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1、第七章序列测定第1页，本讲稿共24页DNA序列测定：DNA sequencing酶法 或末端终止法：由Sanger 等人1977年建立；化学法：由Maxam and Gilbert 等人1977年建立；自动测序系统：在末端终止法基础上发展而来。第2页，本讲稿共24页末端终止法特性：利用DNA聚合酶进行引物延伸反应；其引物是带有放射性标记的，可通过放射自显影检出；双脱氧核糖核苷三磷酸（ddNTP）作为链终止剂；采用聚丙烯酰胺区分长度仅差一个碱基的单链DNA。原理：双脱氧核糖核苷三磷酸（ddNTP）不会与正常的脱氧核糖核苷三磷酸（dNTP）形成磷酸二酯键，从而链的随机终止；建立4个系统，就可得到4
2、个套组（nested sets）；在一个胶板上同时电泳，就可读出模板链的互补链的顺序。第3页，本讲稿共24页双脱氧核糖核苷三磷酸（ddNTP）第4页，本讲稿共24页DNADNA的序列测定（的序列测定（1 1）ddNTPddNTP法法Sanger法法第5页，本讲稿共24页第6页，本讲稿共24页第7页，本讲稿共24页化学法测序的基本原理将双链或单链DNA经过不同的化学方法降解，得到随机的短的DNA片段，再通过电泳分离读取顺序。每次只能在一个特定的核苷酸处降解：G反应：硫酸二甲脂（DMS）使鸟嘌呤N7甲基化；A+G反应：甲酸使嘌呤环上的氮质子化导致糖苷键被削弱，进而嘌呤环被嘧啶取代；C+T反应：肼能
3、够裂解嘧啶环，进而导致其脱落；C反应：在一定浓度的条件下，肼只对胞嘧啶起作用第8页，本讲稿共24页DNADNA的序列测定（的序列测定（2 2）化学法化学法Maxam/Gilbert法第9页，本讲稿共24页第10页，本讲稿共24页 到到20302030年，年，预计只要预计只要10001000美金就能得到个人的基美金就能得到个人的基因组序列。因组序列。注：注：人与人之间平均人与人之间平均10001000个碱基对就个碱基对就有一个碱基呈多态性。有一个碱基呈多态性。因此共有因此共有300300万碱万碱基上可能存在差异。基上可能存在差异。第11页，本讲稿共24页DNA序列的自动测定基本原理：末端终止法引
4、物用荧光素标记测序系统由反应系统，电泳系统及驱控系统组成ALF expressTM 全自动激光荧光核酸测序仪 400-500bp per sampleABI最新型全自动DNA测序仪 700 bp per sample第12页，本讲稿共24页DNA自动测序原理第13页，本讲稿共24页第14页，本讲稿共24页第15页，本讲稿共24页DNA自动测序工作站第16页，本讲稿共24页第17页，本讲稿共24页DNADNA测序结果测序结果第18页，本讲稿共24页Pyrosequencing:焦磷酸测序法 仍然根据碱基互补配对的原则 单个核苷酸或碱基按给定顺序发放通过检测焦磷酸发光反应来判断正确的核苷酸顺序 A
5、GGATCTGAGGCAAG TCCTAGAC第19页，本讲稿共24页A New Light on DNAJoJoGene Company Limited第20页，本讲稿共24页PPiATPPrinciple of Principle of P Pyrosequencingyrosequencing第21页，本讲稿共24页Peak height is proportional to Peak height is proportional to Peak height is proportional to Peak height is proportional to the number of
6、incorporated nucleotidesthe number of incorporated nucleotidesthe number of incorporated nucleotidesthe number of incorporated nucleotidesAllele 1:ACTGAllele 2:GCTGHeterozygote sample:第22页，本讲稿共24页Advantage and Benefit of PyeosequencingAdvantage and Benefit of PyeosequencingFastAccuracyFlexibilityMultiplexingSimpleSequenceEfficientShort Optimization TimeDedicated SoftwareDedicated Reagent KitScalable第23页，本讲稿共24页Let Us Show You the Light.Let Us Show You the Light.Let Us Show You the Light.Let Us Show You the Light.The EndThank You!JoJoGene Company Limited第24页，本讲稿共24页