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1、肿 瘤 的 分 子 诊 断器官病理学组织病理学细胞病理学免疫病理学分子病理学应用分子诊断技术，对肿瘤发生发展的病理学机制及生物学行为能从分子水平上加以认识，其范围覆盖分子生物学和细胞生物学。研究较为深入当属癌基因、抑癌基因及其它相关基因。第一节肿瘤基因过表达及其检测一、基因过表达的形式癌基因一般为单拷贝基因，有其编码的蛋癌基因一般为单拷贝基因，有其编码的蛋白质，在肿瘤细胞内的一些癌基因在白质，在肿瘤细胞内的一些癌基因在DNADNA复制复制过程中形成多个拷贝，形成双微粒染色体和均过程中形成多个拷贝，形成双微粒染色体和均染区，各种基因的扩增常产生基因产物过表达，染区，各种基因的扩增常产生基因产物过
2、表达，表现为表现为RNARNA和蛋白质量的增加。和蛋白质量的增加。二、基因过表达的检测（一）表达产物的检测n n免疫组织化学免疫组织化学（immunohistochemistryimmunohistochemistry）n n酶联免疫吸附实验酶联免疫吸附实验（enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISAenzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA）n n蛋白印迹蛋白印迹（WesternblotWesternblot）n n流式细胞仪测试法流式细胞仪测试法（二）基因扩增的检测基因拷贝数的增加和转录产物的mRNA的增加分子诊断检测方法:原
3、位杂交原位杂交（insituhybridization,ISHinsituhybridization,ISH）荧光原位杂交荧光原位杂交（fluorescenceinsituhybridization,FISHfluorescenceinsituhybridization,FISH）原位原位PCRPCR（insitupolymerasechainreactioninsitupolymerasechainreaction）SouthernSouthern杂交杂交（DNADNA杂交）杂交）NorthernNorthern杂交杂交（RNARNA杂交）杂交）原位杂交（insituhybridizatio
4、n,ISH）将分子杂交与组织化学相结合的一项技术，属固相核酸分子杂交范围，它用标记的DNA 或RNA 为探针在原位检测组织细胞内特异的DNA 或RNA 序列。优点：11、具有分子杂交的特异性强、灵敏高特点，同、具有分子杂交的特异性强、灵敏高特点，同时又具有组织细胞化学染色的可见性；时又具有组织细胞化学染色的可见性；22、即可用新鲜组织，又可用石蜡包埋组织作回、即可用新鲜组织，又可用石蜡包埋组织作回顾性研究；顾性研究；33、所需样本量少，可用活组织细针穿刺和细胞、所需样本量少，可用活组织细针穿刺和细胞涂片；涂片；44、应用范围广泛，可对特定的基因（如癌基因、应用范围广泛，可对特定的基因（如癌基因
5、、病毒基因）病毒基因）DNADNA、mRNAmRNA的表达进行定位、定的表达进行定位、定性和定量。组织细胞分布和杂交电镜的亚细胞性和定量。组织细胞分布和杂交电镜的亚细胞定位研究。定位研究。分类：DNA-DNADNA-DNA杂交杂交DNA-RNADNA-RNA杂交杂交RNA-RNARNA-RNA杂交杂交直接法直接法间接法间接法同位素标记同位素标记非同位素标记非同位素标记生物素、地高素、荧光素等生物素、地高素、荧光素等双重标记原位杂交技术双重标记原位杂交技术荧光原位杂交（FISH）将荧光素标记克隆的DNA 片段与染色体或细胞间期染色质杂交，以测试该特定的DNA 片段是否有缺失或扩增。比较基因组杂交
6、（comparativegenomehybridizationCGH）即将荧光素分别标记在去除了重复序列的肿瘤及正常细胞基因组DNA 上，然后分别与正常染色体进行原位杂交，对该二种不同探针与各个染色体杂交后的信号进行比较，以了解该肿瘤中细胞在不同染色体上缺失或扩增的状态。原位PCR（insitupolymerasechainreactioninsitupolymerasechainreaction）将将PCRPCR扩增技术和原位杂交技术相结合，通扩增技术和原位杂交技术相结合，通过过PCRPCR技术对靶核苷酸序列在染色体上或组织细技术对靶核苷酸序列在染色体上或组织细胞内进行原位扩增使基因拷贝数放
7、大，再通过原胞内进行原位扩增使基因拷贝数放大，再通过原位杂交方法检测，以达到对靶核苷酸进行定性、位杂交方法检测，以达到对靶核苷酸进行定性、定位、定量分析。定位、定量分析。一种敏感性高、特异性强，能在组织细胞一种敏感性高、特异性强，能在组织细胞原位进行低拷贝数基因定性的研究方法。原位进行低拷贝数基因定性的研究方法。Southern杂交：一种DNA 特定序列定位技术。以组织或细胞中获取基因组DNA，用一种或多种限制性内切酶酶切，通过电泳、转印、原位变性固定于一固相支持物，用已标记的特异性DNA 或RNA 的探针与固定有DNA 的固相支持膜杂交，经过放射自显影或化学发光自显影，对显影条带进行分析。N
8、orthernblot：用于分析细胞总RNA 或含有polyA尾的RNA 样品中特定mRNA 分子大小和丰度的分子杂交技术，可了解被测靶基因在细胞内有无过表达。注意问题：1、提取组织或细胞中的RNA，不需酶切而直接采用电泳。2、操作过程要严格控制RNase 的污染。3、RNA 只与双链DNA 样本中的一条链互补，因此杂交时所需双链DNA 探针的量加大；如采用单链探针，无论是DNA 抑或RNA 探针，或是寡核苷酸探针，均需确定所用探针能与目标RNA 互补。第二节基因突变及其检测癌基因和抑癌基因突变是肿瘤发生中出现频率较高的分子事件，突变的结果则使癌基因激活或抑癌基因失活，导致细胞表型发生变化和肿
9、瘤发生。基因突变是一复杂的过程，不仅在肿瘤细胞中检测到突变基因，对于某些癌前病变或癌前状态的组织细胞中也存在不同形式和不同程度的基因突变，在同一肿瘤的不同发展阶段，可能会涉及多种基因不同形式的突变，说明肿瘤的发生发展是一个多基因参与、多步骤的复杂的生物学过程。一、基因突变的形式点突变（pointmutationpointmutation）基因缺失(genelosses)(genelosses)基因异位或重排（genetranslocationandrearrangmentgenetranslocationandrearrangment）（一）点突变（pointmutation）指指基基因因在在
10、特特异异位位置置发发生生一一个个核核苷苷酸酸的的改改变变，使使相相应应蛋蛋白白质质的的一一个个氨氨基基酸酸改改变变，继继而而改改变变了了蛋白质的空间构型和生物学功能。蛋白质的空间构型和生物学功能。错义突变错义突变（missencemissence）无义突变无义突变（nonsencenonsence）终止码突变终止码突变（stopcodonstopcodon）移码突变移码突变（frameshiftframeshift）等）等（二）基因缺失(genelosses)基因片段缺失是另一种主要的突变形式，缺失的范围差别较大，可以是1-2个碱基，也可以是一个片段甚或一个外显子的缺失。基因片段的缺失可使该基
11、因激活，转录异常，使基因正常的生物学功能丧失。基因缺失与肿瘤的临床病理及生物学行为密切相关。基因缺失中较为频发的分子事件是存在于抑癌基因中的等位基因杂合型和纯合型丢失。基因缺失是肿瘤形成的原因还是细胞恶性转化的结果，尚值得深入探讨。（三）基因异位或重排（genetranslocationandrearrangement genetranslocationandrearrangement）某一基因在肿瘤细胞中从染色体的正常位某一基因在肿瘤细胞中从染色体的正常位置转移到其它染色体的某个位置上称为易位或置转移到其它染色体的某个位置上称为易位或重排。易位与重排易使癌基因被激活，或是抑重排。易位与重排易
12、使癌基因被激活，或是抑癌基因失活，从而使细胞恶变。癌基因失活，从而使细胞恶变。细胞癌基因的编码序列在细胞癌基因的编码序列在DNADNA分子上是不分子上是不连续的，由内含子分隔，其中有些序列起到促连续的，由内含子分隔，其中有些序列起到促进子和调节基因的作用，如染色体出现易位、进子和调节基因的作用，如染色体出现易位、重排等改变时，可使细胞癌基因于正常的抑制重排等改变时，可使细胞癌基因于正常的抑制子分开而被置于活化子分开而被置于活化DNADNA序列的控制之下，其序列的控制之下，其中具有代表性的例子为中具有代表性的例子为BurkittBurkitt淋巴瘤。淋巴瘤。(四)其它类型的基因突变n n 插入n
13、 n 甲基化n n 染色体非组蛋白改变等癌基因或抑癌基因甲基化（methylation）状态改变与肿瘤发生存在密切关系。二、基因突变的检测方法目 前 几 乎 所 有 的 基 因 突 变 检 测 的 分子 诊 断 技 术 都 是 建 立 在PCR 的 基 础 上，由PCR 衍 生 出 的 新 方 法 不 断 出 现，自 动化 程 度 越 来 越 高，分 析 时 间 大 大 缩 短，分析结果的准确性也有了很大提高。（一）PCR-SSCP法单链构像多态性(single-strandconformationalpolymorphism,(single-strandconformationalpolym
14、orphism,SSCP)SSCP)基本原理：单链DNA 在中性条件下会形成二级结构，这种二级结构依赖于其碱基组成，在非变性聚丙烯酰胺凝胶上，短的单链DNA 和RNA 分子依其碱基序列不同而形成不同构象，一个碱基的改变将影响其构象而导致其在凝胶上移动速度改变，不同的二级结构而出现不同的迁移象。该法不能测定突变的准确位点，还需通过序列分析来确定。对于大于200bp的片段，用其RNA 分子来做SSCP 会提高其灵敏度。该法简单快速，被广泛用于未知基因突变的检测。由于该法的简便快速，特别适合大样本基因突变研究的筛选工作。应用PCR-SSCP 检测点突变已见报道于人类大部分的肿瘤组织或细胞，检测的基因
15、包括多种癌基因及抑癌基因，也是检测抑癌基因p53突变最常用的方法。（二）杂合双链分析法（heterodulexanalgsis,HA）直接在非变性凝胶上分离杂交的突变型-野生型DNA 双链。由于突变型和野生型DNA 形成的异源杂合双链DNA 在其错配处会形成突起，在非变性凝胶中电泳时，会产生与相应同源双链DNA 不同的迁移率。HA 对一些不能用SSCP 检出的突变有互补作用，二者结合使用，可使突变检出率提高近100%。（三）突变体富集PCR（mutant-enrichedPCR）利 用 癌 基 因 或 抑 癌 基 因 某 个 编 码 子部 位 存 在 已 知 的 限 制 性 内 切 酶 位 点
16、，用连 续 二 次 的 巢 式PCR 来 扩 增 包 括 存 在 酶位 点 编 码 子 的DNA 片 段，在 两 次 扩 增 反应 之 间 用 相 应 的 内 切 酶 消 化 扩 增 的DNA片 段，野 生 型 因 被 酶 切 而 不 能 进 入 第 二次PCR 扩 增，而 突 变 型 则 能 完 整 进 入 第二次PCR 扩增并得到产物的富集。（四）变性梯度凝胶电泳法（denaturinggradientgelelectrophoresisdenaturinggradientgelelectrophoresis，DGGEDGGE）双双链链DNADNA在在变变性性梯梯度度聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺凝
17、凝胶胶中中电电泳泳，凝凝胶胶中中自自上上而而下下所所含含变变性性剂剂浓浓度度线线性性增增长长，DNADNA片片段段进进行行到到变变性性剂剂某某一一浓浓度度，与与DNADNA变变性性温温度度一一致致的的凝凝胶胶位位置置时时，DNADNA发发生生部部分分解解链链，电电泳泳迁迁移移率率下下降降，但但解解链链的的DNADNA链链中中有有一一个个碱碱基基改改变变时时，会会在在不不同同时时间间解解链链，则则因因影影响响电电泳泳速速度度变变化化的的程程度而被分离。度而被分离。在DGGE 基础上，又发展了用温度梯度代替化学变性剂的TGGE 法（temperaturetemperaturegradientgel
18、gradientgelelectrophoresis,TGGEelectrophoresis,TGGE），由于DGGE 和TGGE 是利用温度和梯度凝胶迁移率来检测，均需专用的电泳装置。（五）化学切割错配法（Chemicalcleavageofmismatch,CCMChemicalcleavageofmismatch,CCM）基本原理：将待测含DNA 片段与相应的野生型DNA 片段或RNA 片段混合变性杂交，在异源杂合的双链核酸分子中，错配的C 能被羟胺或哌啶切割，错配的T 能被四氧化锇切割，经变性凝胶电泳可确定是否存在突变。该法检出率很高，也是检测片段最长的方法。应用荧光检测系统可增强敏感
19、度。该法中的化学试剂有毒，故又发展了碳化二亚胺检测法（Carbodiimide，CDI），CDI 为无毒物质。（六）等位基因特异性寡核苷酸分析法(allele-specificoligonucleotideASO)设计一段20bp左右的寡核苷酸片段，其中包含了发生突变的部位，以此为探针，与固定在膜上的经PCR 扩增的样品DNA 杂交。可以选用各种突变类型的寡核苷酸探针，同时以野生型探针为对照，如出现阳性杂交带，则表示样品中存在与该ASO探针相应的点突变。（七）DNA芯片技术（DNAChipDNAChip）基本原理：将许多已知序列的寡核苷酸将许多已知序列的寡核苷酸DNADNA排列在一排列在一块固
20、体材料如玻璃片、硅片（集成电路板）上，块固体材料如玻璃片、硅片（集成电路板）上，彼此之间重叠一个碱基，并覆盖所需测定的基因，彼此之间重叠一个碱基，并覆盖所需测定的基因，将荧光标记的正常将荧光标记的正常DNADNA和突变和突变DNADNA分别与两块分别与两块DNADNA芯片杂交，由于至少存在一个碱基的差异，芯片杂交，由于至少存在一个碱基的差异，正常和突变的正常和突变的DNADNA将会得到不同的杂交图谱，经将会得到不同的杂交图谱，经过共聚焦显微镜分别检测两种过共聚焦显微镜分别检测两种DNADNA分子产生的荧分子产生的荧光信号，即可确定是否存在突变。光信号，即可确定是否存在突变。可可用用于于基基因因
21、定定位位、DNADNA测测序序、物物理理图图谱谱和和遗遗传传图图谱谱的的构构建建等等，在在基基因因突突变变检检测测方方面面DNADNA芯芯片片也有广阔的前景。也有广阔的前景。（八）RNA酶A切割法制备RNA 探针，与待测DNA 或RNA片段杂交，在一定条件下，异源双链核酸分子RNA：RNA 或RNA：DNA 的错配碱基可被RNaseA 切割，切割产物可通过变性凝胶电泳分离。该法可用于1-2kb 的大片段进行检测，并能确定突变位点。（九）染色体分析（analysisofchromosome）1、荧光原位杂交技术（FISH）2、寡核苷酸引物原位DNA 合成技术（Oligonncleotidepri
22、medinsituDNAsynthesis,PRINSOligonncleotideprimedinsituDNAsynthesis,PRINS）重复引物原位标记技术重复引物原位标记技术（repeatedPRINSrepeatedPRINS）多色原位引物标记多色原位引物标记（multicolorPRINSmulticolorPRINS）3、比较基因组杂交（comparativegenomichybridization,CGHcomparativegenomichybridization,CGH）基本原理：基本原理：用不同的非同位素标记物，分别标记被检用不同的非同位素标记物，分别标记被检测的基因
23、组测的基因组DNADNA（常为肿瘤（常为肿瘤DNADNA）和正常人基）和正常人基因组因组DNADNA，两者以，两者以11：11混合后制备探针，共同混合后制备探针，共同与正常人中期染色体标本进行染色体原位抑制与正常人中期染色体标本进行染色体原位抑制杂交，杂交后对不同荧光物分别进行检测，以杂交，杂交后对不同荧光物分别进行检测，以每条染色体长轴各位点的被测每条染色体长轴各位点的被测DNADNA与正常基因与正常基因组组DNADNA荧光强度比，反映两组荧光强度比，反映两组DNADNA不同序列的不同序列的拷贝数。拷贝数。只能检测肿瘤基因组中相对于正常基因组平均拷贝数的变化，而不能检测易位、倒位及其它拷贝数
24、没有变化的染色体畸变，基因重排和点突变，也不能检出小于2Mb 的缺失。（十）DNA序列分析（DNAsequencingDNAsequencing）应用各种突变检测技术检测到的基因突变，最后都需要用DNA 序列分析才能确定突变的类型及突变的位置。直接测序法（directsequencing，DS）PCR 循环测序法双脱氧终止法基本原理第三节限制性酶切片段长度多态性分析一、等位基因不平衡应 用 同 一 肿 瘤 的 正 常 体 细 胞（常 分 为血 细 胞 或 肿 瘤 旁 正 常 组 织）和 肿 瘤 细 胞 的DNA，检 测DNA 多 态 性 座 位 上 等 位 基 因 不平 衡 性。当 两 个 等
25、 位 基 因 的 相 关 性 密 度 在正 常 与 肿 瘤 细 胞 之 间 出 现 显 著 性 差 异 时，就 提 示 肿 瘤 细 胞 中 多 态 序 列 座 位 处 出 现 突变。限制性片段长度多态性（restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLPrestrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP）当DNA 序列的差异发生在限制性内切酶识别位点，或当DNA 片段的插入、缺失或重复，可使基因组DNA 经限制性内切酶水解后发生片段长度改变。因为这些特异基因片段是限制性内切酶产生的，在不同个体间可出现不同长度的限制性片段类型，
26、故称为限制性片段长度多态性RFLP 的 研 究 可 以 观 察 到 同 一 患 者的 正 常 细 胞DNA 中 存 在 二 个 等 位 基 因，而 肿 瘤 组 织DNA 中 仅 存 在 一 个 等 位 基 因，因 为 肿 瘤 细 胞 单 条 染 色 体 中 一 个 等 位 基因 缺 失，这 种 改 变 称 为杂合缺失（lossofheterozygosity,LOH）。人类基因组中含有一些复杂序列家族，有些重复序列分散在基因组中，有些是以一系列短的重复序列排列组成高变区，其串联重复序列拷贝数可相差很多，出现可变数的串联重复，约占单倍体DNA 的10%，基本上位于非编码区，重复单位以6-70bp
27、为多，重复次数约6-100 次，称为数量可变的串联重复序列（variablenumberofvariablenumberoftandemrepeat,VNTRtandemrepeat,VNTR）。由于高变区的长度变化很大，使高变区两侧限制性内切酶识别位点的固定位置随高变区的大小而发生相对位移，由此造成RFLP，称之为VNTR多态性。采用RFLP 技术可直接分析、测定人体癌组织中某些基因在染色体上的变异及其与肿瘤发生的关系。精确位点的RFLP 分析还是发现新的肿瘤基因的有效研究手段。二、RFLP的检测采 集 配 对 样 本，既 肿 瘤 组 织 和 同 一患 者 的 正 常 体 细 胞（可 用 周
28、 围 血 细 胞 或肿 瘤 旁 组 织），分 别 提 取 基 因 组DNA，特 定 的 内 切 酶 酶 切、电 泳、转 印，与 标记 探 针 进 行Southern 杂 交 后，分 析 等 位 基因的变化。PCR-RFLP一种PCR 结合RFLP 的方法。首先设计PCR 引物，并使其扩增片段包含多态性限制性酶切位点序列，PCR扩增后，用相应的酶酶切PCR 产物，直接电泳以观察酶切片段的长度多态性变化。该方法快速、简便、灵敏度高，以及DNA 样本用量低。第四节微卫星不稳定性分析一、微卫星不稳定性与肿瘤小卫星DNA（minisatelliteDNAminisatelliteDNA），又称VNTR。
29、微卫星DNA，又称简单重复序列（simplesimplerepeatsequencerepeatsequence，SRSSRS）。SRS 是一种最常见的重复序列之一，具有丰富的多态性、高度杂合性、重组率低等优点。最常见的为双核苷酸重复，即(AC)n 和(TG)n。在n14 时，2bp重复序列在人群中就呈高度多态性。SRS 广泛存在于原核和真核基因组中，约占真核基因组的5%，是近年来快速发展起来的DNA 多态性标志之一。微卫星不稳定性（microsatelliteinstability,MI）是指简单重复序列的增加或丢失，特别是在DNA 错配修复系统缺损的肿瘤基因组中常显示大量的MI。MI 可能
30、是肿瘤细胞的一种重要分子标志。二、微卫星不稳定性的检测基本方法为首先用PCR 技术扩增所需的双核苷酸重复序列，然后用凝胶电泳分析DNA 序列。分析时条带长度的确定可用已知长度梯度标准带为参考，也可以用频率最高的带（优势带）为基准。MI 分析是与PCR 技术联系在一起的，由此也衍生不同的方法和引物标记物。第五节端粒酶与肿瘤的关系及检测一、端粒酶与肿瘤染 色 体端粒（telomere）是 位 于 细 胞染 色 体 末 端 的 一 种 有2-20kb 串 联 的 短 片 段重 复 序 列(TTAGGG)n 及 一 些 结 合 蛋 白 组 成的 特 殊 结 构。人 的 端 粒 长 度 大 约15kb，
31、随着 细 胞 的 每 次 分 裂，端 粒 逐 渐 缩 短，每 次丢 失50-200 个 核 苷 酸。端粒的缩短限制了细胞增殖能力，对端粒长度的计算是计数细胞分裂次数的生物钟。端 粒 在 染 色 体 定位、复 制、保 护 和 控 制 细 胞 生 长 寿 命 等 方面 具 有 重 要 作 用，并 与 细 胞 凋 亡、细 胞 转化和永生化密切相关。端粒序列的复制依赖于一种特殊的DNA 聚合酶即端粒酶（telomerase）的作用。端粒酶为由RNA 和蛋白质组成的一种核糖核蛋白复合物（RNP），含有端粒重复序列的模板，即以自身RNA 组分为模板，复制合成端粒序列。正常细胞周期中，细胞每分裂一次，端粒子
32、链即缩短一次，经过若干分裂周期后，端粒缩短到临界长度时，细胞进入凋亡，端粒酶检测为阴性。癌细胞在某些机制作用下，启动端粒酶表达而使染色体端粒稳定维持在一定长度，从而使癌细胞得以增殖，并获得永生化，此时端粒酶检测阳性。端粒的长度不能作为衡量端粒酶活性的可靠标记，而端粒酶活性表达的高低可作为恶性肿瘤发展的衡量指标。端粒酶的表达水平有可能为肿瘤的发生发展、诊断、预后等提供指标，并有可能以抑制端粒酶表达为手段作为肿瘤治疗的新方法。二、端粒酶活性的检测TRAP 法（telomericrepeatamplificationprotocaltelomericrepeatamplificationprotoc
33、al，TRAPTRAP）ELISA 法TRAP法（telomericrepeatamplificationprotocaltelomericrepeatamplificationprotocal，TRAPTRAP）首先从肿瘤细胞或组织中制备端粒酶提取液，首先从肿瘤细胞或组织中制备端粒酶提取液，然后进行然后进行TRAPTRAP反应，即在含有一条引物、反应，即在含有一条引物、dNTPdNTP和和TRAPTRAP缓冲液的反应体系中，加入端粒酶提取缓冲液的反应体系中，加入端粒酶提取液，使端粒以其液，使端粒以其RNARNA组分为模板催化合成端粒组分为模板催化合成端粒DNADNA重复序列，并以此为模板，加
34、入另一条引物重复序列，并以此为模板，加入另一条引物进行进行PCRPCR扩增，扩增体系中加入标记的扩增，扩增体系中加入标记的dATPdATP（同（同位素、荧光素或地高辛等标记物），扩增产物可位素、荧光素或地高辛等标记物），扩增产物可通过凝胶电泳、放射自显形（同位素为标记物）通过凝胶电泳、放射自显形（同位素为标记物）后分析，以荧光素为标记物者可通过扫描仪分析后分析，以荧光素为标记物者可通过扫描仪分析荧光曲线。应用地高辛标记试剂盒，还可进行半荧光曲线。应用地高辛标记试剂盒，还可进行半定量分析。定量分析。ELISA法利用端粒酶在生物素标记的引物上加入多个6核苷酸端粒重复序列，反应产物用生物素标记的引物
35、进行PCR 扩增，再与链霉菌抗生物素蛋白包被的微量滴定板结合，与地高辛标记的探针杂交，产生的有色底物用酶标仪测量结果。该法省时简便。结 语分子诊断是具有划时代意义的检测手段，在生物医学领域中正发挥着巨大的作用，在肿瘤基础和临床研究中也显示了极大的优越性和应用前景。分子诊断的任务不完全在于去寻找和发现新的理论、机制，更应致力于如何将实验研究成果转化到临床应用阶段。需解决的问题如：建立费用低廉、结果可靠、操作方便的分子诊断技术；建立标准化的实验操作程序和标准化的分子诊断实验室，实现分子诊断标准化；除了要在诊断技术方面逐步实行标准化外，对肿瘤诊断指标也要进行标准化。随着人类基因组计划和后基因组（蛋白
36、质组）计划的实施，分子诊断也将得到进一步完善和成熟，使人类最认清肿瘤的本质并攻克它。相关技术参考文献 相关技术参考文献原位杂交 原位杂交HerringtonCS.MolPathol,1998;51:8 HerringtonCS.MolPathol,1998;51:8LevyERandHerringtonCS.LevyERandHerringtonCS.Oxford:OxfordUniversityPressInc,1995:p25 Oxford:OxfordUniversityPressInc,1995:p25 荧光原位杂交 荧光原位杂交WaterJJ.etal.MolPathol,1998;
37、51:62 WaterJJ.etal.MolPathol,1998;51:62HabeebuSSM,etal.MolBiolMed,1990;7:423 HabeebuSSM,etal.MolBiolMed,1990;7:423Southernblot Southernblot Northernblot Northernblot 许良中，实用肿瘤病理方法学。许良中，实用肿瘤病理方法学。上海：上海医科大学出版社，上海：上海医科大学出版社，1997 1997；p129 p129 原位 原位PCR PCRAndersonV.CellVision,1994;1:60 AndersonV.CellVis
38、ion,1994;1:60 PCR-SSCP PCR-SSCP法 法SheffieldVC,etal.Genomics,1993;16:325 SheffieldVC,etal.Genomics,1993;16:325 杂合双链分析法 杂合双链分析法WhiteMB,etalGenomics,1992;12:301 WhiteMB,etalGenomics,1992;12:301突变体富集 突变体富集PCR PCR BoumforthKRV,etal.MolPathol,1999;52:8 BoumforthKRV,etal.MolPathol,1999;52:8 变性梯度凝胶电泳 变性梯度凝胶
39、电泳BuetowKH,etal.PiocNatlAcadSciUSA,1992;89:9622 BuetowKH,etal.PiocNatlAcadSciUSA,1992;89:9622 化学切割错配法 化学切割错配法VerpyE.PiocNatlAcadSciUSA,1994;91:1873 VerpyE.PiocNatlAcadSciUSA,1994;91:1873 等位基因特异性寡核苷酸分析法 等位基因特异性寡核苷酸分析法SaikiRK,etal.PiocNatlAcadSciUSA,1989;86:6230 SaikiRK,etal.PiocNatlAcadSciUSA,1989;86
40、:6230DNA DNA芯片技术 芯片技术 YershovG,etal.PiocNatlAcadSciUSA,1996;93:4913 YershovG,etal.PiocNatlAcadSciUSA,1996;93:4913HaciaJG,etal.GenomeRes,1998;8:1245 HaciaJG,etal.GenomeRes,1998;8:1245 DNA DNA序列分析 序列分析 颜子颖 颜子颖 等，精编分子生物学实验指南。等，精编分子生物学实验指南。北京：科学出版社，北京：科学出版社，1998 1998；p185 p185 限制性酶切片段长度多态性分析 限制性酶切片段长度多态
41、性分析KressnerU,etal.BrJCancer,1998;77:1848 KressnerU,etal.BrJCancer,1998;77:1848PCR-RFLP PCR-RFLPFangDC,etal.JClinPathol1998;51:593 FangDC,etal.JClinPathol1998;51:593微卫星不稳定性分析 微卫星不稳定性分析ArzimanoglouII,etal.Cancer,1998;82:1808 ArzimanoglouII,etal.Cancer,1998;82:1808TRAP TRAP法 法IkedaM,etal.CancerRes,1998;58:594 IkedaM,etal.CancerRes,1998;58:594