法主要有磁氧分析、极谱电位法和要有磁氧分析、极谱电位法和质谱法。质谱法。n 排气的排气的CO2分压的测定分压的测定生化过程常用检测方法及仪器生化过程常用检测方法及仪器主要参数检测原理及仪器主要参数检测原理及仪器 排气中排气中CO2浓度常用检
14、测仪有浓度常用检测仪有红外线二氧化碳测定仪和红外线二氧化碳测定仪和二氧化二氧化碳电极。碳电极。CO2气体在红外气体在红外2.62.9103和和4.14.5103nm之间有吸收峰，根之间有吸收峰，根据朗伯比尔定律：据朗伯比尔定律：n 细胞浓度的测定细胞浓度的测定生化过程常用检测方法及仪器生化过程常用检测方法及仪器主要参数检测原理及仪器主要参数检测原理及仪器l 全细胞浓度的测定全细胞浓度的测定细胞浓度在线检测浊度计细胞浓度在线检测浊度计n 细胞浓度的测定细胞浓度的测定生化过程常用检测方法及仪器生化过程常用检测方法及仪器主要参数检测原理及仪器主要参数检测原理及仪器l 活细胞浓度的测定活细胞浓度的测定
15、荧光测量活细胞装置图荧光测量活细胞装置图二二 参数的离线检测进展参数的离线检测进展利用高效液相（利用高效液相（HPLC）分析代谢中间产）分析代谢中间产物物 通过中间代谢产物的测定可以深入了解通过中间代谢产物的测定可以深入了解微生物代谢的流向，依此来分析代谢的情微生物代谢的流向，依此来分析代谢的情况。从而有的放矢的控制发酵过程况。从而有的放矢的控制发酵过程三三.发酵过程的自动控制发酵过程的自动控制发酵过程的自动控制是根据过程变量的有效测量和发酵过程的自动控制是根据过程变量的有效测量和发酵过程的自动控制是根据过程变量的有效测量和发酵过程的自动控制是根据过程变量的有效测量和对发酵过程变化规律的认识，
16、借助于由自动化仪对发酵过程变化规律的认识，借助于由自动化仪对发酵过程变化规律的认识，借助于由自动化仪对发酵过程变化规律的认识，借助于由自动化仪表和计算机组成的控制器，控制一些发酵的关键表和计算机组成的控制器，控制一些发酵的关键表和计算机组成的控制器，控制一些发酵的关键表和计算机组成的控制器，控制一些发酵的关键变量，达到控制发酵过程的目的。变量，达到控制发酵过程的目的。变量，达到控制发酵过程的目的。变量，达到控制发酵过程的目的。对发酵过程进行自动控制的优点对发酵过程进行自动控制的优点提高产品的得率；提高产品的得率；提高产品的得率；提高产品的得率；改进产品的质量；改进产品的质量；改进产品的质量；改
17、进产品的质量；降低后续加工过程的损耗；降低后续加工过程的损耗；降低后续加工过程的损耗；降低后续加工过程的损耗；在整个操作过程中能稳定的保持最优条件；在整个操作过程中能稳定的保持最优条件；在整个操作过程中能稳定的保持最优条件；在整个操作过程中能稳定的保持最优条件；提高对原料质量波动的适应性；提高对原料质量波动的适应性；提高对原料质量波动的适应性；提高对原料质量波动的适应性；减少认为因素的影响；减少认为因素的影响；减少认为因素的影响；减少认为因素的影响；提高工厂的生产效率；提高工厂的生产效率；提高工厂的生产效率；提高工厂的生产效率；降低能耗；降低能耗；降低能耗；降低能耗；降低分析和操作成本。降低分
18、析和操作成本。降低分析和操作成本。降低分析和操作成本。存在的问题存在的问题发酵是一个较复杂的生化反应过程，大滞后发酵是一个较复杂的生化反应过程，大滞后和时变性是其主要特征。和时变性是其主要特征。传感器传感器不能蒸汽灭菌；不能蒸汽灭菌；不能蒸汽灭菌；不能蒸汽灭菌；会和产品发生反应；会和产品发生反应；会和产品发生反应；会和产品发生反应；过分敏感。过分敏感。过分敏感。过分敏感。基本的自动控制系统基本的自动控制系统(control loop)前馈控制前馈控制(feedforward control)后（反）馈控制后（反）馈控制(feedback control)自适应控制自适应控制(adaptive
19、control)(adaptive control)1、前馈控制前馈控制如果被控对象动态反应慢，并且干扰频如果被控对象动态反应慢，并且干扰频繁，则可通过对一种动态反应快的变量繁，则可通过对一种动态反应快的变量（干扰量）的测量来预测被控对象的变化，（干扰量）的测量来预测被控对象的变化，在被控对象尚未发生变化时，提前实施控在被控对象尚未发生变化时，提前实施控制。这种控制方法叫做前馈控制。制。这种控制方法叫做前馈控制。如，对温度的控制，在系统中，冷却水如，对温度的控制，在系统中，冷却水的压力被测量但不控制，当压力发生变化的压力被测量但不控制，当压力发生变化时，控制器提前对冷却水控制阀发出动作时，控制
20、器提前对冷却水控制阀发出动作指令，以避免温度的波动。指令，以避免温度的波动。2、反馈控制反馈控制反馈控制系统如图所示，被控过程输出量反馈控制系统如图所示，被控过程输出量x(t)被被传感器检测，以检测量传感器检测，以检测量y(t)反馈到控制系统，控制反馈到控制系统，控制器使之与预定的值器使之与预定的值r(t)（设定点）比较，得出偏差（设定点）比较，得出偏差值值e 。然后采用某种控制算法根据偏差。然后采用某种控制算法根据偏差e确定控制确定控制动作动作u(t)。开关控制；开关控制；PIDPID控制；控制；串（联）级反馈控制；串（联）级反馈控制；前馈前馈/反馈控制。反馈控制。控制器控制器被控对象被控对
21、象传感器传感器r(t)+eu(t)y(t)x(t)开关控制开关控制如发酵温度的开关控如发酵温度的开关控制系统是通过温度传制系统是通过温度传感器检测发酵罐内温感器检测发酵罐内温度，如温度低于设定度，如温度低于设定点，冷水阀关闭，蒸点，冷水阀关闭，蒸汽或热水阀打开；如汽或热水阀打开；如温度高于设定点，蒸温度高于设定点，蒸汽或热水阀关闭，冷汽或热水阀关闭，冷水阀打开。控制阀的水阀打开。控制阀的动作是全开或全关，动作是全开或全关，所以称为开关控制。所以称为开关控制。100%open(on)Valve or switchposition100%closed(off)100%open(on)Valve o
22、r switchposition100%closed(off)PIDPID控制控制当负荷不稳定时，可采用当负荷不稳定时，可采用比例（比例（P P）、）、积分（积分（I I）、）、微分（微分（D D）控制算法，及控制算法，及PIDPID控制。控制。P P、I I、D D控制器的控制信控制器的控制信号，分别正比于被控过程号，分别正比于被控过程的输出量与设定点的偏差、的输出量与设定点的偏差、偏差相对与时间的积分和偏差相对与时间的积分和偏差的变化速率。偏差的变化速率。PP+DP+I+DPositivedeviationControlled variableSet-pointNegativedeviat
23、ionTime 1.Output without control2.Proportional action3.Integral action4.Proportional+integral action5.Proportional+derivative action6.Proportional+integral+derivative action1235,64串联（级）反馈控制串联（级）反馈控制串联反馈控制是由两个以上控串联反馈控制是由两个以上控串联反馈控制是由两个以上控串联反馈控制是由两个以上控制器对一种变量实施联合控制器对一种变量实施联合控制器对一种变量实施联合控制器对一种变量实施联合控制的
24、方法。制的方法。制的方法。制的方法。如溶解氧在发酵罐中的控制。如溶解氧在发酵罐中的控制。如溶解氧在发酵罐中的控制。如溶解氧在发酵罐中的控制。作为一级控制器的溶氧控制作为一级控制器的溶氧控制作为一级控制器的溶氧控制作为一级控制器的溶氧控制器根据检测结果，由器根据检测结果，由器根据检测结果，由器根据检测结果，由PIDPIDPIDPID算算算算法计算出控制输出、但不用法计算出控制输出、但不用法计算出控制输出、但不用法计算出控制输出、但不用它来直接实施控制动作、而它来直接实施控制动作、而它来直接实施控制动作、而它来直接实施控制动作、而是被作为二级控制器的搅拌是被作为二级控制器的搅拌是被作为二级控制器的
25、搅拌是被作为二级控制器的搅拌转速、空气流量和压力控制转速、空气流量和压力控制转速、空气流量和压力控制转速、空气流量和压力控制器当作设定点接受，二级控器当作设定点接受，二级控器当作设定点接受，二级控器当作设定点接受，二级控制器再由另一个制器再由另一个制器再由另一个制器再由另一个PIDPIDPIDPID算法计算法计算法计算法计算出第二个控制输出，用于算出第二个控制输出，用于算出第二个控制输出，用于算出第二个控制输出，用于实施控制动作，以满足一级实施控制动作，以满足一级实施控制动作，以满足一级实施控制动作，以满足一级控制器设定的溶氧水平。控制器设定的溶氧水平。控制器设定的溶氧水平。控制器设定的溶氧水
26、平。溶解氧水平的串联反馈控制溶解氧水平的串联反馈控制前前/反馈控制反馈控制如前馈如前馈/反馈控制反馈控制应用于污水处理应用于污水处理系统。系统。污水处理的前污水处理的前/反馈控制系统反馈控制系统SS：悬浮固体含量传感器：悬浮固体含量传感器FRC：流量记录和控制器：流量记录和控制器3 3、自适应控制自适应控制(adaptive control)发酵过程是复杂的和不确定的过程，对发酵过程动态发酵过程是复杂的和不确定的过程，对发酵过程动态特性无法确定数学模型。对于这样过程的控制，须提特性无法确定数学模型。对于这样过程的控制，须提取有关的输入、输出信号，对模型和参数不断进行辩取有关的输入、输出信号，对
27、模型和参数不断进行辩识，使模型逐渐完善，同时自动修改控制器的控制识，使模型逐渐完善，同时自动修改控制器的控制 动动作，使之适应于实际过程。作，使之适应于实际过程。发酵自控系统的硬件组成发酵自控系统的硬件组成传感器传感器变送器变送器执行机构执行机构转换器转换器过程接口过程接口监控计算机监控计算机发酵自控系统的硬件组成发酵自控系统的硬件组成发酵过程常见控制系统1、Feed controlSchedule of fermentation2、Temperature control loop3、pH control loop4、pO2-and rpm-control5、Antifoam control例
28、：鸟苷生产例：鸟苷生产在鸟苷发酵中，发在鸟苷发酵中，发现发酵到现发酵到40小时后小时后鸟苷合成速率下降，鸟苷合成速率下降，但糖耗速率并未下但糖耗速率并未下降，而且由于耗糖降，而且由于耗糖,使发酵过程使发酵过程pH下降，下降，补入氨水增多。那补入氨水增多。那么糖耗到哪里去了么糖耗到哪里去了呢？呢？于是进行以下一些于是进行以下一些测定与分析测定与分析什么因素导致什么因素导致pH下降？下降？1 1、有机酸的积累、有机酸的积累 有机酸积累有机酸积累 pH下降下降 补加补加氨水氨水 在正常代谢情况下，细胞通过在正常代谢情况下，细胞通过EMP途径和途径和TCA循环的过程是为细胞合成提供前体和能循环的过程是
29、为细胞合成提供前体和能量的，按照细胞经济学的原则不会供过于求，量的，按照细胞经济学的原则不会供过于求，即不会出现有机酸的积累即不会出现有机酸的积累若发酵后期有机酸积累会引起加入的若发酵后期有机酸积累会引起加入的NH4+积累，相应出现产苷速率下降。积累，相应出现产苷速率下降。代谢不代谢不正常正常测定以下中间物测定以下中间物发酵后期丙酮酸积累发酵后期丙酮酸积累2 2、氨基酸的积累、氨基酸的积累在有机酸分析的基础上进一步通过在有机酸分析的基础上进一步通过HPLC测测定发酵过程中不同时间发酵液中氨基酸，定发酵过程中不同时间发酵液中氨基酸，结果发现总氨基酸积累并且其积累晚于有结果发现总氨基酸积累并且其积
30、累晚于有机酸和机酸和NH4+积累。积累。氨基酸成分分析表明，初始发酵液中谷氨氨基酸成分分析表明，初始发酵液中谷氨酸浓度比较高，其它氨基酸浓度都较低，酸浓度比较高，其它氨基酸浓度都较低，随着发酵过程的进行谷氨酸很快被用于菌随着发酵过程的进行谷氨酸很快被用于菌体合成，在体合成，在8小时之前已经降到很低水平，小时之前已经降到很低水平，并始终维持在低水平，而在并始终维持在低水平，而在48小时左右丙小时左右丙氨酸开始出现明显的积累，发酵液中积累氨酸开始出现明显的积累，发酵液中积累量达到初始量的量达到初始量的12.6倍之多，其它十余种倍之多，其它十余种氨基酸浓度则变化不大，并且在整个发酵氨基酸浓度则变化不
31、大，并且在整个发酵过程中都维持在较低水平。因此，丙氨酸过程中都维持在较低水平。因此，丙氨酸浓度变化可能是导致代谢流迁移所致。浓度变化可能是导致代谢流迁移所致。3 3、分析原因、分析原因发酵过程中积累的氨基酸主要是丙氨酸，发酵过程中积累的氨基酸主要是丙氨酸，而丙氨酸的合成可以直接由丙酮酸转化而而丙氨酸的合成可以直接由丙酮酸转化而来，因此可以推断由于来，因此可以推断由于EMP途径代谢流的途径代谢流的增加造成了丙酮酸的积累，丙酮酸随后转增加造成了丙酮酸的积累，丙酮酸随后转化为丙氨酸化为丙氨酸丙氨酸本身又会对谷氨酸合成酶（丙氨酸本身又会对谷氨酸合成酶（GS）造）造成反馈抑制和阻遏，使产苷速率降低。成反
32、馈抑制和阻遏，使产苷速率降低。恶性循环恶性循环激活磷酸果糖激酶激活磷酸果糖激酶丙酮酸积累丙酮酸积累 氨水补加增加氨水补加增加NH4+积累积累抑制抑制GS抑制抑制TCA循环循环丙酮酸积累丙酮酸积累EMP流量增加流量增加丙氨酸丙氨酸积累积累（二）（二）代谢流迁移的酶学证明代谢流迁移的酶学证明糖代谢途径关键酶糖代谢途径关键酶糖酵解途径（糖酵解途径（EMP）在糖酵解途径中有两个不可逆的步骤的酶：在糖酵解途径中有两个不可逆的步骤的酶：磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶 磷酸果糖激酶的时序分析磷酸果糖激酶的时序分析12小时时由于生长处于对数生长初期，代谢活力较低，小时时由于生长处于对数生长初
33、期，代谢活力较低，所以所以PFK的活力相对较低。的活力相对较低。24小时后随着发酵过程进小时后随着发酵过程进入平稳产物形成期和细胞生长期，磷酸果糖激酶的活入平稳产物形成期和细胞生长期，磷酸果糖激酶的活力也基本保持平稳。但是到力也基本保持平稳。但是到40小时以后，鸟苷形成速小时以后，鸟苷形成速率减慢甚至停止，同时观察到氨基酸和有机酸积累，率减慢甚至停止，同时观察到氨基酸和有机酸积累，PFK相对酶活增加，这表明此时通过相对酶活增加，这表明此时通过EMP途径的糖代途径的糖代谢通量已有了明显的增加。谢通量已有了明显的增加。丙酮酸激酶时序分析丙酮酸激酶时序分析丙酮酸激酶没有表现出明显的酶活增加，丙酮酸激
34、酶没有表现出明显的酶活增加，而是在而是在24小时就基本上达到其最大值，随小时就基本上达到其最大值，随后维持在恒定的水平，这表明在糖代谢时后维持在恒定的水平，这表明在糖代谢时EMP途径代谢流增加中丙酮酸激酶所起的途径代谢流增加中丙酮酸激酶所起的作用不大，不是造成代谢流迁移的主要因作用不大，不是造成代谢流迁移的主要因素素 磷酸戊糖途径（磷酸戊糖途径（HMP）关键酶）关键酶磷酸戊糖途径中主要的限速酶是磷酸戊糖途径中主要的限速酶是6磷酸葡磷酸葡萄糖脱氢酶，该酶催化萄糖脱氢酶，该酶催化6磷酸葡萄糖脱氢磷酸葡萄糖脱氢生成生成6磷酸葡萄糖酸内酯磷酸葡萄糖酸内酯。6磷酸葡萄糖脱氢酶时序分析磷酸葡萄糖脱氢酶时序
35、分析由图可以看到，早期由图可以看到，早期6磷酸葡萄糖脱氢酶活力很高，磷酸葡萄糖脱氢酶活力很高，这可能是前期菌体合成代谢比较活跃，通过这可能是前期菌体合成代谢比较活跃，通过HMP途径途径合成用于细胞成分的核酸等组成物质；随后基本不变，合成用于细胞成分的核酸等组成物质；随后基本不变，从而保持从而保持EMP和和HMP途径通量的平衡，此时稳定持续途径通量的平衡，此时稳定持续的形成产物；但是到的形成产物；但是到40小时后，小时后，6磷酸葡萄糖脱氢酶磷酸葡萄糖脱氢酶已经表现出明显的下降趋势，并且随着后期发酵过程已经表现出明显的下降趋势，并且随着后期发酵过程的进行而持续下降。根据物料平衡原则，有可能糖代的进
36、行而持续下降。根据物料平衡原则，有可能糖代谢在谢在HMP途径通量下降而途径通量下降而EMP途径通量增加。途径通量增加。三羧酸三羧酸(TCA)循环的关键酶循环的关键酶三羧酸循环是三羧酸循环是“消耗消耗”丙酮酸的途径，丙酮酸的途径，三羧酸流量大丙酮酸不会积累。三羧三羧酸流量大丙酮酸不会积累。三羧酸循环中的关键酶为酸循环中的关键酶为柠檬酸合成酶柠檬酸合成酶，其催化乙酰辅酶其催化乙酰辅酶A与草酰乙酸缩合形与草酰乙酸缩合形成柠檬酸，是三羧酸循环的启动步骤，成柠檬酸，是三羧酸循环的启动步骤，也是三羧酸循环中的主要控制点，由也是三羧酸循环中的主要控制点，由柠檬酸合成酶所催化的反应是三羧酸柠檬酸合成酶所催化的
37、反应是三羧酸循环中的第一个限速步骤。循环中的第一个限速步骤。柠檬酸合成酶时序分析柠檬酸合成酶时序分析从图可以看到，从图可以看到，TCA循环的关键酶柠檬循环的关键酶柠檬酸合成酶在整个发酵过程中，尤其是在酸合成酶在整个发酵过程中，尤其是在后期产苷速率下降的过程中都维持比较后期产苷速率下降的过程中都维持比较平稳的水平，这表明在发酵过程后期所平稳的水平，这表明在发酵过程后期所发生的代谢流迁移时，发生的代谢流迁移时，TCA循环的通量循环的通量并没有发生明显的增加。即并没有发生明显的增加。即代谢流迁移代谢流迁移发生在发生在EMP和和HMP之间，主要是由于之间，主要是由于EMP和和HMP途径之间的分配平衡被
38、打破途径之间的分配平衡被打破所造成的。所造成的。EMP途径代谢流的增加造成途径代谢流的增加造成了一种代谢流的溢流现象。了一种代谢流的溢流现象。丙氨酸脱氢酶的时序分析丙氨酸脱氢酶的时序分析在发酵中后期，丙氨酸脱氢酶活力出现了明在发酵中后期，丙氨酸脱氢酶活力出现了明显的增加。丙氨酸脱氢酶催化由丙酮酸生成显的增加。丙氨酸脱氢酶催化由丙酮酸生成丙氨酸，该酶活性增加与丙酮酸和丙氨酸的丙氨酸，该酶活性增加与丙酮酸和丙氨酸的时序增加相吻合，这些数据表明代谢流的溢时序增加相吻合，这些数据表明代谢流的溢流现象发生在柠檬酸合成酶之前的丙酮酸节流现象发生在柠檬酸合成酶之前的丙酮酸节点，通过丙氨酸脱氢酶生成丙氨酸，从
39、而缓点，通过丙氨酸脱氢酶生成丙氨酸，从而缓解了解了EMP途径代谢流增加造成的代谢不平衡。途径代谢流增加造成的代谢不平衡。结果加入结果加入EMP途径的抑制剂，克服了途径的抑制剂，克服了代谢流迁移的问题，提高了鸟苷的产代谢流迁移的问题，提高了鸟苷的产量量（三）与产物合成相关的酶和中间物（三）与产物合成相关的酶和中间物测定测定例：螺旋霉素生物合成的代谢研究例：螺旋霉素生物合成的代谢研究图图3 螺旋霉素生物合成代谢网络途径螺旋霉素生物合成代谢网络途径 图图1 螺旋霉素生物合成中间物动态流量分布图螺旋霉素生物合成中间物动态流量分布图 哪哪个个代代谢谢中中间间物物过过多多积积累累在在发发酵酵后后期期有有F
40、O-积积累累，要要减减少少FO-FO-转转化化为为FO-必必须须降降低低C3酰酰化化酶酶的的活活力力，但但这这与与SP、SP合成有矛盾合成有矛盾在发酵结束时，在发酵结束时，SP-SP-还有一定的积累，如能最大还有一定的积累，如能最大限度的转化为限度的转化为SP-SP-、SP-SP-，即加强步骤，即加强步骤3 3对发酵对发酵效率和发酵效价是有积极意义的。而效率和发酵效价是有积极意义的。而FO-FO-、NSP-NSP-的最终积累则导致流量浪费，因为这两种物质最的最终积累则导致流量浪费，因为这两种物质最终不能转化为目的产物。因此必须减小步骤终不能转化为目的产物。因此必须减小步骤4 4的通的通量。但由
41、于这几个步骤的转化都是由量。但由于这几个步骤的转化都是由C C3 3酰化酶催化酰化酶催化反应，这给改变通量带来一定的困难。反应，这给改变通量带来一定的困难。图图2 有机酸前体的动态流量分布图有机酸前体的动态流量分布图在图在图2 2中，乙酸和丁酸在从中，乙酸和丁酸在从4040小时开始积累小时开始积累并在并在6464小时达到最高值，对照图小时达到最高值，对照图3 3螺旋霉素螺旋霉素生物合成代谢网络途径生物合成代谢网络途径99，我们可以推测在，我们可以推测在发酵中前期在图发酵中前期在图3 3中的步骤中的步骤1 1也即大环成环步也即大环成环步骤有一定程度的骤有一定程度的“瓶颈瓶颈”影响，从而导致乙影响
42、，从而导致乙酸、丁酸有一定的积累。若能加强这一步骤酸、丁酸有一定的积累。若能加强这一步骤的通量，应能提高代谢网络的通量，提高螺的通量，应能提高代谢网络的通量，提高螺旋霉素的效价。旋霉素的效价。我们测定了内酯环合成相关的酶活我们测定了内酯环合成相关的酶活前体前体的活化的活化酰基激酶和酰基酰基激酶和酰基CoA合成酶活性趋势合成酶活性趋势 测定酶活并建立酶活趋势曲线。测定酶活并建立酶活趋势曲线。分分析析：两两种种酶酶在在发发酵酵过过程程中中都都有有两两个个活活性性高峰期高峰期,但但出出现现的的时间时间相差很大。相差很大。酰酰基基激激酶酶的的活活性性高高峰峰期期主主要要集集中中在在发发酵酵中中前期前期
43、酰酰基基CoACoA合合成成酶酶的的活活性性高高峰峰期期主主要要集集中中在在发发酵酵中中后后期期。此此外外，酰酰基基CoACoA合合成成酶酶的的活活性性远远小于小于酰酰基激基激酶酶的活性。的活性。图图1 1 酰基激酶和酰基酰基激酶和酰基CoACoA合成酶活性趋势合成酶活性趋势 酰基激酶酰基激酶酰基酰基CoA合成酶合成酶酰基激酶在发酵初期出现一个活性高峰，酰基激酶在发酵初期出现一个活性高峰，推测其参与了初级代谢；后一个活力峰出推测其参与了初级代谢；后一个活力峰出现在发酵中期，且与酰基现在发酵中期，且与酰基CoACoA合成酶的第合成酶的第一个活力峰出现时间相一致，意味着酰基一个活力峰出现时间相一致
44、，意味着酰基激酶对次级代谢同样有着重要作用。在螺激酶对次级代谢同样有着重要作用。在螺旋霉素的生物合成中，酰基旋霉素的生物合成中，酰基CoACoA合成酶的合成酶的活性主要集中在发酵中后期，推测合成酶活性主要集中在发酵中后期，推测合成酶主要参与次级代谢。由于合成酶的活性较主要参与次级代谢。由于合成酶的活性较小，推测其可能是大环合成的小，推测其可能是大环合成的“瓶颈瓶颈”，如果提高其活性，就有可能大幅度提高发如果提高其活性，就有可能大幅度提高发酵效价。酵效价。采取措施：寻找酶的激活剂采取措施：寻找酶的激活剂添添加加ZnSOZnSO4 4、MnClMnCl2 2、CoClCoCl2 2、CuSOCuS
45、O4 4等等无无机机盐盐，研研究究了了ZnZn2+2+、MnMn2+2+、CoCo2+2+、CuCu2+2+等等二价阳离子对两种酶的影响。二价阳离子对两种酶的影响。体体外外各各阳阳离离子子对对酶酶活活性性影影响响，确确定定了了各各阳阳离离子子对对两两种种酶酶的的最最佳佳添添加加浓浓度度（表表1 1）。）。ControlCo2+Zn2+Mn2+Cu2+图图2 2 二价阳离子对酰基激酶活性的影响二价阳离子对酰基激酶活性的影响ControlCo2+Zn2+Mn2+Cu2+图图3 3 二价阳离子对酰基二价阳离子对酰基CoACoA合成酶活性的影响合成酶活性的影响 在在最最佳佳浓浓度度下下，各各离离子子对
46、对两两种种酶酶的的影影响响程程度度如如图图2 2、3 3所所示示。对对于于酰酰基基激激酶酶，CoCo2+2+、MnMn2+2+、ZnZn2+2+离离子子都都有有明明显显的的激激活活作作用用；而而CuCu2+2+则则几几乎乎完完全全抑抑制制了了激激酶酶。对对于于酰酰基基CoACoA合合成成酶酶，CuCu2+2+却却有有很很强强的的激激活活作作用用；CoCo2+2+、MnMn2+2+有有较较高高的的激激活活作作用；而用；而ZnZn2+2+的作用不明显。的作用不明显。摇瓶发酵摇瓶发酵根根据据酰酰基基激激酶酶和和酰酰基基CoACoA合合成成酶酶活活性性趋趋势势曲曲线线，分分别别在在发发酵酵0h0h和和
47、48h48h添添加加上上述述最最佳佳浓浓度度的的离离子子，测测定定螺旋霉素的平均发酵效价（表螺旋霉素的平均发酵效价（表2 2）。）。表表2 2 不同时间添加二价阳离子对螺旋霉素效价的影响不同时间添加二价阳离子对螺旋霉素效价的影响0h0h48h48hControlControlMnMn2+2+CoCo2+2+MnMn2+2+CoCo2+2+CuCu2+2+1#1#2571257126122612280628062498249830243024295629562#2#2606 2606 3350 3350 322432242814 2814 3498 3498 3822 3822 AverageA
48、verage2589 2589 2981 2981 301530152656265632613261 3389 3389 代谢过程检测的新进展代谢过程检测的新进展转录谱转录谱基因芯片基因芯片微阵列检测微阵列检测RNA含量含量思考题思考题1、用于在线检测的传感器必须符合哪些要求？、用于在线检测的传感器必须符合哪些要求？2、pH电极的指示电极能测定电极的指示电极能测定pH值的原理是什么？值的原理是什么？3、pH电极的测量范围有没有限制？使用时应注意哪些问题电极的测量范围有没有限制？使用时应注意哪些问题？4、溶氧电极能够测定液体中溶氧浓度的原理是什么？、溶氧电极能够测定液体中溶氧浓度的原理是什么？5、影响溶氧电极测定的灵敏度和准确性的因素有哪些？、影响溶氧电极测定的灵敏度和准确性的因素有哪些？6、哪些仪器可以测定尾气氧和尾气二氧化碳？测定原理是、哪些仪器可以测定尾气氧和尾气二氧化碳？测定原理是什么？什么？