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1、指数结直肠病变中7P53基因外显子7的体细胞突变与异时腺 瘤的早期发生有关抽象（1）背景：本前瞻性研究的重点是详细分析基线（指数）结肠镜检查期间切除的结直肠病变的突变异质性，以识别早期发生超 时腺瘤高风险的患者。（2）方法：共纳入120例晚期结直肠肿瘤大小210 mm （指数病变）内镜治疗后120例患者，1018个 月后进行结肠镜监测。石蜡阻滞物中的143个指示性病变和84个同步病变共分为30个样本。在每一个中，都进行了 11个热 点基因位点的体细胞突变检测。进行了统计分析，将突变谱和病变的异质性程度与超时腺瘤发生的风险相关联。（3）结果：在 指数病变中发现的7P53基因%显子7突变与超时腺瘤
2、的早期发生显着相关（对数等级测试p = 0.003,风险比2.73, 95%可信 区间1.14-6.56） o我们没有发现超时腺瘤的风险与监测的其他标志物之间存在关联。（4）结论：本研究的结果可能导致调整 现有关于监测结肠镜检查的建议，这些患者在指数病变中7P53基因外显子7突变，其中可能需要缩短监测间隔。关键字:结直肠癌;结直肠腺瘤;结肠镜检查;指示性病变;同步病变;异时性病变;肿瘤异质性;前续森TP53.引言众所周知，结直肠癌（CRC）的发病率和死亡率在世界范围内正在上升。对发病率和死亡率的预测显示，2020年至2040 年间，结肠癌发病率和死亡率分别持续上升55%和70%,直肠癌发病率和
3、死亡率分别持续上升50%和66%1。降低结直肠癌 发病率的一个重要工具是在指数或监测结肠镜检杳期间进行筛杳，然后切除癌前病变2。尽管有基于病变的临床和组织病理学 特征的监测间隔指南，将患者分为高危或低危，但这些指南不是最正确的，在实践中难以遵循。一般来说，较短的监测间隔导致结肠镜单位容量的超出，随后是等待时间延长，患者依从性降低以及医疗本钱增加。因此, 总的趋势是延长结肠镜检查的监测间隔。相反，较长的间隔可能会增加发生更严重的结直肠肿瘤的风险。根据2020年更新的欧 洲胃肠内窥镜学会（ESGE）指南3,低风险患者的监测结肠镜检查间隔为10年，结直肠肿瘤开展高风险患者的监测结肠镜检 查间隔为3年
4、。低风险患者被定义为1-4个腺瘤、大小为v10mm且伴有低级别异型增生（LGD）或任何锯齿状病变大小10 mm且无异型增生的患者。高风险被定义为存在至少1个大小N 10 mm的腺瘤和/或伴有高度异型增生（HGD）或5个腺 瘤，或任何大小N 10 mm的锯齿状病变或伴有异型增生。然而，除了用于估计偶发性病变复发风险的经典形态学特征外，指示 性病变中存在体细胞突变可能同样重要。近年来，结直肠癌及其癌前病变的研究在确定肿瘤内遗传变化（主要是体细胞突变） 的存在、定位和传播方面取得了越来越多的进展4, 5, 6, 7, 8o突变表征单个肿瘤内克隆，特别是在其起源，空间和时间发 展以及与环境的相互关系方
5、面。最重要的是，从临床的角度来看，突变也决定了肿瘤的各种生物学特性。它们会影响对各种治 疗的反响和耐药性9, 10、病程、复发和形成转移的能力11, 12。虽然早期和晚期CRC中突变的发生得到了很好的映射，但 指数病变中突变谱的异质性研究要少得多。我们目前研究的主要目的是详细绘制指数结肠镜检查检测到的结直肠病变的突变异质性，以帮助更好地识别具有更高风险 的中期病变早期复发风险的患者。1 .材料和方法患者该研究的重点是120名在指数结肠镜检查期间切除至少一个结直肠病变多0 mm并在10-18个月后接受监测结肠镜检查的患者。所有结直肠腺瘤都是散发的，而不是所有病例中的家族性腺瘤。120名患者的队列
6、包括74名男性和46名女性，年龄 在34至75岁之间，平均为61岁，中位数为64岁。根据有效的WHO标准（世界卫生组织肿瘤分类，2010年）以及切除方法和根治性，从所有患者收集了详细的临床，内 窥镜，组织病理学和实验室数据，包括性别，诊断时的年龄，数量，大小，位置，形态类型和病变发育不良的程度。该研究符合世界医学协会赫尔辛基宣言的伦理标准。所有患者都签署了知情同意书，以提供他们的临床数据以及用于 分子分析的生物样本。该研究已获得捷克共和国布拉格军事大学医院伦理委员会的批准（协议编号108/9-59/2016）,研究方案 在ClinicalTrials.gov注册，编号为：NCT03434925
7、。对于获得的所有数据，所有个人识别信息均已根据欧盟法规2016/679 （通 用数据保护法规）删除。索引和监测结肠镜检查在军事大学医院胃肠内窥镜科进行结肠镜检查和监测。在指数结肠镜检查中发现的所有之10 mm的病变（无论其他组织 病理学特征如何）均被视为指示性病变，并使用整体切除术（内镜下息肉切除术、内镜下黏膜切除术或内镜黏膜下清扫术）一 体切除。在指数结肠镜检查期间发现的其他病变被认为是同步病变。在指数结肠镜检查后10-18个月进行监测结肠镜检查。在 监测结肠镜检查中发现的所有腺瘤都被认为是超时腺瘤。23例如组织病理学分析在军事大学医院病理学系进行。将每个指数病变垂直切成2-7局部，并在福尔
8、马林固定和石蜡包埋后进行 照片记录。其他病变（同步和超时性）用标准程序治疗。所有福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）阻断都提供给分子遗传学实验室。分子遗传学分析提供所有指示性病变（每个切成27个石蜡块）和同步病变（每个切成15个石蜡块）进行分子异质性分析。在指数病变 的情况下，将每个石蜡块进一步分成更小的局部，以便分析的组织样品的总体积对应于最大5mm3为了尽可能详细地捕捉肿 瘤内异质性。同步病变的分析不太彻底-每个石蜡块被分成体积约为20 mm的样品3.根据制造商的说明，使用Gen Elute FFPE DNA纯化试剂盒（Sigma,美国密苏里州圣路易斯）从每个样品中提取DNA。根据COSMIC
9、的癌症体细胞突变目录，使用包含11个靶热点突变区域的小组对DNA进行突变分析13。具体而言, 它是4PC外显子15 -突变簇区域（MCR） , 丁尸53外显子5-8, KR4S外显子2,尸/K3C4外显子9和8R4F外显子15。突变 测定的细节在前面描述过14。该分析使用基于PCR的方法进行，具有异源双重体形成，然后通过ABI Prism 3100 （应用生物 系统，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）的最正确温度下变性毛细管电泳（DCE）进行别离，如前所述15。该技术允许高度灵敏地检测 超过非突变等位基因的少量突变等位基因。使用基因标记可视化异质双链分析结果。根据得到的电泳图，从峰高确定单 个突变等位基
10、因的百分比，如上图所示15。25异时腺瘤中TP53突变的检测与同步病变类似，将超时腺瘤分成体积约为20 mm的样品3并且使用与上述相同的技术在每个样品中对7P53基因的 外显子5, 6, 7和8进行突变分析。26异质性确实定根据各指示性病变所有样本中单个突变等位基因的数量和百分比，根据表1确定指示性病变的异质性程度。突变局部百分 比的差异等于突变百分比最低和最高百分比的病变局部之间的差异。例如，如果KWS突变存在于给定指数病变的三个样本中， 分别为4%, 13.5%和18%,那么突变局部的差异为14%。如果病变中存在2个或更多突变克隆（发现2个或更多不同的突变）， 那么使用突变分数百分比差异最
11、高的克隆来确定异质性程度。定义了三种程度的突变分数差异： 表1 ,确定指数病变的异质性程度。最高一最低百分比V 35%低差最高一最低百分比 35% 70%最高一最低百分比 35% 70%中等差异最高一最低百分比2 70%高差统计分析对一组具有所有可用输入变量的患者进行统计分析，以确定超时腺瘤的发生与指数病变的突变特征或异质性程度之间的相 关性。对指数结肠镜检杳期间切除的病变的突变特征与超时腺瘤发生率之间关系的统计分析进一步扩展为包括同步病变。显示 超时腺瘤发生的生存曲线通过Kaplan-Meier方法估计。通过对数秩测试和根据年龄和性别调整的Cox比例风险模型对曲线进行 比拟，以估计风险比。p
12、值0.05被认为具有统计学意义。数据在Stata/IC14软件（StataCorp, College Station, TX, USA） 中处理。2 .结果监测结肠镜检查结果在120名患者中，52名（43%）在监测结肠镜检查中没有病变。在其余68名患者中，15名（22%）患有增生性息肉， 53名（78%）患有腺瘤（8名晚期和45名非晚期）。大多数腺瘤（39；74%）是小型腺瘤，只有14 （26%）腺瘤大于5毫米。 未发现结直肠癌。32指数和同步病变的突变分析在120例患者中，11例患者具有1个以上的指示性病变-4例患者具有2个病变，4例患者具有3个病变，1个患者具 有4个病变，2个患者具有5个
13、病变。因此，共分析了 143个指数病变（1325个样本）。在来自83名患者的104个指数病变 中获得了所有样本的完整突变谱。每个病变中突变克隆的数量各不相同（见表2）。所有83例患者指数病变突变分析的详细结 果和结肠镜监测结果见补充表S1O表2.在104个指数病变和80个同步病变中发现的突变克隆数量。在具有76个指数病变的66例患者中，成功测定了所有样本中突变分数的百分比，并允许确定给定病变内的异质性程度。 因此，病变分为5度异质性，具有以下表现形式：I级（A/=29;38%） , II级（A/=14;18%）,川级（A/=5;7%） , IV级（N = 15;20%）和V级（N= 13;17
14、%） o在17名患者的其余28个病变中，不可能量化所有样本中突变局部的百分比，从而可靠地 确定异质性程度。在这组66例患者中，39例患者具有同步病变（共84例，分为117个样本）。在4例患者的4例同步病变中，由于DNA 降解，无法进行突变分析。有关更多详细信息，请参阅图1中的流程图。在具余80个病变中发现的突变数量总结在表2中。在任何病变中发现不超过2个突变。120 patients underwent index colonoscopy with en-blodc removing of all lesions 10 mm (index lesiorvs)图1 .用于详细表征指数和同步结直肠
15、病变的工作流程方案。统计分析在同一组66例患者中，有36例患有超时性腺瘤。对超时腺瘤的发生与指数病变的突变特征以及异质性程度之间的关系 进行了统计分析。在指数病变中7P53基因的外显子7中存在突变与次时腺瘤的发生之间的关系被证明是有统计学意义的（p = 0.003,对数等级检验;风险比2.73, 95%可信区间1.14-6.56）,见图2。0200400600800图2.在指数病变中发现的7P53基因外显子7突变作为超时腺瘤的预测因子。Kaplan-Meier生存曲线:观察到的事件-在TP53 基因外显子7突变的患者中，在监测结肠镜检查中检测到腺瘤。丁尸53基因外显子7突变见于8例患者的8个指
16、数病变，均有异时腺瘤。有趣的是，这组患者中没有一个超时腺瘤有任何 TP53突变。有关详细信息，请参阅表3。其他测试的变量，包括肿瘤抑制因子，癌基因，单个基因，基因位点（包括其他TP53 外显子），以及指数病变的异质性程度，未被证明是超时期腺瘤风险的统计学上显着的预测因子。表3,在指数病变中7P53基因外显子7突变的患者的特征。在指数结肠镜检查期间，对66例患者中发现的一组所有病变（指数病变+同步病变）进一步进行了突变谱与超时期腺瘤 发生率相关性的统计分析。该分析证实了原始分析的所有结果。由于在66例患者中任何一例的同步病变中均未发现7P53基因 外显子7突变，因此指数病变中存在的7P53基因外
17、显子7突变与超时期腺瘤发生之间的统计学显着关系未被修改。3 .讨论结直肠癌前病变的突变数量已被证明与癌相同（如果不是更高）16, 17, 18。此外，癌前病变突变的频率和分布在其发 展为恶性肿瘤方面起重要作用19。因此，存在一个问题，即指数病变的详细突变谱是否有助于识别病变复发高风险的患者。在这项研究中，通过对同一病变的许多区域进行系统采样和遗传分析，对突变异质性进行了详细分析。所使用的方法在三 个方面是独特的。首先，检查索引结肠镜检查期间发现的所有210mm的病变。其次，只能通过整体切除切除来切除指数病变; 因此，标本保存在一块中。该过程与瘢痕局部复发的风险低至零相关。第三，对患者进行监测性
18、结肠镜检查，时间间隔比平时 短-从10个月到18个月不等，重点是早期异时腺瘤的存在。在指数病变中发现的突变克隆数量各不相同，但大多数情况下，在一个指数病变中发现一个（在42%的病变中），没有 （26%）或两个（17%）突变克隆。同步病变中突变克隆的存在正如我们预期的那样较低-其中55%未检测到突变，其余病变 主要有1个突变（37.5%）,最多有2个突变（7.5%）。这是由于与同步病变相比，指数病变的更晚期。在病变的不同部位，病变部位的不同数量和不同的百分比中发现了突变。为了更容易地定位突变异质性，确定了一定程度 的异质性，其中考虑了“总突变负荷”，即突变克隆的数量及其在病变不同局部的百分比。突
19、变数量越高和/或突变等位基因百分 比的差异越大，异质性程度越高。然而，令人惊讶的是，在指数病变的异质性程度与超时腺瘤的早期发作之间未发现统计学关 系。这似乎取决于特定突变的存在，而不是“突变负荷工结果显示，丁尸53基因外显子7的突变在统计学上与超时腺瘤的风险相关，因此在指数病变中携带这种突变的患者可能具 有更高的早期超时性腺瘤发生的风险。在监测结肠镜检查期间，所有8个都检测到腺瘤。在这组患者中，在我们的研究中，我 们没有观察到与其他/无突变的患者在病变异型增生的数量/大小/程度方面有任何明显的差异。事实上，所有8名丁尸53外显子7 突变的患者在这方面都非常多样化，除了在短时间内发生超时腺瘤外，
20、我们没有观察到太多的共同点。因此，7P53基因本身的 外显子7突变似乎使个体易发生超时腺瘤，但机制或方式尚不清楚。例如，7P53基因外显子7的突变可能是由某种影响超时性 病变生长的一般分子缺陷引起的。或者，也许加53基因外显子7的突变与患者的生活方式之间存在联系，其中这种突变的发 现以及超时腺瘤的发生可能是相同的不健康行为的表现。有趣的是，7P53基因其他测试外显子的突变以及一般7P53基因的突 变并不是超时腺瘤发生的统计学上显着的预测因子。我们意识到我们研究的可能局限性。问题在于，在指数病变中小53外显子7突变患者的监测结肠镜检查中发现的腺瘤是 快速增长的异时病变还是指数结肠镜检查遗漏的间隔
21、病变。在我们纳入的66例患者的队列中，在其中36例患者中发现了 1年 结肠镜监测中此类后续腺瘤（54.5%）,这与最近发表的另一项研究一致20。这些腺瘤被发现的位置与指数病变不同，因此它 们不被认为是切除后瘢痕中的局部残留肿瘤形成（LRN）。此外，在原始指数病变中，没有一个超时腺瘤检测到不芍3外显子7 突变。然而，问题仍然是这种突变是否会在更晚期的腺瘤中出现。在监测结物镜检查中，对早期异时性病变和可能的间期散发 性结直肠肿瘤进行完全可靠、无可争辩的区分既困难又苛刻。为了解决这个问题，选择较短的索引和监测结肠镜检查之间的间 隔（建议1年而不是3年）。小型息肉（大小5 mm）最有可能是早期异时病变
22、。晚期息肉（？10mm大小）可能是指数结肠 镜检查遗漏的间期病变。我们没有发现任何间歇性结直肠癌。我们研究的另一个可能限制是，我们没有考虑组织病理学以及左 侧和右侧肿瘤，因为亚组在适当评估的受试者数量上是不对称的。应该进一步强调的是，我们的分析是在相当小的样本量下进 行的。在整套104个指示性病变和80个具有完全突变谱的同步病变中，7P53基因外显子7突变仅见于8例患者的8个指数病 变中。因此，有必要考虑到样本量越大可能产生不同结果的可能性。肿瘤抑制基因TP53是12种主要癌症类型中突变频率最高的基因21。7p53基因的产物p53蛋白是一种细胞应激激活的 序列特异性转录因子，可调节基本细胞过程
23、中的基因表达22。绝大多数7P53突变发生在DNA结合结构域保守区域的外显子5-8中，并导致稳定突变蛋白的形成，该突变蛋白失去其肿瘤抑制活性，例如诱导细胞周期停滞，细胞凋亡，衰老或DNA修复。此外，突变蛋白通常获得额外的致癌功能，为细胞的生长、侵袭性和存活提供益处22, 23, 24o关于结直肠癌，先前的工作说明，7P53基因突变发生在癌变的早期，并且与从低级别异型增生腺瘤向高度异型增生的转 变以及从腺瘤向癌的转变有关25, 26, 27o我们在之前的研究中证实了这一事实，在该研究中，我们检测到7p53基因突变在 早期和晚期癌中的发生率是晚期腺瘤的3倍以上28。过去也有人提出，力53基因不同区
24、域的突变可能对p53蛋白功能有不同 的影响，因此在结直肠癌患者中具有不同的预后意义29, 30o外显子5突变的患者似乎比外显子8突变的患者预后更好30 或729。然而，我们没有发现任何提及在特定外显子中具有突变的个体易患肿瘤复发。对于结直肠癌前病变，据我们所知，尚未进行一项研究，研究指数病变中7P53基因突变与次时病变发生率的关系，因此 这项工作的结果是独一无二的。JuGrez等人的一项研究提出了类似的结果，但对于KR4s基因的突变31。然而，在这项研究 中，我们没有证实指数病变中KR4S基因突变的存在与异时腺瘤风险之间的关系。Speroni等人的一项回顾性研究描述了结直肠腺瘤中p53蛋白表达
25、与复发或共存腺瘤风险的关联，但该研究是在与我们的 设计不同的设计中进行的32。他们使用免疫组织化学检测来检测突变蛋白p53,这是基于这样一个事实，即虽然野生型p53以 低浓度存在于健康细胞中，但突变的p53蛋白经常过度表达并积聚在肿瘤细胞核中33, 34o这种积累是由于激活某些靶基因 （例如MDM2）表达的能力受损，MD/V/2介导了反响回路中蛋白酶体中p53的降解35。在Speroni研究期间，在79名患者的 100个FFPE内镜下切除的散发性结肠腺瘤样本中，由于丁尸53基因突变引起的p53蛋白积累被免疫组织化学测定，并与先前 腺瘤/癌或共存腺瘤的发生相关。获得的数据清楚地说明，p53蛋白表
26、达是这方面的危险因素，因为52.5%的p53表达腺瘤的患 者（无论发育不良的程度如何）既往有腺瘤/癌或共存腺瘤。然而，鉴于核p53的过表达有时可以在没有突变的情况下发生，反 之亦然36, 37,因此有必要对结果进行仔细的解释。尽管如此，我们希望在未来的研究中解决Speroni的研究结果，该研究将 侧重于详细确定超时病变的突变异质性及其与指数和同步病变的关系。我们还想集中解释7P53基因外显子7中风险突变的具 体位置（不包括其他外显子），这尚未与结直肠腺瘤/癌一起描述，并且可能与例如患者的某种生活方式有关。4 .结论我们的研究利用结直肠指数病变突变负荷的广泛分析，发现7P53基因外显子7突变与超时腺瘤风险之间存在统计学上的 显着关联。我们研究的结果可能导致对监测结肠镜检查的现有建议的调整，可能是在具有这种特定突变的患者中。在这组患者 中，可以考虑缩短监测间隔，以降低随访时间延长后出现晚期肿瘤的风险