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1、第二节第二节 分子杂交及相关技术分子杂交及相关技术分子杂交分子杂交,标记的探针标记的探针DNADNA变性后与变性后的变性后与变性后的靶靶DNA/RNADNA/RNA通过碱基互补配对结合，形成杂种通过碱基互补配对结合，形成杂种分子的过程分子的过程。分子杂交包括分子杂交包括：DNA-DNADNA-DNA杂交，杂交，DNA-RNADNA-RNA杂交杂交及蛋白杂交等。及蛋白杂交等。分子杂交的目的就是运用特异的探针鉴定分子杂交的目的就是运用特异的探针鉴定复杂的靶复杂的靶DNADNA中同源的中同源的DNADNA片段。片段。双链双链probeprobe或或DNADNA解链，主要取决于：解链，主要取决于：1
2、1链的长度链的长度：链越长，需要的：链越长，需要的 能量多才能量多才能解链；能解链；2 2碱基成分碱基成分：GCGC含量高，较难变性；含量高，较难变性；3 3化学环境化学环境：单价阳离子稳定双链，甲酰：单价阳离子稳定双链，甲酰胺，尿素破坏双链胺，尿素破坏双链 一、杂交探针的获得一、杂交探针的获得l l是指一段目的基因或是指一段目的基因或DNA/RNADNA/RNA片段特异杂交的片段特异杂交的核苷酸序列。核苷酸序列。l lProbeProbe可以是整个基因，或是基因的一部分，可以是整个基因，或是基因的一部分，是是DNADNA，也可以是，也可以是RNARNA。（一）制备特异性探针所需要的基（一）制
3、备特异性探针所需要的基本条件本条件 1.1.被检基因结构清楚；被检基因结构清楚；2.2.有明确的基因产物有明确的基因产物;3.3.已知某一基因产物对表型的反应或缺少某已知某一基因产物对表型的反应或缺少某一基因对表型的反应。一基因对表型的反应。具备以上条件之一就可以制备特异性基因探具备以上条件之一就可以制备特异性基因探针。针。（二）特异探针的来源（二）特异探针的来源l l1 1 1 1、基因组、基因组、基因组、基因组探针：探针：探针：探针：l l从已建立的从已建立的从已建立的从已建立的基因组文库基因组文库基因组文库基因组文库中筛选和分中筛选和分中筛选和分中筛选和分离所需的目离所需的目离所需的目离
4、所需的目的基因。的基因。的基因。的基因。l l克隆克隆克隆克隆 l l 扩增扩增扩增扩增 l l大量的大量的大量的大量的l lDNADNADNADNA探针探针探针探针DNA克隆2 2、cDNA cDNA probe:probe:从已从已构建的构建的cDNAcDNA文库中筛查文库中筛查和分离目的和分离目的基因探针。基因探针。3 3、寡核苷酸探针、寡核苷酸探针克隆（克隆（cloneclone）:是指用无性繁殖的方法获得同一个是指用无性繁殖的方法获得同一个体、细胞或分子的大量复制品。体、细胞或分子的大量复制品。根据已知基因序列，人工合成一段互补的根据已知基因序列，人工合成一段互补的DNADNA片段。
5、片段。一般长约一般长约15155050个个bpbp。多数探针的制备都通过分子。多数探针的制备都通过分子克隆的方法获得。克隆的方法获得。二、探针的标记二、探针的标记l l将探针标记上一种标识物以便杂交后检测。将探针标记上一种标识物以便杂交后检测。l l 常用于标记探针的标识物：常用于标记探针的标识物：l l同位素同位素：3232P P ,35 35S S ,3 3H-dNTPH-dNTP等；等；l l非同位素非同位素：地高辛：地高辛-dNTP-dNTP，生物素，生物素-dNTP-dNTP。ll 常用的标记方法常用的标记方法：1 1、缺口平移法、缺口平移法 （Nick TranslationNic
6、k Translation）l l原理及过程：原理及过程：原理及过程：原理及过程：l l反应体系中反应体系中反应体系中反应体系中DNADNADNADNA酶酶酶酶I I I I随机在探针随机在探针随机在探针随机在探针DNADNADNADNA上打开缺口，然上打开缺口，然上打开缺口，然上打开缺口，然后利用后利用后利用后利用DNADNADNADNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶I 5 3I 5 3I 5 3I 5 3外切酶活性，在外切酶活性，在外切酶活性，在外切酶活性，在缺口处按缺口处按缺口处按缺口处按5 35 35 35 3方向切除单核苷酸；同时方向切除单核苷酸；同时方向切除单核苷酸；同时方向切除单核苷酸
7、；同时DNADNADNADNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶I I I I有有有有5 35 35 35 3的聚合酶活性，在缺口处的聚合酶活性，在缺口处的聚合酶活性，在缺口处的聚合酶活性，在缺口处3333端加入底物中的单核苷酸，弥补缺口处的核苷端加入底物中的单核苷酸，弥补缺口处的核苷端加入底物中的单核苷酸，弥补缺口处的核苷端加入底物中的单核苷酸，弥补缺口处的核苷酸链。随着反应的进行底物中被标记单核苷酸，酸链。随着反应的进行底物中被标记单核苷酸，酸链。随着反应的进行底物中被标记单核苷酸，酸链。随着反应的进行底物中被标记单核苷酸，并被随机掺入。并被随机掺入。并被随机掺入。并被随机掺入。DNADNADNAD
8、NA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶I I I I的两种作用交替进行，的两种作用交替进行，的两种作用交替进行，的两种作用交替进行，探针即被标记。探针即被标记。探针即被标记。探针即被标记。NickTranslationOHpOH+PPDNAdNTP，DNA酶I，DNA聚合酶I32P-dNTPBio-dNTP2 2、随机引物法（、随机引物法（6 6核苷酸引物标记法）核苷酸引物标记法）l l原理及过程：原理及过程：利用利用E.coli E.coli DNADNA聚合酶聚合酶I I的的KlenowKlenow亚单位亚单位，合成含有标记核苷酸的，合成含有标记核苷酸的DNADNA链。链。KlenowKlenow具
9、有具有5 35 3聚合酶活性。聚合酶活性。l l被标记的被标记的DNADNA（探针）变性成单链，引物与模（探针）变性成单链，引物与模板结合。在板结合。在KlenowKlenow的催化下，以引物的催化下，以引物33端为端为起点，沿模板起点，沿模板3 53 5方向合成方向合成DNADNA新链。新链。反应体系中含有标记的反应体系中含有标记的dNTP,dNTP,随机掺入新合成随机掺入新合成的的DNADNA链中，探针即被标记。链中，探针即被标记。随机引物标记探针随机引物标记探针53553DNA32p-dNTP,Bio-Dntp6bpprimerKlenow,dNTP变性变性-复姓复姓一、一、DNADNA
10、杂交常用的方法杂交常用的方法 （一）（一）（一）（一）.Southern blot.Southern blot.Southern blot.Southern blot1975197519751975年，英国科学家年，英国科学家年，英国科学家年，英国科学家SouthernSouthernSouthernSouthern首创，是指首创，是指首创，是指首创，是指DNA-DNADNA-DNADNA-DNADNA-DNA杂交，是经典的基因分杂交，是经典的基因分杂交，是经典的基因分杂交，是经典的基因分析方法。析方法。析方法。析方法。1 1 1 1、原理和步骤、原理和步骤、原理和步骤、原理和步骤:提取提取提
11、取提取T T T T、Cell DNACell DNACell DNACell DNA 限制酶消化限制酶消化限制酶消化限制酶消化 DNA DNA DNA DNA片段片段片段片段 电泳分离电泳分离电泳分离电泳分离 变性转移至尼龙膜变性转移至尼龙膜变性转移至尼龙膜变性转移至尼龙膜 变性、杂交变性、杂交变性、杂交变性、杂交 洗膜、放射自显影、结果分析洗膜、放射自显影、结果分析洗膜、放射自显影、结果分析洗膜、放射自显影、结果分析Southern BlotSouthern Blot2 2、应、应 用用:(1)(1)基因组结构分析：基因组结构分析：如缺失、插入、倒位等的检测如缺失、插入、倒位等的检测(2)
12、RFLP(2)RFLP连锁分析连锁分析(二二).).斑点杂交斑点杂交(dot and slot hybridization)(dot and slot hybridization)鉴定核酸序列的简便方法。鉴定核酸序列的简便方法。鉴定核酸序列的简便方法。鉴定核酸序列的简便方法。1 1 1 1、原理及步骤、原理及步骤、原理及步骤、原理及步骤：提取提取提取提取T T T T、Cell DNACell DNACell DNACell DNA 点样品至膜、干燥、固定点样品至膜、干燥、固定点样品至膜、干燥、固定点样品至膜、干燥、固定 探针、探针、探针、探针、DNADNADNADNA变性、杂交变性、杂交变性
13、、杂交变性、杂交 洗膜、放射自显影洗膜、放射自显影洗膜、放射自显影洗膜、放射自显影 结果分析结果分析结果分析结果分析 DNADNA 样品样品 2 2 2 2、应用：、应用：、应用：、应用：1 1 1 1）混合样品）混合样品）混合样品）混合样品DNADNADNADNA鉴定鉴定鉴定鉴定2 2 2 2）基因缺失检测）基因缺失检测）基因缺失检测）基因缺失检测3 3 3 3）基因表达分析）基因表达分析）基因表达分析）基因表达分析点样点样Probe-32P检测检测AB1234（三）等位基因特异性寡核苷酸探针杂交，三）等位基因特异性寡核苷酸探针杂交，ASOASO）l l 该技术应用于当基因的突变部位和性质已
14、完全明确，可该技术应用于当基因的突变部位和性质已完全明确，可该技术应用于当基因的突变部位和性质已完全明确，可该技术应用于当基因的突变部位和性质已完全明确，可以合成以合成以合成以合成ASOASOASOASO探针。探针通常为探针。探针通常为探针。探针通常为探针。探针通常为20bp20bp20bp20bp左右，标记后用于杂交左右，标记后用于杂交左右，标记后用于杂交左右，标记后用于杂交检测。检测。检测。检测。l l检测点突变时一般需合成两种探针：检测点突变时一般需合成两种探针：检测点突变时一般需合成两种探针：检测点突变时一般需合成两种探针：设计：正常探针设计：正常探针设计：正常探针设计：正常探针 5-
15、AGT-3 5-AGT-3 5-AGT-3 5-AGT-3 与正常基因序列杂交与正常基因序列杂交与正常基因序列杂交与正常基因序列杂交 稳定而不与突变基因杂交；稳定而不与突变基因杂交；稳定而不与突变基因杂交；稳定而不与突变基因杂交；突变探针突变探针突变探针突变探针 5-AAT-3 5-AAT-3 5-AAT-3 5-AAT-3 与突变基因序列杂交与突变基因序列杂交与突变基因序列杂交与突变基因序列杂交 稳定而不与正常基因杂交；稳定而不与正常基因杂交；稳定而不与正常基因杂交；稳定而不与正常基因杂交；l l PCR PCR PCR PCR技术可结合技术可结合技术可结合技术可结合ASOASOASOASO
16、，即，即，即，即PCR-ASOPCR-ASOPCR-ASOPCR-ASO技术，以技术，以技术，以技术，以ASOASOASOASO探针检测探针检测探针检测探针检测扩增后的产物扩增后的产物扩增后的产物扩增后的产物突变基因检测。突变基因检测。突变基因检测。突变基因检测。例:PKU产前诊断正常探针正常探针突变探针突变探针121222进行产前基因诊断进行产前基因诊断结果分析结果分析22为正常个体为正常个体四、四、Northern blotNorthern blotl l是指是指是指是指DNA-RNADNA-RNADNA-RNADNA-RNA分子杂交，应用特异性基分子杂交，应用特异性基分子杂交，应用特异性
17、基分子杂交，应用特异性基 l l 因探针分析基因的转录水平。因探针分析基因的转录水平。因探针分析基因的转录水平。因探针分析基因的转录水平。1 1 1 1、原理及步骤：、原理及步骤：、原理及步骤：、原理及步骤：提取提取提取提取 T T T T、Cell Cell Cell Cell 总总总总 RNA RNA RNA RNA提纯分离提纯分离提纯分离提纯分离mRNAmRNAmRNAmRNA 琼脂糖凝胶电泳分离琼脂糖凝胶电泳分离琼脂糖凝胶电泳分离琼脂糖凝胶电泳分离RNARNARNARNA转移至硝酸纤维素膜转移至硝酸纤维素膜转移至硝酸纤维素膜转移至硝酸纤维素膜杂交检测杂交检测杂交检测杂交检测Northe
18、r BlotNorther Blot2 2、应、应 用：用：l l（1 1）.检测检测mRNAmRNA长度分子量大小（依电泳迁长度分子量大小（依电泳迁移率估计）；移率估计）；l l（2 2）.mRNA.mRNA的含量，即基因表达高低。（密的含量，即基因表达高低。（密度扫描仪，定量分析）度扫描仪，定量分析）五、五、Western blotWestern blot是蛋白水平检测，研究基因表达与功能的一种方法是蛋白水平检测，研究基因表达与功能的一种方法是蛋白水平检测，研究基因表达与功能的一种方法是蛋白水平检测，研究基因表达与功能的一种方法。原理及步骤原理及步骤原理及步骤原理及步骤：T or cell T or cell T or cell T or cell 提取蛋白提取蛋白提取蛋白提取蛋白 聚丙烯酰胺凝胶电泳，分类蛋白聚丙烯酰胺凝胶电泳，分类蛋白聚丙烯酰胺凝胶电泳，分类蛋白聚丙烯酰胺凝胶电泳，分类蛋白 （SDS-PAGE SDS-PAGE ）转移（印迹）于硝酸纤维素膜转移（印迹）于硝酸纤维素膜转移（印迹）于硝酸纤维素膜转移（印迹）于硝酸纤维素膜 l l 加抗体检测某种特异性蛋白质加抗体检测某种特异性蛋白质加抗体检测某种特异性蛋白质加抗体检测某种特异性蛋白质WestBlot