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1、第 1 章 绪 论 一、实验的目的、要求和实验室规则（一）实验目的 1通过实验过程的操作和观察，验证理论教学的内容、加深和扩充对所学知识的理解。2通过对各种组织切片、模型、电镜照片和实物标本的观察（看见，看清），达到能正确辨认正常的组织、主要器官以及重要的微细结构和细胞（看懂），学会辨认方法，理解平面和立体的关系（看透，即洞察）。熟悉人体发生的基本过程、主要器官系统的发生概况和一些常见的先天性畸形。3通过各种实际操作，学会运用比较、分析和综合的科学方法，培养严谨求实的科学态度和耐心细致的科学素质，培养科学思维特别是多尺度思维（看开）、科学地分析问题和解决问题的能力。通过实验过程的操作和做作业，
2、进行本学科的基本技能训练，例如光学显微镜的使用，用文字或绘图学会准确、系统地描述观察的对象。（二）实验要求 1实验前对照教学进度表，做好每次实验课前的预习，以了解本次实验的目的和具体内容，并针对实验内容复习相关的理论课内容。2实验课应带教科书、实验指导、教学大钢、教学进度表、作业本、绘图铅笔（普通 HB 铅笔和红蓝铅笔）、橡皮擦和直尺等。3实验时要集中注意力，认真听好带教老师的课前交待，对照实验指导、结合教科书中的有关插图进行观察和思考。4认真做作业，按时完成。5.了解初步的管理技能，如切片的整理和交接。6 不迟到、不早退。实验时，不得任意离开实验室。爱护公物，严格遵守中南大学实验室规则和本实
3、验室规则。（三）实验室规则 1保持实验室安静和整洁，不得在室内喧哗、打闹和吸烟。禁止随地吐痰、乱扔纸屑秽物、禁止在实验台、显微镜以及切片盒等处乱写乱画。进入实验室必须穿戴整齐，不得穿拖鞋、背心进入实验室。2按安排的座位就座，按指定号码使用显微镜和切片盒，不得擅自拿用他人的显微镜或切片，不得擅自拆卸和更换显微镜的部件。每次课前查看切片盒内切片，是否有缺失或破损，并用手机拍照。3损坏或丢失显微镜、切片、模型等或显微镜出现故障均应立即报告老师，酌情处理。4实验完毕，将切片按号码插入切片盒，并把显微镜和切片盒放回原处。每次课后清理切片盒内切片，是否有缺失或破损，并用手机再次拍照。将课前/课后拍照的切片
4、盒照片发电子邮件至教师指定的电子邮箱。如.5值日生负责打扫卫生，关好水、电灯和门窗。二、光学显微术 光学显微镜是精密的贵重仪器，是实验课的主要工具，能否熟练地使用，直接影响实验效果。先了解显微镜构造，学会正确而熟练地使用及妥善地保护。（一）光学显微镜的构造（图 0-1）图 0-1 数码光学显微镜的构造 1 目镜（推拉式双目镜筒（内置摄像系统）：目镜放大倍数一般为 10（放大 10 倍）。2拉杆：拉出拉杆，可使镜下图像呈现到讲台的计算机。3物镜转换器旋转盘：上接镜简，下嵌接物镜，可以旋转以更换物镜。4物镜（接物镜）：可分低倍镜（10）、高倍镜（40）、油镜（90或100）。（显微镜放大倍数目镜放
5、大倍数物镜放大倍数）。5粗调焦轮（粗调节器）：用于低倍镜焦距的调节。6微调焦轮（细调节器）：用于高倍镜焦距的调节。7载物台调节轮：调节载物台的高、低。8白平衡开关：白平衡就是让白色所成的像依然为白色，如果白是白，那其他景物的影像就会接近人眼的色彩视觉习惯。调整白平衡的过程叫做白平衡调整。9调光旋钮：调节光源灯的亮度。10.光标调节手轮：调节视野中的绿色指示光标。11.载物台：放切片的平台，中有圆孔。台上有推片器和片夹。12.聚光器：位于载物台下，可上、下移动。内装虹彩光圈，可开大和缩小。可调节视野的明暗。13.光源灯：提供视野内的光源。14.RCA 接口：RCA 是 Radio Corpora
6、tion of American的缩写词，因为 RCA接头由这家公司发明的。RCA 俗称莲花插座，可传送音、视频信号。15.CCD 开关：CCD，英文全称：Charge-coupled Device，中文全称：电荷耦合元件。可以称为 CCD 为图像传感器，CCD 能够把光学影像转化为数字信号。16.电源开关：为显微镜电源的总开关。此外，显微镜与桌面接触的部分是底座，支撑起推拉式双目镜筒的是镜臂。（二）光学显微镜的使用方法 1.观察前的准备 1.1.检查：镜座右侧的调光旋钮(图位 9)是否在“0”的位置，即顺时钟方向旋到光线最暗时的最低位置。1.2.开机：打开镜座后面总电源开关（图位 16）绿色
7、按钮。打开镜座后面 CCD 电源开关(图位 15)红色按钮，拉出拉杆。即先绿后红。1.3.白平衡调节：不放切片，在物镜（图位 4）（10）下用调光旋钮(图位9)将光源调到（89 刻度）的亮度，然后轻按住镜座右边的白平衡按钮（图位 8，红色）35 秒。2.观察时操作 2.1 放切片：用调光旋钮(图位 9)将光源调节到合适观察的亮度（56 刻度），用粗调节轮（图位 5）使载物台（图位 11）下降，放上切片，再将物镜（图位 4）升至观察位置。2.2.视度补偿：调节推拉式双目镜筒（图位 1）上的横拉板，使双目镜下的图像重合在一起。此刻横拉板上的数字若是“64”，该数值就是自己的瞳孔距离。然后将目镜外侧
8、的刻度调整到“64”的位置。如果此步骤操作不正，视野内的绿色光标（用光标调节手轮（图位 10）控制）将出现重影。2.3.调焦：利用粗调节轮（图位 5），将载物台（图位 11）上升至离物镜（图位 4）0.5cm，然后边观察，边用粗调节轮（图位 5）使载物台（图位 11）下降至物象出现，再用 微调节轮（图位 6）调至物象清晰。3.观察完毕后的操作 3.1.载物台（图位 11）下降，取下切片放入切片盒。3.2.将镜座右侧调光旋钮(图位 9)调到最低位置，即“0”刻度。3.3.先关掉镜座后面 CCD 电源开关(图位 15)红色按钮，再关掉镜座后面总电源开关（图位 16）绿色按钮（即先红后绿）。3.4.
9、显微镜恢复到休息状态，套上显微镜防尘罩。（三）光学显微镜使用的注意事项及保护 1如果需要搬动显微镜，搬动时慎拿轻放。2如果使用的是单目显微镜，观察时应同时睁开两眼。右手书写者，以左眼从接目镜观察、以右手操纵粗、细调节器。用右眼和右手配合进行绘图或文字描述。3 显微镜必须经常保持清洁。机械部分可用纱布或绸布擦净；光学部分（反光镜除外）只能用擦镜纸轻轻拭擦，严禁用手或其它物品擦拭、以防污损。4油镜使用后，应立即用擦镜纸沾少量清洗剂（通常用乙醚酒精或二甲苯）将镜头擦净（通常用擦镜纸连续擦 3 次）。5显微镜部件不得拆卸或互相调换。若有故障，应立即报告老师进行处理，不得自行修理。6显微镜用毕，应将接物
10、镜转离载物台中央的圆孔，并上升载物台，放回原处。7打扫实验室卫生前，必须将显微镜套上防尘罩或放入柜中，以免灰尘沾污。（四）石蜡切片标本的制作过程（见图 0-2）图 0-2 石蜡切片标本的制作过程 光学显微镜下观察的切片，通常采用的是石蜡包埋组织块，然后切成薄片，经 HE 染色后封片而成，具体过程如下。1取材和固定：根据需要取出人或动物的新鲜组织。其大小 0.51.0cm3。立即投入固定液固定 624 小时。固定的主要目的是使组织内蛋白质凝固。以保持原来的形态结构。常用的固定液有以下几种：10中性福尔马林（Formalin）：最常用。Zenkers 液。Bouins 液。2脱水和包埋：普通固定液
11、多为水溶液，必须先脱去组织内水分，为浸蜡创造条件。脱水剂通常是酒精，从低浓度至高浓度的酒精处理，去净组织内水分。然后用二甲苯替代出酒精，组织块浸入二甲苯后逐渐变得透明。再将组织块置入溶解的石蜡，使石蜡浸入组织并替换出二甲苯。最后将组织块包埋到石蜡内，使组织产生一定的硬度，便于切片。3切片：用切片机将组织切成 56 微米厚的薄片。把切下的薄片粘于附有甘油蛋白的载玻片上，置温箱中烤干。4染色：染色的目的是使组织内不同的结构染上不同的颜色，以利显微镜下观察。染色的方法很多，应根据研究目的选用。组织学和病理学教学标本最常用的是苏木精-伊红染色法（Hematoxylin-Eosin Stain，简称 H
12、E 染色）。HE 染色是一种复合染色法。苏木精配制后是碱性染料，可使组织中的酸性物质如胞核内的染色质、细胞质内的核蛋白体、软骨内的基质和粘液等染成紫蓝色。它们对碱性染料亲合力强称为嗜碱性。伊红是酸性染料，可使组织中的碱性物质如细胞质的普通蛋白质、核仁和胶原纤维等染成粉红色。它们对酸性染料亲和力强称为嗜酸性。染色的步骤先是将切片放入二甲苯使石蜡脱净，然后经酒精（从高浓度至低浓度）入水，再用苏木精和伊红分别染色。5脱水和封固：染色后的切片经酒精（由低浓度至高浓度）脱水，二甲苯透明。再在切片上滴加适量树胶，将盖玻片放在树胶上，待干后即可观察和长期保存。（五）光镜下观察切片应注意的问题 1注意切片的染
13、色法。常用的 HE 染色法只能显示组织的一般结构，不能显示组织的所有结构，某些结构或成分需用特殊染色法或组织化学方法等才能显示，例如网状纤维、肥大细胞、嗜银细胞、网织红细胞、高尔基复合体及线粒体等。2要全面、系统地观察切片。先用肉眼观察切片标本，熟悉标本的大体形态，寻找要观察的大致部位。然后用低倍镜观察标本的全貌，结构层次或组织分布，并选择典型结构，再转高倍镜进一步观察。3建立细胞、组织和器官的立体概念。在一张切片上，往往能够观察到细胞和组织不同部位和方向的断面。同一种细胞、组织和器官，通过不同部位和方向的切面，所显示的形态和结构常不相同。因此，一般要求观察到细胞或组织的纵切面与横切面，并尽可
14、能观察到不同部位和其它方向的切面。然后将不同切面的形态特点加以分析、综合，获得一个正确而完整的立体概念。一个器官通常只观察一种方向的断面，故要将平面像转化为立体像，更需多加思考。下面是一些结构在不同断面上的各种形态（图 0-3,0-4,0-5）。图 0-3 鸡蛋的四种断面 在鸡蛋一端横切，通过 A 断面，显示圆形，没有蛋黄。在鸡蛋中部横切，通过 B 断面，显示圆形，并有蛋黄。在鸡蛋一侧纵切，通过 C 断面，显示椭圆形，没有蛋黄。在鸡蛋中部纵切，通过 D 断面，显示椭圆形，并有蛋黄。图 0-4 弓形结构的四种断面 通过 A 平面，显示椭圆形，只切到管壁，不显示管腔。通过 B 平面，显示椭圆形，并
15、有管腔。通过 C 平面，显示倒 8 字形，呈现 2 个管腔。通过 D 断面，呈现倒 U 形。图 0-5单层柱状上皮的四种断面 通过 A 平面，只切到上皮细胞顶部，显示多边形结构，没有细胞核。通过 B 平面，即上皮细胞的垂直断面，上皮细胞呈高柱状，细胞核从基底面到游离面为单层。此为单层柱状上皮的典型断面。通过 C 平面，即沿细胞核平面作水平切面，呈现成堆的细胞核。通过 D 断面，即斜切，上皮细胞核从基底面到游离面有 2 层细胞核。4善于运用比较、分析和综合的方法，提高辨认能力。在组织标本中，有些细胞、组织和器官的形态类似，例如中性粒细胞与嗜酸性粒细胞、复层鳞状上皮与变移上皮、致密结缔组织与平滑肌
16、组织、骨骼肌与心肌组织、淋巴结与脾脏、小肠与结肠、三种唾液腺与胰腺、甲状腺与哺乳期乳腺、子宫增生期与分泌期、舌与体皮等。应对其进行认真比较，以掌握各自的结构特点。5理论和实际相联系。有时切片所见与理论描述不完全一致，其原因可能A B C D 是组织或器官所处的生理状况不同所致，例如腺细胞在分泌前和分泌后，它们的形态往往有改变；可能是取材于动物，动物与人的组织形态或多或少存在差异，例如大白鼠的肥大细胞较人的大，猪的肝小叶界限较人的清楚，狗、猫小肠腺的潘氏细胞甚少或没有，甲状旁腺无嗜酸性细胞，兔、猫卵巢的间质腺较人的发达；可能是制片过程中引起的人工假象，例如固定剂致使组织的变形（细胞形态改变，细胞
17、间隙增大），福尔马林或重铬酸钾等固定剂未除尽，使组织中出现不规则的黑色结晶沉淀物；取材不及时或组织有病变，细胞发生肿胀、核固缩，胞质显空泡，甚至有寄生虫等；切片刀有缺口，造成组织发生纵行裂痕；或浸蜡时间过长，组织脆硬，易产生不规则裂纹；贴片时未充分展开，组织重叠形成深染的条索状结构，等等。因此，当标本出现与理论描述的形态不同时，应认真分析思考。6.主要人工假象。在切片观察时要注意切片制作过程中可产生一些人工假象。如切片组织重叠（图 0-6）、刀痕（图 0-7）、染料沉渣（图 0-8）、气泡（图0-9）、人工空腔或空隙（图 0-11）等。此外，要考虑切片存放过程中的褪色（图0-12），最容易褪色
18、的结构是嗜碱性结构（蓝色），其蓝色变浅或灰色，与实习指导描述的颜色不符合。图 0-6 切片组织重叠 箭头所指为重叠的组织，颜色较未重叠的组织处更深。图 0-7 刀痕 箭头所指出现了组织缺失，为切片刀有缺口留下的刀痕。图 0-8 染料沉渣 箭头所指的黑色处，为染料沉渣。左图为低倍镜下的较大沉渣；右图为高倍镜下的细小颗粒样沉渣，不要把这些现象看成是组织或细胞固有的结构。图 0-9 气泡 箭头所指的小黑圈，是气泡。在封片时，因盖玻片和载玻片之间的气体残留所致。图 0-11 人工空腔或空隙 白箭头所指为软骨陷窝，是软骨细胞在切片制作时皱缩所致。黑箭头所致为结缔组织中的基质，在切片制作时基质流失，留下空
19、白。图 0-12 褪色 脊髓的多极神经元，左侧图片胞质中有蓝色的块状尼氏体，右侧为蓝色的尼氏体褪色。三、电子显微术 电子显微镜较光学显微镜，具有分辨率高，因而放大倍率高等优点，能观察到细胞内更微细的结构，既超微结构。主要有透射电镜、扫描电镜等技术。（一）透射电镜（图 0-12）的成像原理及标本制作特点 图 0-12 透射电子显微镜 电镜的成像与光镜不同，它是用电子束代替普通光线，用电子发射器（电子枪）代替光源，用电磁场对运动的电子的作用达到聚焦和放大的目的。其分辨率可高达 0.2nm左右，能放大几十万倍。电子枪中有用钨丝制成的阴极，阴极对面有一阳极。两极之间加有高电压，当灯丝有电源通过时，钨丝
20、内的电子就发射出来，在高电压作用下，飞奔向阳极。通过阳极中央的小孔成束地射出，经过电磁透镜聚焦，到达标本上。根据被检物的性质、密度和厚度不同，一部分电子受阻或散射，形成相应的影像。电镜的影像实际为一些电子信号，不能用肉眼直接观察，而是射到荧光屏上，因此我们看到的图像是由明暗反差构成的图像。如将电子影像照射到照像干板或胶卷上，即可制成电镜照片，成为长久记录。用于电镜观察的标本，要比普通光镜的标本薄得多，一般为 5070nm，即超薄切片。标本制作过程也要经过取材、固定、脱水等过程，与光镜标本制作类似，只是要求更高些、更严些；包埋剂常用硬度更大的环氧树脂。用超薄切片机制备切片，然后以重金属盐进行染色
21、，目的在于增强细胞结构间的反差，因为重金属盐不为电子所穿透，当它与组织或细胞的不同成分出现不同的亲和力时，所结合的重金属盐的量就有所不同，电子的通过率也有相应的差别，因而即呈现出明暗反差的图像。常用的是醋酸铀和枸橼酸铅。（二）扫描电镜（图 0-13）的成像原理及标本制作特点 图 0-13 超高速扫描电子显微镜 扫描电镜的成像是由于电子枪发射出带有一定能量的电子，经过电磁透镜的会聚和物镜的聚焦后，形成一束极细的电子束，称为电子探针。当电子探针中的电子（第一次电子）打在观察样品的表面时，会把样品表面原子的外层电子打落（叫第二次电子）。如果让电子探针沿着整个样品表面一点挨一点地移动，扫描正个样品表面
22、，那么就会依次产生代表整个样品表面形态的二次电子信号。在样品旁有一个二次电子探测器接收二次电子信号。经过二次放大后在荧光屏上显示图像。这样就得到反应样品表面形态的影像，也可制成电镜照片。用扫描电镜观察的标本，不需要做超薄切片，只需把要观察的组织或器官进行固定，为保持其生活状态，再用特制的临界点干燥器进行干燥，并在其表面喷镀一层重金属（如铂），以增加二次电子，这样即可在扫描电镜下观察和拍照了。扫描电镜与透射电镜比较，具有视场大，图象富于立体感、真实，样品制作过程简单等特点，但要观察细胞内部的超微结构仍以透射电镜为优。（三）电镜图片的分析 经过重金属盐染色的超薄切片，在透射电镜下观察时，被重金属盐
23、深染的部位，由于电子通过率低，荧光屏上显得暗，图像较黑，即为电子密度高，反之则为电子密度低。电镜图片上的图案是微细结构上电子密度高、低分布的体现。从微细结构能否重金属盐相结合的角度，通常将能与重金属盐相结合的特性称为正染色；还有些结构不能与重金属盐相结合，而其周围的背景却染上重金属盐，该特性称为负染色。图 0-14 线粒体和粗面内质网透射电镜图 重金属浸染呈黑色的结构，称电子密度高；重金属浅染的部分称电子密度低。可见线粒体（黄色标记）、粗面内质网（青色标记）等。图 0-15 肝血窦扫描电镜图（伪彩）红色为红细胞，黄色为血小板，青色为枯否氏细胞（肝巨噬细胞）。分析电镜照片时应着重观察下列内容：1
24、细胞膜和细胞外形：（1）细胞膜结构是否清晰，细胞表面是否光滑，有无微绒毛、突起或纤毛等结构；（2）有无胞膜内陷所形成的小泡、小管或内褶等；（3）相邻细胞之间有无连接结构；（4）细胞与细胞间质的关系及间质内有无纤维等结构。2细胞质：（1）膜性结构的细胞器（如线粒体、内质网、高尔基复合体、溶酶体、微体等）的形态、数量及分布，膜结构是否完整，细胞器内部基质的电子密度等；（2）非膜性结构的细胞器（如微丝、中间丝、微管、中心体等）的数量及分布；（3）包含物（如糖原颗粒、脂滴、分泌颗粒等）的数量、分布及结构；（4）特殊结构如板层小体等。3细胞核：（1）细胞核的大小、位置、形态及染色质分布情况；（2）双层核
25、膜是否完整清晰，核周腔的宽窄；（3）核孔的多少及结构；（4）异染色质与常染色质的数量及分布；（5）核仁的数量、大小及结构。4观察扫描电镜图像时应着重表面结构及整体、立体关系等。5在观察上述内容时，应将形态特点与机能状态紧密地联系起来，以结构为基础去解释或推测其所处的功能状态；有些尚可与光镜结构进行联系。四、绘图 绘图是组织学实验的重要环节，认真观察组织切片后，准确绘出简图，加深对组织结构的理解，便于复习记忆，绘图时要注意各部结构之间的大小比例关系，一般用红、蓝铅笔描绘常规染色的切片，用红色表示结构嗜酸性，用蓝色表示结构嗜碱性，注意色调的深浅，笔道均匀，正确反映镜下的结构特点，图中注字要规整，引线要平行，最后在图下注明标本名称、放大倍数和染色方法。神经组织 取材：人脊神经节 染色：HE 放大倍数：40 日期 /指导老师 （中南大学湘雅医学院组胚学系 伍赶球）版权所有，未经许可，不得擅自转载和传播。