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1、单位代码 10635 学 号112011326002007硕士学位论文玉米籽粒花色苷含量主效QTL-AC6的精细定位及基因预测论文作者：王旭指导教师：蔡一林 教授学科专业：作物遗传育种研究方向：玉米分子育种提交论文日期：2014年04月10日论文答辩日期：2014年05月27日学位授予单位：西南大学中国重庆2014年5月Dissertation for Masters Degree of Southwest UniversityFine mapping of the main effect QTL-AC6 and gene prediction for Anthocyanins content
2、 in kernel of maize.Masters degree candidate: Wang XuSupervisor: Professor Cai YilinMajor: Crop Genetics and BreedingDirection: Maize Molecular BreedingChongqing ChinaMay 2014独创性声明学位论文题目：玉米籽粒花色苷含量主效QTL-AC6的精细定位及基因预测 本人提交的学位论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。论文中引用他人已经发表或出版过的研究成果，文中已加了特别标注。对本研究及学位论文撰写曾做出贡献的老师、朋
3、友、同仁在文中作了明确说明并表示衷心感谢。学位论文作者： 签字日期： 年 月 日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解西南大学有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权西南大学研究生院（筹）可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。（保密的学位论文在解密后适用本授权书，本论文：不保密，保密期限至 2016 年 7 月止） 。学位论文作者签名： 导师签名：签字日期： 年 月 日 签字日期： 年 月 日目录目 录摘 要IAbstractIII第1章 文献综
4、述11.1 QTL精细定位策略及研究进展11.1.1 QTL精细定位11.1.2 QTL 精细定位策略21.2作物QTL近等基因系的构建及其利用价值41.2.1近等基因系的定义41.2.2用于QTL近等基因系的构建方法51.2.3近等基因系的利用价值51.3作物QTL功能及其克隆策略研究进展71.3.1作物QTL克隆策略81.3.2作物QTL克隆及其功能研究进展91.4玉米花色苷的研究进展91.4.1花色苷的生理功能91.4.2花色苷的结构和代谢途径101.4.3控制花色苷合成的结构基因和调节基因11第2章 引言132.1本研究的意义和目的132.2技术路线15第3章 AP6近等基因系的构建及
5、其精细定位173.1 材料与方法173.1.1试验时间、地点173.1.2试验材料173.1.3试验方法173.1.4连锁图谱构建213.1.5背景恢复率的计算213.1.6QTL定位方法及效应分析213.1.7目标区段基因注释与预测213.1.8相关基因的克隆22第4章 结果与分析254.1 AC6近等基因系的构建254.2 AC6 BC4F3分离群体的表型鉴定264.3目标QTL区段精细连锁图谱构建274.4 AC6的遗传效应分析274.5 AC6区段标记开发284.6 AC6精细定位294.7 基因预测314.8克隆目的基因32第5章 讨论335.1 QTL标记辅助选择对近等基因系构建的
6、有效性335.2 近等基因系BC4F3分离群体与BC4F2及F2:3定位结果的比较335.3 AC6精细定位效果345.4基因预测及克隆34参考文献37附录45致谢47发表论文、参加课题及获奖情况一览表49i摘要玉米籽粒花色苷含量主效QTL-AC6的精细定位及基因预测研究生：王 旭专业：作物遗传育种指导老师：蔡一林 教授摘 要随着生活水平的提高以及饮食结构的调整，人们对玉米的营养品质要求越来越高。玉米籽粒中色素的成分和含量与玉米的营养品质密切相关，不同颜色的玉米所含的色素成分不同，其功能性品质作为重要的营养品质之一，对增进人体健康、防治疾病起着非常重要的作用，是发展天然保健食品的重要原材料，同
7、时也广泛应用于化妆品、医药等行业中。黑玉米富含花色苷，对人体具有多种生理生化功能。所以，黑玉米是研究花色苷的良好材料。认识花色苷的遗传规律，可以为玉米的功能性品质在天然保健食品、化妆品、医药等领域中的应用提供新的参考和借鉴，为玉米中花色苷相关基础研究及玉米花色苷的分子标记辅助育种提供参考。黑玉米材料SDM (super dark maize)是西南大学玉米研究所自主选育的一个特异玉米自交系，本研究使用SDM为共同父本，分别与黄玉米自交系Mo17和白玉米自交系木6杂交，构建两套相关分离群体，即MoS群体和MuS群体，对花色苷的遗传规律进行研究。前人已将控制花色苷含量的主效QTL-AC6定位在第6
8、染色体的分子标记S8-umc1014之间。本研究将延续前人研究结果，利用AC6的近等基因系的分离群体BF4C3进一步对花色苷含量的主效QTL-AC6进行定位，并利用该近等基因系上一世代的交换单株自交的后代群体对AC6进行精细定位。分析定位的区间附近的基因组序列，对该段区域上的基因进行注释。主要研究结果如下：1.BC4F3群体精细遗传图谱的构建选取目标QTL区域附近已有的SSR多态性标记以及开发新的多态性标记，分别用8对和7对SSR多态性标记对MuS-BC4F3群体和MoS-BC4F3群体构建精细的连锁图谱。在MuS-BC4F3群体的精细的遗传图谱中，每个分子标记之间的平均遗传距离是0.46 c
9、M，在MoS-BC4F3群体的精细的遗传图谱中，每个分子标记之间的平均遗传距离是1.41 cM。2.花色苷含量主效QTL-AC6的精细定位利用MuS-BC4F3和MoS-BC4F3两个近等基因系的分离群体将主效QTL-AC6分别限定于分子标记S8-umc1014和umc1014-mmc0523之间，两个区间紧密连接一起，具有共同分子标记umc1014。利用上一世代的交换单株自交后代BC4F3对AC6进行精细定位，在MuS群体和MoS群体中，分别筛选到10株交换单株。根据交换单株标记的基因型和表型，将AC6界定在分子标记ssr9-umc1014和S73-umc1014之间，且两个区间重合。其中s
10、sr9与umc1014的物理距离为255KB，S73与umc1014的物理距离为114KB。3.定位区间的基因注释和预测利用www.ncbi.nlm.nih.gov、 b2ghome等生物信息学网站对锁定区域进行分析，对目标序列上的基因进行注释。该片段上共有49个转座子，29个还原转座子，8个假设蛋白，31个基因。通过NCBI(http:/blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)公布的信息比对分析后发现在这定位区域内，pl transcription factor是一个血红素加氧酶基因，参与玉米的色素调节。从其他研究者已经分离的花色苷含量相关基因在染色体中的分布情况来
11、看，在第6染色体上也正好是这个基因，所以，pl transcription factor极有可能就是候选基因。但对该基因克隆过程中发现，使用多种扩增条件都无法将该基因克隆出来。分析其主要原因，可能是在突变材料SDM中， pl transcription factor这一区域插入了一段未知长度的DNA序列，导致在SDM中无法克隆出该基因。关键词：玉米；花色苷含量；QTL精细定位；基因预测。IAbstractFine mapping of the main effect QTL-AC6 and gene prediction for Anthocyanin content in kernel of
12、 maize.Candidate: Wang XuMajor: Crop Genetics and BreedingSupervisor: Professor Cai YilinAbstractWith the improvement of living standard and the adjustment of the diet, the nutritional quality of maize is increasingly high required. Composition and content of the pigment are closely related to the n
13、utritional quality of maize kernel. The pigment composition changes with the different colors of maize kernel. As one of the important nutritional quality, anthocyanin plays an important role in improving human health and preventing disease. Maize is not only an important raw material for the develo
14、pment of natural health food, but also is widely used in cosmetics, medicine and industries. Black maize is rich in anthocyanins, which possesses a variety of physiological and biochemical functions to the human body. Hence, black maize is a good material for anthocyanins study. The understanding of
15、 the genetic rule of anthocyanins provide a new reference for the application of the functional quality in natural health food, cosmetics, medicine and other fields. Meanwhile, it gives some reference for maize anthocyanins relative basic research and molecular marker assisted breeding.Black maize S
16、DM (super dark maize) is a specific maize inbred line created by maize research institute of southwest university. In this study, SDM was used as common male parent to create two populations MoS from the cross Mo17SDM and MuS from Mu6SDM for studying the genetic rule of anthocyanin. QTL-AC6, the mai
17、n effect QTL controlling of anthocyanin content, located in the common interval of S8-umc1014 on chromosome 6. To continue the previous research, BF4C3 was used for further positioning QTL-AC6. The progeny from one plant of the last generation of near isogenic line was used to fine mapping AC6. Then
18、, the genome sequences of the nearby positioning area were analysised and genes within this region were annotated. The main results were as follows:1. The construction of fine genetic map of BC4F3 populationBy selecting the existing SSR polymorphism markers and the new developed polymorphism markers
19、 nearby the target QTL regions, seven pairs and eight pairs of SSR polymorphism markers were used to constract fine linkage map for MuS-BC4F3 population and MoS-BC4F3 population, respectively. The average genetic distance between each molecular marker was 0.46 cM in the fine genetic map of MuS -BC4F
20、3 population and 1.41 cM. in MoS-BC4F3 population. 2. Fine mapping of the main effect QTL-AC6 of Anthocyanins contentTwo near isogenic line segregation populations of MuS-BC4F3 and MoS-BC4F3 were used to restrict the main effect QTL-AC6 in the interval of S8-umc1014 and umc1014-mmc0523 respectively,
21、 which were close to each other, sharing the common umc1014 molecular marker. Selfing generation BC4F3 of single plant of last generation was used to fine mapping AC6. In MuS population and MoS population, 10 single plants were screened respectively. According to the marker genotype and phenotype of
22、 the single plant, AC6 was defined in molecular marker ssr9-umc1014 and S73-umc1014, and the two regions overlapped. The physical distance between ssr9 and umc1014 was 255 KB, while the distance between S73 and umc1014 was 114 KB.3. Gene annotation and prediction of the positioning region www.ncbi.n
23、lm.nih.gov, b2ghome were used for analysis of locking region and the annotation of genes. A total of 49 transposons, 29 retrotransposons, 8 assumptions protein, 31 gene were found. Further information comparative analysis by using NCBI (http:/blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) reveals that within the
24、 positioning area, pl transcription factor was a heme oxygenase gene, participating in maize pigment regulation. From the results of other researchers who had separated related gene of anthocyanins content, pl was also located on chromosome 6. Therefore, pl transcription factor was most likely the c
25、andidate gene. The gene was not cloned with a variaty of amplification conditions in the process of gene cloning. The main reason maybe that an unkown length DNA sequence was inserted into pl transcription factor in mutant materials SDM, resulting that the gene was not cloned in SDM.Key wards：maize；
26、anthocyanin content；QTL fine mapping；gene prediction.III第1章 文献综述第1章 文献综述1.1 QTL精细定位策略及研究进展1.1.1 QTL精细定位一般情况下，QTL的初步定位只能将其定位到染色体的一个区段范围之内，标记区间的大小通常为10-30cM（Kearsey and Farquhar 1998），在这么大的区间内很难确定QTL的具体位置，也很难确定该区间内是否只包含一个QTL，或者是几个QTL共同作用，从而无法将控制某性状的基因确定出来。因此，发展新的定位方法对QTL进行精细定位很有必要。就目前来说，对QTL的精细定位主要可以从
27、以下三个方向着手：第一，统计方法的合理利用和新的统计方法的开发可以挖掘更多潜在的信息。首先是基于连锁不平衡而提出的关联分析（Bodmer 1986），该方法不用构建连锁群而且解析度较高，它的精度取决于群体的连锁不平衡结构，在人体复杂疾病的QTL定位中有着举足轻重的地位，但是其在作物中的应用较少。为了克服关联分析假阳性较高的缺点，Pritchard结合群体结构估计与关联分析提出了新方法（Pritchard and Rosenberg 1999），Yu等人也提出了混合模型方法（Yu et al. 2005）。将连锁不平衡与连锁信息结合，精度更高而且可以直接利用QTL区间的候选基因进行基因互补检验（
28、Wu and Zeng 2001）。第二，可以通过增加重组机会提高QTL定位的精度。这包括高代回交系（Davasi and Soller 1995； Xiong and Guo 1997）、选择表型、轮回选择与回交系（Wright 1952； Hill 1998； Luo et al. 2002；Luo and Ma 2004）、高代回交系（Tanksley and Nelson, 1996）和育成品种群体（Zhang et al. 2005）等。其中高代回交系为没有进行选择的轮回选择与回交系，在作物精细定位中最为常用。第三，利用次级分离群体是QTL精细定位最为重要的手段，初级作图群体定位结果
29、偏差大的主要原因是群体内个体间遗传背景不同，次级群体消除了遗传背景和QTL间的互作感染，使得QTL作图更为准确。（根据与初级定位群体的关系，次级群体可以分为两类，一类是由初级定位群体衍生而来，比如近等基因系（Near Isogenic Lines，NILs），QTL等基因系（QTL Isogenic Recombinants， QIRs）；另一类是与初级定位没有关系的代换系群体，如单片段代换系(Single Segment Substitution Lines, SSSLs)，染色体片段代换系 (Chromosome Segment Substitute Lines， CSSLs)，不同的次级
30、群体的构建过程和特点各不相同 (蒋洪蔚等，2008)。如表1：表1 不同次级群体的构建过程及特点Table 1 The establishment and characterization of diffenrent secondary population群体构建过程及特点优点缺点NILs以带有目标性状的供体亲本与拟导入这一目标性状的受体亲本进行杂交，再用轮回亲本多次回交，回交至一定世代后自交分离，即可获得遗传背景与轮回亲本相近却带有目标性状的品系。遗传背景一致，精细定位准确，可估计基因间上位性效应。一次杂交和多次回交，构建时间长，工作量大。QIRs首先利用小群体采用初级定位方法完成QTL定
31、位，然后利用大群体进行精细定位。大群体的每个个体在QTL位点均发生了一次重组，但在其它区域均一致。群体容易构建，而且可精细定位到1cM的范围内。群体大使得分子标记检测量大，且存在背景干扰，不能检测到上位性效应。SSSLs通过多代回交，获得只存在供体亲本的一个代换片段的差异，基因组其它部分与受体亲本完全相同。遗传背景一致，精细定位效果好，并检测上位性效应。群体构建时间长，工作较繁琐。CSSLs采用受体亲本对F1进行连续回交，然后通过对供体亲本的染色体片段进行分子标记选择得到的高代回交群体。遗传背景一致，精细定位准确性较高，可检测上位性效应。构建时间较长，工作量大。1.1.2 QTL 精细定位策略
32、大量研究表明，影响QTL初级定位精确度和灵敏度的最重要因素是群体的大小。但是，在实际研究中，由于受到费用和工作量等限制，所用的初级定位群体不可能很大。因此，无论怎样改进统计分析的方法，也无法使得初级定位的精度或分辨率达到很高，估计出来的QTL的置信区间一般都在10cM 以上（Zeng 1994；Alpert and Tanksley 1996），也不能确定检测到的QTL中到底是只包含一个效应比较大的基因，还是包含数个效应比较小的基因（Yano and Sasaki 1997）。也就是说，初级定位的精度还不能够将数量性状确切地划分成单个的孟德尔因子。因此，为了使数量性状的遗传基础被更精确地了解，
33、在初级定位的基础之上，还必须对QTL 进行高分辨率的精细定位，也就是在目标QTL 区域上建立更高的分辨率的分子标记图谱，并分析目标QTL 与标记之间的连锁关系。1.1.2.1 单个QTL的精细定位对某个QTL进行精细定位，必须使用含有目标QTL染色体片段的代换系或近等基因系，使得除了目标QTL 所在的染色体片段之外，基因组的其他部分全都和受体亲本相同，这样可以最大限度地消除由遗传背景差异带来的干扰，从统计方面和遗传方面为QTL的精确定位提供了保证。对于已经初步定位了的主效 QTL，可以采取回交结合分子标记辅助选择(MAS，marker-assisted selection)的方法，对目标QTL
34、区域实行前景选择，对其它区域实背景选择，快速构建染色体片段代换系或者近等基因系，用于精细定位。Yamamoto应用水稻基因组染色体片段替代系，成功地对控制水稻抽穗期的QTL进行了精细定位，分辨率超过0.5cM（ Yamamoto et al. 1996）。不过，这种方法特别的费工费时，而且只能用在效应比较大的QTL 的精细定位。能否在目标QTL 区域附近找到分子标记，是进行精细定位的另一个限制因素（Tanksley 1993）。为了寻找到分子标记，往往需要做大量的筛选。例如，在对控制番茄果重的QTL(fw2.2)的精细定位中，用了600个引物才筛选到2 个 RAPD标记 (Fridman et
35、 al. 2000)。1.1.2.2 全基因组QTL的精细定位为系统地开展QTL的精细定位，往往需要构建立一套覆盖全基因组的相互重叠的 染色体片段代换系，也就是在一个受体亲本 的遗传背景中构建供体亲本的“基因文库”。代换系重叠群的建立同样是采用多代回交的方式，但是，需要借助完整的分子标记图谱以及分子标记辅助选择技术。十字花科物种和番茄中已经建立了此类代换系重叠群。目标片段代换系的分析方法和单个的 QTL精细定位相同，但是工作量很大（方宣钧，2001）。使用代换系重叠群对 QTL进行精细定位之前，必须多年多点对代换系进行重复试验，以确定目标代换系的代换片段上带有控制目标性状的QTL。各个目标代换
36、系可以分别与受体亲本进行回交，也可以在不同的目标代换系间进行杂交，后者的优点主要有两个方面，一是进一步缩小QTL 所在位置的区间，二是可以分析不同的QTL 之间的相互作用，因为有一些QTL 单独存在时没有效应，需要与其他QTL 共同存在或共同作用时，才能表现出上位性效应。1.1.3 作物QTL精细定位研究进展近年来，在QTL的精细定位方面已经有大量的报道。Yu（Yu et al. 1991）在籼稻近等 基因系C101A501 中定位到了一个抗稻瘟病的显性主效基因Pi-2（t），该基因是位于第6 染色体的短臂上。随后，吴金红等（吴金红，2002）将Pi-2（t）精细定位在标记RG64和AP22
37、之间，遗传距离分别为 1.2 cM和0.9 cM。Dorweiler（Dorweiler et al. 1993）使用近等基因系将控制玉米和大刍草主穗差异的基因座 TGA1，精确定位成为孟德尔基因。Yamamoto（Yamamoto et al. 1998）用连续重复回交选育的方法获得了水稻抽穗期的近等基因系，将存在于第6 染色体上的控制抽穗期的主效QTL（Hd1）定位于相距0.6 cM的分子标记R1697和P130之间。Tanksley使用番茄近等基因系对控制果实重量的主效QTL fw2.2进行了精细定位，构建了物理图谱（Tanksley et al.，1996）。邢永忠（邢永忠等，2001
38、）从重组自交系中选择出遗传背景高度一致的自交系配组，建立近等基因系，使位于第7染色体上的同一区间内控制水稻抽穗期和株高的主效QTL 同时以单个的孟德尔遗传因子表现。精细定位这些QTL之后，可以凭借已经完成测序的水稻全基因组数据库，研究与之相对应的基因组区域，以获得包含这些QTL 的序列，便于深入研究。Li等（Li et al. 2006）使用康乃尔大学选育的热带粳稻品种 Jefferson 作为轮回亲本，和普通野生水稻材料IRGC-105491 配置组合，利用回交群体，把控制粒重的基因gw3.1 精细定位于第3号染色体的标记JL123h和JL109之间，区间大小为93.8 KB。gw3.1具有
39、增加粒重的效果。该研究还表明，利用回交能够排除其他微效基因的影响，增大主效QTL的贡献率，提高定位的准确度。Xiao等(Xiao et al. 2006)利用韩国的优良栽培品种 (Hwaseongbyeo)与野生稻IRGC-105491杂交，构建回交群体BC3F4，将gw8.1定位于第8号染色体的分子标记RM23201CNR151和RM30000CNR99的306.4 KB范围之间，该粒重基因和水稻谷粒品质性状以及株高没有相关性。Zheng（Zheng et al. 2008）使用高油自交系ASKC28IB1 作为供体亲本，和低油自交系PH09B 构建了BC2群体，定位到位于第6染色体的一个控
40、制油分的QTL(qHO6)。之后，又利用分子标记辅助选择，建立了一系列含有不同的ASKC28IB1 重叠片段长度的近等基因系，将qHO6定位到 SSR标记UMC1145和SNP标记 MZA5002之间，区间大小为4.2 cM。随后利用SNP标记对4000株BC5F1群体进行了分析，发现该QTL位于DGAT基因的3端，而3端的唯一差异只是苯丙氨酸的插入。最后证实插入的苯丙氨酸对高油玉米油份的含量和油酸含量的提高起到了重要的作用。1.2作物QTL近等基因系的构建及其利用价值1.2.1近等基因系的定义近等基因系（near-isogenic lines，NIL）是指一个遗传背景相同，除了某一两个基因外
41、，其他基因都相同的两个遗传材料，是经过一系列、长期的回交过程所产生的株系（Young et al，1988）。在育种实践工作中，将带有目标基因的供体亲本与作为受体的轮回亲本进行杂交，并多次回交，每代只选择具有目标基因的个体与轮回亲本进行回交，从而获得的除目标基因片段外其余遗传背景与轮回亲本一致的品系（Muclmore et al.1988）。1.2.2用于QTL近等基因系的构建方法近等基因系的构建是通过一系列重复的回交过程。当某一优良品种缺少一、两个优良性状时，通常是采用连续回交的方法，将它所缺少的控制优良性状的基因，从外缘种质中转移到优良品种里。在回交过程中，需要应用分子标记辅助选择（MAS
42、，marker-assisted selection）的方式对目标基因进行前景选择，同时对其进行背景选择，使其后代连续不断地朝着轮回亲本的遗传背景方向纯合。培育植物近等基因系主要有以下选育方法（张洁夫，2002）：第一，多次回交选育法。就是将材料与轮回亲本连续回交，通常需回交6代以上。即替换掉控制目标性状的等位基因，使育成材料除目标性状与轮回亲本存在差异外，其遗传背景逐步接近轮回亲本或与轮回亲本一致，从而两者成为近等基因系。该方法是培育近等基因系中最常用的方法，如农作物抗病、抗逆性近等基因系的构建。第二，从突变体中分离获得。通常情况下，单个位点的突变并不会引起其他位点的变异。即通过诱变获得的突
43、变体与原品种（系）相比，除突变位点存在差异之外，其他位点基本一致，从而可以从中选育出近等基因系。第三，结合分子标记检测技术连续回交选育法。一般先进行若干代回交试验，在建立多次回交群体的基础上，对目标基因进行前景选择，同时进行背景选择。选择与目标性状紧密连锁的分子标记进行检测，选育近等基因系。随着分子标记技术的不断进步和完善，这一方法正在成为近等基因系选育的有效方法之一。第四，杂交高世代分离群体材料中分离选育。由于在杂交高世代群体中，大多数控制性状的基因趋于纯合，仅少数基因处于杂合状态，在此基础上从中选育具有目标性状差异的品系构建近等基因系。1.2.3近等基因系的利用价值目前，用于作物数量性状基
44、因座位研究的作图群体多种多样，根据作图群体中个体间遗传背景差异程度和对QTL检测的分辨率来看可分为初级群体和高级群体。初级群体是指由两个遗传差异相对较大的亲本相互杂交而建立的分离群体，这类分离群体的特点是全基因组均发生分离，其中主要包括F2、F3、BC1、RILs（recombinantinbred lines）、DH（double hap-1oid）等。高级作图群体主要是指近等基因系类群体，其特征是在群体内，个体间的遗传背景相似，仅带有少数供体片断。例如导入系或渗入系（Introgression Lines，ILs）和替换系（Substitution lines，SLs），它们都是通过连续重
45、复的回交和分子标记辅助选择来完成的。近等基因系与受体亲本的差别主要在目标QTL所在的染色体区域，所以，它们之间的任何表型性状的差异都来源于这个供体片段。从近等基因系发展而来的分离群体，只在与亲本有差异的染色体区域发生分离，从而消除背景的干扰及主效QTL对微效QTL的掩盖作用。因此，利用近等基因系发展而来的分 离群体是非常适合进行QTL精细定位、QTL互作、品种改良等的良好材料。1.2.3.1利用近等基因系对 QTL精细定位Takeuchi等（Takeuchi et al. 2003）用一个只含有单个供体染色体片段 的近等基因系群体（96株），对水稻的两个紧密连锁的QTL：种子休眠性（Seed
46、dormancy） QTL-Sdr1和抽穗天数QTL-Hd8进行 精细定位，将Sdr1定位在RFLP标记 R10942和C2045之间，与C1488共分离；将Hd8定位于RFLP标记C1534S 和R10942之间。Hittalmani（Hittalmani et a1. 2002）和Berruyer （Berruyer et al. 2003）用近等基因系分离群体对水稻的四个抗稻瘟病基因：Pi1、Piz-5、 Pita和Pi33进行了精细定位。Murai（Murai et al. 2001）用近等基因系分离群体把水稻抗褐飞虱抗性基因bph2定位在1.0 cM的范围之内，距离AFLP标记KAM
47、3 的遗传距离为0.2 cM，距标记KAM5 的遗传距离为0.8 cM，与标记KAM4共分离。1.2.3.2利用近等基因系研究QTL之间的互作Yamamoto（Yamamoto et a1. 1998）利用分别带有水稻抽穗天数的QTL-Hd1、Hd2、Hd3三个近等基因系相互杂交，研究了三个QTL间的互作，结果表明，Hd1和Hd2、Hd2和Hd3、Hd1和Hd3之间都存在上位性互作。进一步研究表明，在田间条件下，控制水稻的抽穗天数的QTL-Hd2对另一个控制抽穗天数的QTL-Hd6也有上位性互作效应，即Hd2的存在掩盖Hd6对延长抽穗天数的特性（Yamamotoet a1. 2000）。1.2.3.3利用近等基因系对QTL 克隆Yano（Yano et al.2000）利用含有1505个单株的近等基因系群体对水稻的光敏感 QTL-Hd1进行了图位克隆（Map-based cloning），将Hd1定位在12 KB的范围内。进一步的分析表明，Hd1基因与控制拟南芥开花期