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1、第二章工具酶第三章载体第二章工具酶第三章载体第1 页，本讲稿共108 页第二章第二章 用于核酸操作的工具酶用于核酸操作的工具酶限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶DNADNA连接酶连接酶DNADNA聚合酶聚合酶核酸酶核酸酶核酸修饰酶核酸修饰酶第2 页，本讲稿共108 页（一）限制性核酸内切酶（一）限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶的发现及其生物功能限制性核酸内切酶的发现及其生物功能识别双链识别双链DNADNA分子中的特定序列，并切割分子中的特定序列，并切割DNADNA双链双链主要存在于原核细菌中，帮助细菌限制外来主要存在于原核细菌中，帮助细菌限制外来DNADNA的入侵的入侵细菌的限制与修饰作用细菌的
2、限制与修饰作用hsd hsd RR：编码限制性核酸内切酶编码限制性核酸内切酶hsd hsd MM：编码限制性甲基化酶编码限制性甲基化酶hsd hsd SS：编码限制性酶和甲基化酶的协同表达编码限制性酶和甲基化酶的协同表达19681968年，年，SmithSmith等人首先从等人首先从流感嗜血杆菌流感嗜血杆菌dd株中分离出株中分离出 Hind IIHind II和和Hind IIIHind III 第3 页，本讲稿共108 页限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶的类型限制性核酸内切酶的类型主要特性主要特性 I I 型型 II II 型型 III III 型型限制修饰限制修饰多功能多功
3、能单功能单功能双功能双功能蛋白结构蛋白结构异源三聚体异源三聚体同源二聚体同源二聚体异源二聚体异源二聚体辅助因子辅助因子ATP MgATP Mg2+2+SAM SAMATP MgATP Mg2+2+SAM SAMMgMg2+2+识别序列识别序列TGANTGAN88TGCTTGCT 旋转对称序列旋转对称序列GAGCCGAGCCAACNAACN66GTGCGTGCCAGCAGCAGCAG切割位点切割位点距识别序列距识别序列11kbkb处处识别序列内或附近识别序列内或附近距识别序列下游距识别序列下游随机性切割随机性切割 特异性切割特异性切割24-2624-26bpbp处处第4 页，本讲稿共108 页限
4、制性核酸内切酶限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶的命名限制性核酸内切酶的命名属名属名 种名种名 株名株名H i n d IIIH i n d III H i nH i n d III d IIIHHaemophilus aemophilus ininfluenzaefluenzae d d 嗜血流感杆菌嗜血流感杆菌dd株株同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶第5 页，本讲稿共108 页限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶II II 型限制性核酸内切酶的基本特性型限制性核酸内切酶的基本特性识别双链识别双链DNADNA分子中分子中4-84-8对碱基的特定序
5、列对碱基的特定序列大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧识别切割序列呈典型的旋转对称型识别切割序列呈典型的旋转对称型回文结构回文结构5 5 G C T G C T G A A T T CG A A T T C G A G 3 G A G 33 3 C G A C G A C T T A A GC T T A A G C T C 5 C T C 5EcoR IEcoR I的识别序列的识别序列EcoR IEcoR I的切割位点的切割位点第6 页，本讲稿共108 页EcoRIEcoRI等产生的等产生的55粘性末端粘性末端5 5 GG-CC-TT-GG-AA-AA
6、-TT-TT-CC-GG-AA-G 3G 33 3 CC-GG-AA-CC-TT-TT-AA-AA-GG-CC-TT-C 5C 5EcoRI 37 EcoRI 37 5 5 GG-CC-TT-GG-OHOH PP-AA-AA-TT-TT-CC-GG-AA-G 3G 33 3 CC-GG-AA-CC-TT-TT-AA-AA-PP OHOH-GG-CC-TT-C 5 C 5 退火退火 4-7 4-7 5 5 GG-CC-TT-GG AA-AA-TT-TT-CC-GG-AA-G 3G 33 3 CC-GG-AA-CC-TT-TT-AA-AA GG-CC-TT-C 5C 5OHOHPPOHOHPP第7
7、 页，本讲稿共108 页PstIPstI等产生的等产生的33粘性末端粘性末端5 5 GG-CC-TT-CC-TT-GG-CC-AA-GG-GG-AA-G 3G 33 3 CC-GG-AA-GG-AA-CC-GG-TT-CC-CC-TT-C 5C 5PstI 37 PstI 37 5 5 GG-CC-TT-CC-TT-GG-CC-AA-OHOH PP-GG-GG-AA-G 3G 33 3 CC-GG-AA-GG-PP OHOH-AA-CC-GG-TT-CC-CC-TT-C 5 C 5 退火退火 4-7 4-7 5 5 GG-CC-TT-CC-TT-GG-CC-AA GG-GG-AA-G 3G 3
8、3 3 CC-GG-AA-GG AA-CC-GG-TT-CC-CC-TT-C 5C 5OHOH PPOHOHPP第8 页，本讲稿共108 页PvuIIPvuII等产生的平头末端等产生的平头末端5 5 GG-CC-TT-CC-AA-GG-CC-TT-GG-GG-AA-G 3G 33 3 CC-GG-AA-GG-TT-CC-GG-AA-CC-CC-TT-C 5C 5PvuII 37 PvuII 37 5 5 GG-CC-TT-CC-AA-GG-OHOH PP-CC-TT-GG-GG-AA-G 3G 33 3 CC-GG-AA-GG-TT-CC-PP OHOH-GG-AA-CC-CC-TT-C 5
9、C 5 第9 页，本讲稿共108 页限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶II II 型限制性核酸内切酶酶解反应的操作型限制性核酸内切酶酶解反应的操作大部分大部分II II 型核酸内切酶需要相似的反应条件：型核酸内切酶需要相似的反应条件：Tris-HClTris-HCl50 mM pH 7.550 mM pH 7.5MgClMgCl2210 mM10 mMNaClNaCl 0-150 mM0-150 mMDTTDTT1 mM1 mM0-50 mM 0-50 mM 低盐酶低盐酶100 mM 100 mM 中盐酶中盐酶150 mM 150 mM 高盐酶高盐酶VolumeVolume20-100 20-1
10、00 mmllT TT T37 37 1-1.5 1-1.5 hrhr1 1 U U 核酸内切酶的酶活性：在最佳反应条件下反应核酸内切酶的酶活性：在最佳反应条件下反应 1 1 小时，完全小时，完全水解水解 1 1 mmg g 标准标准DNADNA所需的酶量所需的酶量第10 页，本讲稿共108 页限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶II II 型限制性核酸内切酶酶解反应的操作型限制性核酸内切酶酶解反应的操作II II 型核酸内切酶的多酶联合酶解：型核酸内切酶的多酶联合酶解：对盐浓度要求相同的酶，原则上可以同时酶切，但应注意：对盐浓度要求相同的酶，原则上可以同时酶切，但应注意：5 5 GCTACATG
11、CTACATGGATCCCGGGGGATCCCGGGTTCGCAT3TTCGCAT33 3 CGATGTACGATGTACCTAGGGCCCCCTAGGGCCCAAGCGTA5AAGCGTA5BamHI SmaIBamHI SmaI5 5 GCTACATGCTACATG GATCCCGGGG GATCCCGGGTTCGCAT3 TTCGCAT3 3 3 CGATGTACGATGTACCTAG GGCCCCCTAG GGCCCAAGCGTA5AAGCGTA55 5 GCTACATGCTACATGGATCCC GGGGGATCCC GGGTTCGCAT3TTCGCAT33 3 CGATGTACGA
12、TGTACCTAGGG CCCCCTAGGG CCCAAGCGTA5AAGCGTA5第11 页，本讲稿共108 页限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶II II 型限制性核酸内切酶酶解反应的操作型限制性核酸内切酶酶解反应的操作II II 型核酸内切酶的多酶联合酶解：型核酸内切酶的多酶联合酶解：对盐浓度要求不同的酶，可采取下列方法：对盐浓度要求不同的酶，可采取下列方法：使用较贵的酶的盐浓度，加大便宜酶的用量，同时酶解使用较贵的酶的盐浓度，加大便宜酶的用量，同时酶解低盐酶先切，然后补加盐，高盐酶再切低盐酶先切，然后补加盐，高盐酶再切一种酶先切，然后更换缓冲液，另一种酶再切一种酶先切，然后更换缓冲液，另
13、一种酶再切0.10.1倍体积的倍体积的 5 5 M NaAc pH 5.4M NaAc pH 5.42.52.5倍体积的冰冷乙醇倍体积的冰冷乙醇冰浴冰浴 5 5 分钟、高速冷冻离心分钟、高速冷冻离心1010分钟、干燥分钟、干燥第12 页，本讲稿共108 页限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶影响限制性核酸内切酶活性的因素影响限制性核酸内切酶活性的因素DNADNA样品的纯度：样品的纯度：蛋白质、苯酚、氯仿、乙醇、蛋白质、苯酚、氯仿、乙醇、EDTAEDTA、SDSSDS、NaClNaCl等等加大酶的用量，加大酶的用量，1 1 mmg DNA g DNA 用用 10 10U U 酶酶加大反应总体积加大反
14、应总体积延长反应时间延长反应时间第13 页，本讲稿共108 页限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶影响限制性核酸内切酶活性的因素影响限制性核酸内切酶活性的因素DNADNA样品的甲基化程度：样品的甲基化程度：大肠杆菌中的大肠杆菌中的damdam甲基化酶在甲基化酶在55GATC3GATC3序列中的腺序列中的腺嘌呤嘌呤NN66位位 引入甲基，受其影响的酶有引入甲基，受其影响的酶有Bcl IBcl I、MboIMboI等，但等，但BamH IBamH I、Bgl IIBgl II、Sau3A ISau3A I不受影响不受影响 大肠杆菌中的大肠杆菌中的dcmdcm甲基化酶在甲基化酶在55CCAGG3CCAG
15、G3或或55CCTGG3CCTGG3序列序列中的中的胞嘧啶胞嘧啶CC55位位上引入甲基，上引入甲基，受其影响的酶有受其影响的酶有EcoR IIEcoR II等等哺乳动物中的甲基化酶在哺乳动物中的甲基化酶在55CG3CG3序列中的序列中的CC55位位上引入甲基上引入甲基第14 页，本讲稿共108 页限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶影响限制性核酸内切酶活性的因素影响限制性核酸内切酶活性的因素核酸内切酶的缓冲液性质：核酸内切酶的缓冲液性质：高浓度的酶、高浓度的甘油、低离子强度、极端高浓度的酶、高浓度的甘油、低离子强度、极端pHpH值值等，等，会使一些核酸内切酶的识别和切割序列发生低特异性，即会使一些
16、核酸内切酶的识别和切割序列发生低特异性，即所谓的所谓的Star activityStar activity现象现象 EcoR IEcoR I在正常条件下识别并切割在正常条件下识别并切割55GAATTC3GAATTC3序列，但在甘序列，但在甘油浓度超过油浓度超过5%5%（v/vv/v）时，也可切割时，也可切割55PuPuATPyPy3PuPuATPyPy3或者或者55AATT3AATT3第15 页，本讲稿共108 页（二）（二）DNADNA连接酶连接酶DNADNA连接酶的基本性质连接酶的基本性质修复双链修复双链DNADNA上缺口处的磷酸二酯键上缺口处的磷酸二酯键DNADNA连接酶连接酶5 5 G
17、G-CC-TT-CC-TT-GG-CC-AA GG-GG-AA-G 3G 33 3 CC-GG-AA-GG AA-CC-GG-TT-CC-CC-TT-C 5C 5OHOHPPOHOHPP5 5 GG-CC-TT-CC-TT-GG-CC-AA-GG-GG-AA-G 3G 33 3 CC-GG-AA-GG-AA-CC-GG-TT-CC-CC-TT-C 5C 5nicknicknicknick第16 页，本讲稿共108 页DNADNA连接酶连接酶DNADNA连接酶的基本性质连接酶的基本性质修复与修复与RNARNA链结合的链结合的DNADNA链上缺口处的磷酸二酯键链上缺口处的磷酸二酯键T4-DNAT4
18、-DNA连接酶连接酶5 5 GG-CC-UU-CC-UU-GG-CC-CC-GG-GG-AA-GG 3 33 3 CC-GG-AA-GG AA-CC-GG-GG-CC-CC-TT-C 5C 5OHOHPPnicknick5 5 GG-CC-UU-CC-UU-GG-CC-CC-GG-GG-AA-GG 3 33 3 CC-GG-AA-GG-AA-CC-GG-GG-CC-CC-TT-C 5C 5第17 页，本讲稿共108 页DNADNA连接酶连接酶DNADNA连接酶的基本性质连接酶的基本性质连接多个平头双链连接多个平头双链DNADNA分子：分子：5 5 GG-CC-TT-CC-AA-GG-CC-TT
19、-GG-GG-AA-GG 333 3 CC-GG-AA-GG-TT-CC-GG-AA-CC-CC-TT-CC 5 55 5 GG-CC-TT-CC-AA-GG-OHOH PP-CC-TT-GG-GG-AA-GG 333 3 CC-GG-AA-GG-TT-CC-PP OHOH-GG-AA-CC-CC-TT-CC 5 5 T4-DNAT4-DNA连接酶连接酶第18 页，本讲稿共108 页DNADNA连接酶连接酶DNADNA连接酶的反应条件连接酶的反应条件Tris-HClTris-HCl50-100 mM pH 7.550-100 mM pH 7.5MgClMgCl22 10 mM10 mMATPA
20、TP0.5-1 mM0.5-1 mMDTTDTT5 mM5 mMVolumeVolume10-20 10-20 mmllT TT T4-15 4-15 4-16 4-16 hrhr1 1 U DNAU DNA连接酶的酶活性：在最佳反应条件下连接酶的酶活性：在最佳反应条件下15 15 反应反应 1 1 小时，小时，完全连接完全连接 1 1 mmg g ll-DNA-DNA（Hind IIIHind III片段）所需的酶量片段）所需的酶量第19 页，本讲稿共108 页DNADNA连接酶连接酶平头双链平头双链DNADNA片段的连接操作片段的连接操作从分子动力学的角度讲，由限制性核酸内切酶创造的粘性末
21、端的连接属于分子从分子动力学的角度讲，由限制性核酸内切酶创造的粘性末端的连接属于分子内部的连接，而平头末端的连接则属于分子间的连接，因此后者反应速度要慢内部的连接，而平头末端的连接则属于分子间的连接，因此后者反应速度要慢得多得多提高平头末端连接效率的方法包括：提高平头末端连接效率的方法包括：加大连接酶用量（加大连接酶用量（1010倍大于粘性末端的连接）倍大于粘性末端的连接）加大平头末端底物的浓度，增加分子间碰撞机会加大平头末端底物的浓度，增加分子间碰撞机会 加入加入10%10%PEG8000PEG8000，促进大分子之间的有效作用促进大分子之间的有效作用 加入单价阳离子（加入单价阳离子（NaC
22、lNaCl），），最终浓度最终浓度150-200 150-200 mMmM第20 页，本讲稿共108 页（三）（三）DNADNA聚合酶聚合酶大肠杆菌大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶 II（DNA pol I DNA pol I）5353的的DNADNA聚合酶活性聚合酶活性5353的核酸外切酶活性的核酸外切酶活性3535的核酸外切酶活性的核酸外切酶活性大肠杆菌大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶 II的基本性质：的基本性质：3 3 GG-CC-TT-CC-AA-GG-CC-TT-GG-GG-AA-GG-A 5A 55 5 CC-GG-AA-GG-TT-OHOH5 5 ppp dN Mgppp dN
23、Mg2+2+3 3 GG-CC-TT-CC-AA-GG-CC-TT-GG-GG-AA-GG-A 5A 55 5 CC-GG-AA-GG-TT-CC-GG-AA-CC-CC-OHOHDNA pol IDNA pol I第21 页，本讲稿共108 页DNADNA聚合酶聚合酶大肠杆菌大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶 II（DNA pol I DNA pol I）缺口前移标记法缺口前移标记法大肠杆菌大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶 I I 的基本用途：的基本用途：5 5 GG-CC-TT-CC-AA-GG-CC-TT-GG-GG-AA-GG-T 3T 33 3 CC-GG-AA-GG-TT-CC-GG
24、-AA-CC-CC-TT-CC-A A 5 5 MgMg2+2+5 5 dNTP dNTP 5 5 pppppp dA dA（aa-3232P-dATPP-dATP）5 5 GG-CC-TT-C AC A-GG-CC-TT-GG-GG-AA-GG-T 3T 33 3 CC-GG-AA-GG-TT-CC-GG-AA-CC-CC-TT-CC-A A 5 5 5 5 GG-CC-TT-CC-A-GA-G-CC-TT-GG-GG-AA-GG-T 3T 33 3 CC-GG-AA-GG-TT-CC-GG-AA-CC-CC-TT-CC-A A 5 5 Nick translationNick transl
25、ation制备制备3232PP标记的探针标记的探针DNase IDNase IDNA pol IDNA pol I第22 页，本讲稿共108 页DNADNA聚合酶聚合酶大肠杆菌大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶 I I 大片段（大片段（Klenow Klenow）KlenowKlenow酶的基本性质：酶的基本性质：大肠杆菌大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶II经枯草杆菌蛋白酶处理，获得经枯草杆菌蛋白酶处理，获得NN端端三分之二的大肽段，即为三分之二的大肽段，即为KlenowKlenow酶酶KlenowKlenow酶仍拥有酶仍拥有5353的的DNADNA聚合酶活性聚合酶活性和和3535的核的核核酸外
26、切酶活性核酸外切酶活性，但失去了，但失去了5353的核酸外切酶活性的核酸外切酶活性第23 页，本讲稿共108 页DNADNA聚合酶聚合酶大肠杆菌大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶 I I 大片段（大片段（Klenow Klenow）KlenowKlenow酶的基本用途：酶的基本用途：补平由核酸内切酶产生的补平由核酸内切酶产生的55粘性末端粘性末端DNADNA片段的同位素末端标记片段的同位素末端标记cDNAcDNA第二链的合成第二链的合成双脱氧末端终止法测定双脱氧末端终止法测定DNADNA序列序列第24 页，本讲稿共108 页DNADNA聚合酶聚合酶大肠杆菌大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶 I I
27、 大片段（大片段（Klenow Klenow）KlenowKlenow酶的基本用途：酶的基本用途：补平由核酸内切酶产生的补平由核酸内切酶产生的55粘性末端粘性末端5 5 GG-CC-TT-GG-OHOH PP-AA-AA-TT-TT-CC-GG-AA-G 3G 33 3 CC-GG-AA-CC-TT-TT-AA-AA-PP OHOH-GG-CC-TT-C 5 C 5 KlenowKlenowdATP dTTPdATP dTTP5 5 GG-CC-TT-GG-AA-AA-TT-TT-OHOH PP-AA-AA-TT-TT-CC-GG-AA-G 3G 33 3 CC-GG-AA-CC-TT-TT-
28、AA-AA-PP OH-OH-TT-TT-AA-AA-GG-CC-TT-C 5 C 5 第25 页，本讲稿共108 页DNADNA聚合酶聚合酶大肠杆菌大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶 I I 大片段（大片段（Klenow Klenow）KlenowKlenow酶的基本用途：酶的基本用途：DNADNA片段的同位素末端标记片段的同位素末端标记5 5 GG-CC-TT-GG-OHOH PP-AA-AA-TT-TT-CC-GG-AA-G 3G 33 3 CC-GG-AA-CC-TT-TT-AA-AA-PP OHOH-GG-CC-TT-C 5 C 5 KlenowKlenowaa-3232P-ppP-p
29、pppdA dTTPdA dTTP5 5 GG-CC-TT-GG-AA-AA-TT-TT-OHOH PP-AA-AA-TT-TT-CC-GG-AA-G 3G 33 3 CC-GG-AA-CC-TT-TT-AA-AA-PP OH-OH-TT-TT-AA-AA-GG-CC-TT-C 5 C 5 第26 页，本讲稿共108 页DNADNA聚合酶聚合酶T4-DNAT4-DNA聚合酶聚合酶T4-DNAT4-DNA酶的基本特性：酶的基本特性：在无在无dNTPdNTP时，可以从任何时，可以从任何3-3-OHOH端外切端外切在只有一种在只有一种dNTPdNTP时，外切至互补核苷酸暴露时停止时，外切至互补核苷酸
30、暴露时停止在四种在四种dNTPdNTP均存在时，聚合活性占主导地位均存在时，聚合活性占主导地位5353的的DNADNA聚合酶活性和聚合酶活性和3535的核酸外切酶活性的核酸外切酶活性第27 页，本讲稿共108 页DNADNA聚合酶聚合酶T4-DNAT4-DNA聚合酶聚合酶T4-DNAT4-DNA聚合酶的基本用途：聚合酶的基本用途：切平由核酸内切酶产生的切平由核酸内切酶产生的33粘性末端粘性末端5 5 GG-CC-TT-CC-TT-GG-CC-AA-OHOH PP-GG-GG-AA-G 3G 33 3 CC-GG-AA-GG-PP HOHO-AA-CC-GG-TT-CC-CC-TT-C 5 C
31、5 T4-DNAT4-DNA聚合酶聚合酶5 5 GG-CC-TT-CC-OHOH PP-GG-GG-AA-G 3G 33 3 CC-GG-AA-GG-PP HOHO-CC-CC-TT-C 5C 5注意：该酶也能降解双链注意：该酶也能降解双链DNADNA，只是其活性比单链降解活性低很多只是其活性比单链降解活性低很多第28 页，本讲稿共108 页DNADNA聚合酶聚合酶T4-DNAT4-DNA聚合酶聚合酶T4-DNAT4-DNA聚合酶的基本用途：聚合酶的基本用途：DNADNA片段的同位素末端标记片段的同位素末端标记5 5 GG-CC-TT-CC-AA-GG-CC-TT-GG-GG-AA-GG-T
32、3T 33 3 CC-GG-AA-GG-TT-CC-GG-AA-CC-CC-TT-CC-A A 5 5 MgMg2+2+5 5 ppp dN ppp dN 5 5 pppppp dA dA（aa-3232P-dATPP-dATP）5 5 GG-CC-TT-C AC A-GG-CC-TT-GG-OHOH HO HO-TT-CC-GG-AA-CC-CC-TT-CC-A A 5 5 T4-DNA polT4-DNA polT4-DNA polT4-DNA pol5 5 GG-CC-TT-CC-AA-GG-CC-TT-GG-GG-AA-GG-T T 333 3 CC-GG-AA-GG-TT-CC-GG
33、-AA-CC-CC-TT-CC-A A 5 5 第29 页，本讲稿共108 页DNADNA聚合酶聚合酶依赖于依赖于RNARNA的的DNADNA聚合酶（反转录酶）聚合酶（反转录酶）反转录酶的基本特性：反转录酶的基本特性：以以RNARNA为模板聚合为模板聚合cDNAcDNA链链33AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA 55mRNAmRNA反转录酶反转录酶MgMg2+2+dNTP dNTP55TTTTTTTTTTTT TTTTTTTTTTTT oligo(dT)oligo(dT)12-1812-1833AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA 55mRNAmRNA
34、55TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT 33cDNAcDNA第30 页，本讲稿共108 页DNADNA聚合酶聚合酶依赖于依赖于RNARNA的的DNADNA聚合酶（反转录酶）聚合酶（反转录酶）反转录酶的基本特性：反转录酶的基本特性：双向外切双向外切DNA-RNADNA-RNA杂合链中的杂合链中的RNARNA链链反转录酶反转录酶3 RNA3 RNA55 DNADNA 33553 RNA3 RNA55 DNADNA 3355反转录酶反转录酶55 DNADNA33第31 页，本讲稿共108 页（四）核酸酶（四）核酸酶单链核酸外切酶：核酸外切酶单链核酸外切酶：核酸外切酶VIIVII
35、（ExoVIIExoVII）大肠杆菌的核酸外切酶大肠杆菌的核酸外切酶VIIVII不需要不需要MgMg2+2+ExoVIIExoVII335533553355 3355第32 页，本讲稿共108 页核酸酶核酸酶双链核酸外切酶：核酸外切酶双链核酸外切酶：核酸外切酶 IIIIII（ExoIIIExoIII）ExoExoIIIIII33553355MgMg2+2+33553355大肠杆菌的核酸外切酶大肠杆菌的核酸外切酶 III III 特异性地从特异性地从3 3 端外切端外切第33 页，本讲稿共108 页核酸酶核酸酶双链核酸外切酶：双链核酸外切酶：l l 核酸外切酶核酸外切酶（llExoExo）llE
36、xoExo3355 3355MgMg2+2+ll核酸外切酶特异性地从核酸外切酶特异性地从5 5 端外切端外切33553355第34 页，本讲稿共108 页核酸酶核酸酶单链核酸内切酶：单链核酸内切酶：S1S1核酸酶核酸酶S1S1核酸酶的基本特性：来自稻谷曲霉菌（核酸酶的基本特性：来自稻谷曲霉菌（Aspergillus oryzaeAspergillus oryzae）ZnZn2+2+必需必需最适最适pHpH范围为范围为4.0-4.34.0-4.3需要需要NaCl 10-300 mMNaCl 10-300 mM降解单链降解单链DNADNA的速度比降解双链的速度比降解双链DNADNA快快750007
37、5000倍倍降解单链降解单链DNADNA的速度比降解单链的速度比降解单链RNARNA快快77倍倍第35 页，本讲稿共108 页核酸酶核酸酶单链核酸内切酶：单链核酸内切酶：S1S1核酸酶核酸酶S1S1核酸酶的基本反应：核酸酶的基本反应：内切单链内切单链DNADNA或或RNARNA5 5 GG-CC-TT-CC-AA-GG-CC-TT-CC-TT-TT-GG-AA-GG-GG-AA-GG-T 3T 3S1S1ZnZn2+2+5 5 GG-CC-TT-CC-AA-GG-CC-TT-C TC T-TT-GG-AA-GG-GG-AA-GG-T 3T 35 5 GG-CC-TT-C AC A-GG-CC-
38、TT-C TC T-TT-GG-AA-G GG G-AA-GG-T 3T 35 5 dNMPs dNMPs 或或 5 5 NMPsNMPs第36 页，本讲稿共108 页核酸酶核酸酶单链核酸内切酶：单链核酸内切酶：S1S1核酸酶核酸酶S1S1核酸酶的基本反应：核酸酶的基本反应：内切带缺口或缺刻的双链内切带缺口或缺刻的双链DNADNA或或RNARNA5 5 GG-CC-TT-CC-AA-G CG C-TT-GG-GG-AA-GG-T 3T 33 3 CC-GG-AA-GG-TT-CC-GG-AA-CC-CC-TT-CC-A A 5 5 5 5 GG-CC-TT-CC-AA-GG-CC-TT-GG-
39、GG-AA-GG-T 3T 33 3 CC-GG-AA-GG-TT-CC AA-CC-CC-TT-CC-A A 5 5 nicknickgapgapS1S1ZnZn2+2+5 5 GG-CC-TT-CC-AA-GG3 3 CC-GG-AA-GG-TT-CCTT-GG-GG-AA-GG-T 3T 3AA-CC-CC-TT-CC-A A 5 5 第37 页，本讲稿共108 页核酸酶核酸酶单链核酸内切酶：单链核酸内切酶：S1S1核酸酶核酸酶S1S1核酸酶的重要用途：核酸酶的重要用途：在在DNADNA上定位上定位RNARNA（S1 mappingS1 mapping）DNADNAmRNAmRNA杂交杂
40、交S1S1EcoRIEcoRI第38 页，本讲稿共108 页核酸酶核酸酶单链内切双链外切的核酸酶：单链内切双链外切的核酸酶：Bal31Bal31核酸酶核酸酶Bal31Bal31核酸酶的基本特性核酸酶的基本特性:来自艾氏交替单胞菌（来自艾氏交替单胞菌（A.espejianaA.espejiana）CaCa2+2+5 5 dNMPs dNMPs 或或 5 5 NMPsNMPsssDNA or RNAssDNA or RNACaCa2+2+CaCa2+2+第39 页，本讲稿共108 页核酸酶核酸酶单链内切双链外切的核酸酶：单链内切双链外切的核酸酶：Bal31Bal31核酸酶核酸酶Bal31Bal31
41、核酸酶的基本用途：诱发核酸酶的基本用途：诱发DNADNA突变突变EcoRIEcoRIAABBCCEcoRIEcoRIEcoRIEcoRIBB CCAABal31Bal31BBCCAA环化环化AACC第40 页，本讲稿共108 页（五）核酸修饰酶（五）核酸修饰酶末端脱氧核苷酰转移酶（末端脱氧核苷酰转移酶（TdTTdT）TdTTdT的基本特性：来自小牛胸腺的基本特性：来自小牛胸腺不需要模板的不需要模板的DNADNA聚合酶，聚合酶，随机掺入随机掺入dNTPsdNTPs5 p3 HOOH 3 p 5 TdTTdTMgMg2+2+dATPdATP5 p3 HOAAAAAAAAAAAA OH 3 p 5
42、第41 页，本讲稿共108 页TdTTdT的基本特性：的基本特性：5 p3 HOOH 3 p 5 TdTTdTCoCo2+2+dATPdATP5 p3 HO AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA OH 3 p 5 5 p3 HOOH 3 p 5 TdTTdTCoCo2+2+dATPdATP5 p3 HOAAAAAAAAAAAAAA OH 3 p 5 AAAAAAAAAAA第42 页，本讲稿共108 页核酸修饰酶核酸修饰酶碱性磷酸单酯酶碱性磷酸单酯酶来自小牛胸腺的碱性磷酸单酯酶（来自小牛胸腺的碱性磷酸单酯酶（CIPCIP）来自大肠杆菌的碱性磷酸单酯酶（来自大肠杆菌的碱性磷酸单酯酶（BAPB
43、AP）5 p OH 3 DNA or RNA5 ppp dN5 pppNBAP/CIPBAP/CIPOH 3 5 HO5 HO dN5 HO N第43 页，本讲稿共108 页核酸修饰酶核酸修饰酶T4-T4-多核苷酸磷酸激酶（多核苷酸磷酸激酶（T4-PNPT4-PNP）T4-PNPT4-PNP的基本特性：在的基本特性：在DNADNA、RNARNA、dNRdNR、NRNR的的5-5-OHOH上加磷上加磷5 HO3 HOOH 3 OH 5 T4-PNPT4-PNP MgMg2+2+ppppATPppATP（gg-3232P-ATPP-ATP）5 p3 HOOH 3 p 5 用于探针的末端同位素标记：
44、用于探针的末端同位素标记：第44 页，本讲稿共108 页第三章第三章 用于基因克隆的载体用于基因克隆的载体质粒（质粒（plasmidplasmid）噬菌体或病毒噬菌体或病毒DNADNA考斯质粒（考斯质粒（cosmidcosmid）与噬菌粒与噬菌粒人造染色体载体人造染色体载体载体的功能及特征载体的功能及特征第45 页，本讲稿共108 页载体的功能及特征载体的功能及特征载体的功能载体的功能运送外源基因高效转入受体细胞运送外源基因高效转入受体细胞为外源基因提供复制能力或整合能力为外源基因提供复制能力或整合能力为外源基因的扩增或表达提供必要的条件为外源基因的扩增或表达提供必要的条件第46 页，本讲稿共
45、108 页载体的功能及特征载体的功能及特征载体应具备的条件载体应具备的条件具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性（可转移性）具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性（可转移性）具有合适的筛选标记具有合适的筛选标记 具有较具有较高的外源高的外源DNADNA的载装能力的载装能力 具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点 具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点 第47 页，本讲稿共108 页质粒质粒质粒的基本特征质粒的基本特征质粒是生物细胞内固有的、能独立于寄主染色体而自主复制、并质粒是生物细胞内固有的、能独立于寄主染色体而自主复制
46、、并被稳定遗传的一类核酸分子被稳定遗传的一类核酸分子质粒常见于原核细菌和真菌中质粒常见于原核细菌和真菌中绝大多数的质粒是绝大多数的质粒是DNADNA型的型的绝大多数的天然绝大多数的天然DNADNA质粒具有共价、封闭、环状的分子结构，质粒具有共价、封闭、环状的分子结构，即即cccDNAcccDNA质粒质粒DNADNA的分子量范围：的分子量范围：1-300 1-300 kbkb第48 页，本讲稿共108 页质粒质粒质粒的基本特征质粒的基本特征质粒的自主复制性质粒的自主复制性质粒能利用寄主细胞的质粒能利用寄主细胞的DNADNA复制系统进行自主复制复制系统进行自主复制质粒质粒DNADNA上的复制子结构
47、决定了质粒与寄主的对应关系上的复制子结构决定了质粒与寄主的对应关系根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒可分为根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒可分为两大复制类型：两大复制类型：严紧型复制控制的质粒严紧型复制控制的质粒 1-3 1-3 拷贝拷贝 stringent plasmidstringent plasmid松弛型复制控制的质粒松弛型复制控制的质粒 10-60 10-60 拷贝拷贝 stringent plasmidstringent plasmid第49 页，本讲稿共108 页质粒质粒质粒的基本特征质粒的基本特征质粒的自主复制性：质粒的自主复制性：拷贝数的控制机制拷贝数的
48、控制机制 质粒质粒DNADNA复制启动控制复制启动控制控制复制引物与模板的结合控制复制引物与模板的结合orioriE.coli E.coli ColE1ColE1 plasmidplasmid复制方向复制方向roprop（+）RopRopRNA IIRNA IIRNA IRNA I33555533第50 页，本讲稿共108 页质粒质粒质粒的基本特征质粒的基本特征质粒的自主复制性：质粒的自主复制性：拷贝数的控制机制拷贝数的控制机制 质粒质粒DNADNA复制启动控制复制启动控制控制复制起始因子与复制起始位点（控制复制起始因子与复制起始位点（oriori）的结合的结合PcopPcop copcopP
49、/OrepP/Orep repreporioriCopCopRepRep第51 页，本讲稿共108 页质粒质粒质粒的基本特征质粒的基本特征质粒的不相容性质粒的不相容性任何两种含有相似复制子结构的不同质粒，不能同时存在于任何两种含有相似复制子结构的不同质粒，不能同时存在于一个细胞中，这种现象称为一个细胞中，这种现象称为质粒的不相容性质粒的不相容性，不相容性的质，不相容性的质以大肠杆菌的质粒为例：以大肠杆菌的质粒为例：ColE1ColE1、pMB1 pMB1 拥有相似的复制子结构，彼此不相容拥有相似的复制子结构，彼此不相容pSC101pSC101、FF、RP4 RP4 拥有相似的复制子结构，彼此不
50、相容拥有相似的复制子结构，彼此不相容p15Ap15A及其衍生质粒拥有相似的复制子结构，彼此不相容及其衍生质粒拥有相似的复制子结构，彼此不相容粒组成粒组成不相容性群不相容性群第52 页，本讲稿共108 页质粒质粒质粒的基本特征质粒的基本特征质粒的不相容性：质粒的不相容性：分子机制分子机制两种含有相似复制子结构的不同质粒，在复制时受到同一种两种含有相似复制子结构的不同质粒，在复制时受到同一种拷贝数控制系统的干扰，致使两种质粒的最终拷贝数不同，拷贝数控制系统的干扰，致使两种质粒的最终拷贝数不同，两种含有不同复制子结构的不同质粒，在复制时各受自己的两种含有不同复制子结构的不同质粒，在复制时各受自己的拷