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1、 课题 1 微生物的实验室培养 一、培养基 1 培养基的类型及其应用：2、琼脂是从红藻中提取的_多糖_，在配制培养基中用作为_凝固剂_ _。3、培养基的化学成分一般含有_水_、_无机盐_、_碳源_、_氮源 _ 四类营养成分。培养基成分还需满足微生物生长对_pH_、_特殊营养物质_、氧气_等要求。4、牛肉膏和蛋白胨主要为微生物提供_碳源、氮源、维生素_ _ _ 等营养物质。5、培养乳酸杆菌时需要添加_维生素_ ，培养霉菌时需要将培养基 pH调节为_酸性_ _ ，培养细菌时需要将 pH 调节为 _中性或微碱性_ _ 。标准 培养基类型 配制特点 主要应用 物理性质 固体培养基 加入凝固剂较多 菌种
2、分离,鉴定,计数 半固体培养基 加入凝固剂较少 菌种保存 液体培养基 不加入凝固剂 工业生产，连续培养 化学组成 合成培养基 由已知成分配制而成，培养基成分明确 菌种分类、鉴定 6、培养基的配制原则：目的 要明确：根据培养的微生物种类、培养的目的等确定培养基的类型和配制量。营养 要协调：培养基中各种营养物质的浓度和比例要适宜。pH 要适宜：细菌培养基 pH呈 中性或微碱性 性，霉菌培养基呈酸性。二、无菌技术 1获得纯净培养物的关键是 防止外来杂菌的入侵 。2、无菌技术包括：（1）对实验操作空间、操作者的衣着和手进行 清洁和消毒 ；（2）将培养器皿、接种用具和培养基等器具进行 灭菌 ；（3）为避
3、免周围微生物污染，实验操作应在 酒精灯火焰附近_ _ 进行；（4）避免已灭菌处理的材料用具与_周围物品_ 相接触。3、比较消毒和灭菌（填表）4、无菌技术除了防止培养物被污染外，还具有的目的是_有效避免操作者自身被微生物感染和污染环境_。5、消毒方法：（1）日常生活经常用到的是_煮沸_ 消毒法；（2）对一些不耐高温的液体，则使用_巴氏_ 消毒法；温度 70-75 比较项 理化因素的作用强度 消灭微生物的数量 芽孢和孢子能否被消灭 消毒 较温和 部分微生物 一般不能 灭菌 强烈 所有微生物 能 养合成培养基由已成分配制而成培养基成分明确菌种分类鉴定化学组成琼脂是从红藻中提取的多糖在配制培养基中用养
4、物质氧气等要求牛肉膏和蛋白胨主要为微生物提供碳源氮源维生素等营养物质培养乳酸杆菌时需要添加维生素培养微生物种类培养的目的等确定培养基的类型和配制量营养要协调培养基中各种营养物质的浓度和比例要适宜要适宜细煮 30 分钟 时间，或者 80 煮 C15分钟 （3）对接种室、接种箱或超净工作台首先喷洒 _ 石炭酸或煤酚皂_ _ 等溶液以增强消毒效果，然后使用 _ 紫外线照射 30 分钟_ 进行物理消毒。（4）实验操作者的双手使用_酒精_进行消毒；（5）饮水水源用_氯气_进行消毒。6、灭菌方法：（1）接种环、接种针、试管口等使用_灼烧_灭菌法；（2）玻璃器皿、金属用具等使用 干热 灭菌法。（3）培养基、
5、无菌水等使用 高压蒸汽 灭菌法，所用器械是 _ 高压蒸汽灭菌锅_ 。（4）表面灭菌和空气灭菌等使用_紫外线_ 灭菌法。7、对接种环灭菌时要用酒精灯的 _充分燃烧_ 层火焰灼烧可能伸入试管或培养皿的部位。8、利用干热灭菌箱对玻璃器皿灭菌时物品不能摆得太挤，目的是 避免影响热空气流通 9、物品装入高压蒸汽灭菌锅灭菌后，要首先打开排气阀，煮沸并排除锅内冷空气，其目的是_让锅内温度迅速升高_ _ ；随后关闭排气阀继续加热，气压升至 _100k_ Pa，温度为_121_C_ ，并维持 _15-30 分钟_；最后切断热源，使温度自然降温，气压务必降至_零_ 时打开锅盖，其目的是防止_容器内的液体会冲出容器
6、，造成污染_。_ _ 三、大肠杆菌的纯化培养 1、包括：制备培养基 和 纯化大肠杆菌 两个阶段 2制备牛肉膏蛋白胨固体培养基 步骤：2.1 计算 ：根据配方比例，计算 100mL培养基各成分用量。养合成培养基由已成分配制而成培养基成分明确菌种分类鉴定化学组成琼脂是从红藻中提取的多糖在配制培养基中用养物质氧气等要求牛肉膏和蛋白胨主要为微生物提供碳源氮源维生素等营养物质培养乳酸杆菌时需要添加维生素培养微生物种类培养的目的等确定培养基的类型和配制量营养要协调培养基中各种营养物质的浓度和比例要适宜要适宜细 2.2 称量 ：准确称取各成分。称取牛肉膏和蛋白胨时动作要迅速 ，目的是 防止吸潮 。23 溶化
7、 ：加水加热溶化 牛肉膏 ；加入蛋白胨和氯化钠继续加热；加入 琼脂 ；整个过程不断用玻棒搅拌，目的是 防止琼脂糊底而使烧杯破裂 用蒸馏水定容到 100mL。24 调 pH ：用 1mol/LNaOH溶液调节 pH至 中性或微碱性 。25 灭菌 ：将 配 制 好 的 培 养 基 转 移 到 锥 形 瓶 中，加 塞 包 扎 后 用 高 压 蒸 汽 灭 菌 锅 灭菌；所用培养皿用报纸包扎后用 干热灭菌箱 灭菌。26 倒平板 ：待培养基冷却至 50 C 左右时在酒精灯 火焰附近 操作进行。其过程是：在 酒精灯火焰旁 右手拿锥形瓶，左手拔出棉塞；右手拿锥形瓶，使锥形瓶的瓶口 迅速通过火焰 ；左手将培养皿
8、打开一条 稍大于瓶口的缝隙 ，右手将培养基倒入培养皿，立刻 盖上皿盖 。待平板冷却凝固后，将平板 倒过来 放置。平板倒置的目的是_既可以防止皿盖上的冷凝水落入培养基，又可以避免培养基水分过快的挥发_。3、纯化大肠杆菌 1）微生物接种的最常用方法是_平板划线法_和_稀释涂布平板法_，另外还有_斜面接种_和_穿刺接种_等。养合成培养基由已成分配制而成培养基成分明确菌种分类鉴定化学组成琼脂是从红藻中提取的多糖在配制培养基中用养物质氧气等要求牛肉膏和蛋白胨主要为微生物提供碳源氮源维生素等营养物质培养乳酸杆菌时需要添加维生素培养微生物种类培养的目的等确定培养基的类型和配制量营养要协调培养基中各种营养物质
9、的浓度和比例要适宜要适宜细2）平板划线法：通过 接种环 在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种 逐步稀释分散 到培养基表面。数次划线培养后，分离到单个菌落。其操作步骤是：将接种环在酒精灯火焰上灼烧直至 接种环 烧红 。在 火焰旁 冷却接种环，并打开大肠杆菌的菌种试管的棉塞。将菌种试管口通过火焰。将 已 冷却 的接种环伸入到菌液中取出一环菌种。将菌种试管口再次通过火焰后塞上棉塞。将皿盖打开一条缝隙，把接种环伸入平板内划 35 条_平行线_线，盖上皿盖，不要划破培养基。灼烧 接种环，冷却后从第一区划线 末端 开始向第二区域内划线。重复上述过程，完成三、四、五区域内划线。注意不要将第五区的
10、划线与第一区划线 相连 。将平板 倒置 放在培养箱中培养。取菌种前灼烧接种环的目的是_避免接种环上可能存在的微生物污染培养物_；除第一次划线外，其余划线前都要灼烧接种环的目的是 杀死上一次划线后残留在接种环上的菌种 ，使下一次划线时接种环上的菌种直接来源于上一次划线的末端 ；取菌种和划线前都要求接种环冷却后进行，其目的是 防止高温杀死菌种 ；最后灼烧接种环的目的是 杀死接种环上残留菌种，防止污染环境 和感染操作者 在第 1 次划线后都从上次划线末端开始的目的是_划线后，线条末端的细菌数目比起始处要少。每次从上一次末端开始划线，能够使细菌数目随着划线次数的增加而逐渐减少，最终分散成单个菌落_。3
11、）稀释涂布平板法：将菌液进行 一系列的梯度稀释，并将不同稀释度菌液分别涂布到琼脂固体培养基上进行培养。当稀释度足够高时，聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞，即可获得单个菌落 养合成培养基由已成分配制而成培养基成分明确菌种分类鉴定化学组成琼脂是从红藻中提取的多糖在配制培养基中用养物质氧气等要求牛肉膏和蛋白胨主要为微生物提供碳源氮源维生素等营养物质培养乳酸杆菌时需要添加维生素培养微生物种类培养的目的等确定培养基的类型和配制量营养要协调培养基中各种营养物质的浓度和比例要适宜要适宜细系列稀释操作：取盛有 9mL 水的 灭菌试管 6 支，编号 101、102、103、104、105、106。用灭菌的移
12、液管吸取 1mL 菌液注入编号为 101 试管中，并吹吸 3 次，使菌液和水分充分混匀。从 101 倍液中吸取 1mL 菌液注入到编号为 102 试管内吹吸均匀，获得 102 倍液。依此类推。4）操作中试管口和移液管应在离火焰 1-2cm 处。整个操作过程中使用了 1 支移液管。涂布平板的操作：将涂布器浸在盛有 酒精 的烧杯中，取少量菌液（不超过 0.1mL），滴加到培养基表面，将沾有少量酒精的涂布器在火焰上 引燃 ，待酒精燃尽后，冷却 8-10s，用 将菌液均匀的涂布在培养基表面。涂布时可 转动培养皿 ，使菌液分布 均匀 。注意：培养未接种培养基：作用是 对照 结果：若无菌落产生 则，培养基
13、制备成功，可以使用；若有菌落产生 ，则培养基灭菌不彻底。四、菌种保藏：1、频繁使用的菌种利用 临时保藏 法保存，利用 固体斜面 培养基培养后，保存在 4C 冰箱中，每 36 个月转种培养一次。缺点是保存时间不长 ，容易 被污染或产生变异 ；2、长期保存菌种的方法是甘油管藏 法。将菌种与无菌体积等量甘油 混合后保存 在 -20 冷冻箱中。课题 2 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 一、筛选菌株 1、科学家能从热泉中把耐热细菌筛选出来是因为 _热泉的高温条件淘汰了绝大多数微生物 _ _ _ _ 。2、原理：人为提供有利于目的菌株 生长的条件（包括_营养、温度、PH_ 等），同时 抑制或阻止 其他微
14、生物生长。3、选择培养基是指允许 特定种类 微生物生长，同时 抑制或阻止 养合成培养基由已成分配制而成培养基成分明确菌种分类鉴定化学组成琼脂是从红藻中提取的多糖在配制培养基中用养物质氧气等要求牛肉膏和蛋白胨主要为微生物提供碳源氮源维生素等营养物质培养乳酸杆菌时需要添加维生素培养微生物种类培养的目的等确定培养基的类型和配制量营养要协调培养基中各种营养物质的浓度和比例要适宜要适宜细其他微生物生长的培养基。4、尿素是一种重要的氮肥，农作物_不能_（能，不能）直接吸收利用，而是首先通过土壤中的细菌将尿素分解为 氨 和 CO2 ，这是因为细菌能合成 脲酶 。方程式：5、对分离的菌种作进一步的鉴定，还需要
15、借助_生物化学_的方法。6、在细菌分解尿素的化学反应中，细菌合成的_脲酶_将尿素分解成了_氨和 CO2_。氨会使培养基的碱性_增强_，PH_ 升高_。因此，我们可以通过检测培养基_pH_变化来判断该化学反应是否发生。7、在以_尿素_为唯一氮源的培养基中加入_酚红_指示剂。培养某种细菌后，如果 PH升高，指示剂将变_红_，说明该细菌能够 _ 分解尿素_。二、统计菌落数目 1、在统计菌落数目时，常用来统计样品中活菌数目的方法是_稀释涂布平板法_。除此之外，_显微镜直接计数法_ 也是测定微生物数量的常用方法。细菌的数目还可以通过 滤膜法 来测定。2、测定饮水中大肠杆菌数量的方法是将一定体积的水用细菌
16、过滤器过滤后，将滤膜放到_伊红美蓝_培养基上培养，大肠杆菌菌落呈现_黑_色，通过记述得出水样中大肠杆菌的数量。你认为在该实验中至少应取_3_个水样。3、采用稀释涂布平板法统计菌落数目时，培养基表面生长的一个菌落，来源于 _ 样品稀释液中的一个活菌_ _ 。通过统计_平板上的菌落数_ _ ，就能推测出样品中大约含有多少活菌。为了保证结果准确，一般选择菌落数在 _30-300_ 的平板进行计数。4、从平板上的菌落数推测出每克样品中的菌落数的计算方法是 _（平均菌落数涂布的稀释液体积）稀释倍数。5、利用稀释涂布平板法成功统计菌落数目的关键是_恰当的稀释度_ 。6、统计的菌落数比活菌的实际数目 _ 低
17、_。这是因为当 两个或多 个细胞在一起时，平板上观察到的只是 _ 一个_ 菌落。因此，统计结果一般用_菌落数_ 来表示。7、设置对照的主要目的是排除_实验组_中_非测试_因素对养合成培养基由已成分配制而成培养基成分明确菌种分类鉴定化学组成琼脂是从红藻中提取的多糖在配制培养基中用养物质氧气等要求牛肉膏和蛋白胨主要为微生物提供碳源氮源维生素等营养物质培养乳酸杆菌时需要添加维生素培养微生物种类培养的目的等确定培养基的类型和配制量营养要协调培养基中各种营养物质的浓度和比例要适宜要适宜细实验结果的影响，提高实验结果的_可信度。_。三实验设计 1、实验设计的内容包括实验方案、材料用具、实施步骤和时间安排等
18、。22 根据图示 27 填写以下实验流程：3 土壤微生物主要分布在距地表 38cm 的近中性土壤中，约 7080为细菌 4 分离不同的微生物采用不同的稀释度，其原因是不同微生物在土壤中含量不同，其目的是保证获得菌落数在 30300 之间、适于计数的平板。细菌稀释度为 104、105、106，放线菌稀释度为 103、104、105，真菌稀释度为 102、103、104。5 培养不同微生物往往需要不同培养温度。细菌一般在3037培养 12d，放线菌一般在 2528培养 57d，霉菌一般在 2528的温度下培养 34d。6 在菌落计数时，每隔 24h 统计一次菌落数目。选取菌落数目稳定时的记录作为结
19、果，以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。7 菌落的特征包括形状、大小、隆起程度、颜色等方面。8 实验过程操作提示 1）取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要_灭菌。2）应在火焰旁称取土壤 10 g。将称好的土样倒入盛有 90mL 无菌水的锥形瓶中，塞好棉塞。3）在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行。4）实验时要对培养皿作好标记。注明培养基种类、培养日期、稀释度、培养物等。5）为了提高效率，在操作时更加有条不紊，应当事先制定计划。土壤中尿素分解菌的分离与计数 分离筛选微生物的原理 有利于目的菌株生长 抑制或阻止其他微生物生长 人为 微生物计数方法与原理 稀释涂布平板法 显微
20、镜直接计数 对照设置与重复设置 菌落计数 配制土壤溶液 系列稀释 涂布平板与培养 养合成培养基由已成分配制而成培养基成分明确菌种分类鉴定化学组成琼脂是从红藻中提取的多糖在配制培养基中用养物质氧气等要求牛肉膏和蛋白胨主要为微生物提供碳源氮源维生素等营养物质培养乳酸杆菌时需要添加维生素培养微生物种类培养的目的等确定培养基的类型和配制量营养要协调培养基中各种营养物质的浓度和比例要适宜要适宜细 课题 3 分解纤维素的微生物的分离 一、纤维素和纤维素酶 1 纤维素是一种由葡萄糖首尾相连而成的高分子化合物，是含量最丰富的多糖类物质 2、棉花 是自然界中纤维素含量最高的天然产物。3、纤维素酶的作用：纤维素酶
21、是一种 复合 酶，一般认为至少包括三种组分：C1酶、Cx 酶 和葡萄糖苷酶 4、证明纤维素酶作用的实验：在一支试管中添加 纤维素酶 ，另一支试管 不加 纤维素酶 ；都加入滤纸和 醋酸醋酸钠缓冲液 缓冲液，用量 不 同，维持 相 同的pH=4.8 。5、1 个酶活力单位是指在温度为 25 ，其它反应条件 最适宜 情况下，在 1 min 内转化 1mmol 的底物所需要的酶量。二、筛选纤维素分解菌 1筛选纤维素分解菌的方法是 刚果红染色法 。该方法可以通过 颜色 反应直接筛选。2原理是：刚果红可以与纤维素形成红色复合物，当纤维素被纤维素酶分解后，红色复合物无法形成，出现以纤维素分解菌为中心的透明圈
22、，我们可以通过纤维素 纤维二糖 葡萄糖 C1酶、Cx酶 葡萄糖苷酶 养合成培养基由已成分配制而成培养基成分明确菌种分类鉴定化学组成琼脂是从红藻中提取的多糖在配制培养基中用养物质氧气等要求牛肉膏和蛋白胨主要为微生物提供碳源氮源维生素等营养物质培养乳酸杆菌时需要添加维生素培养微生物种类培养的目的等确定培养基的类型和配制量营养要协调培养基中各种营养物质的浓度和比例要适宜要适宜细是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。三实验设计 1：完成实验方案流程图 2、实验流程中“选择培养”的培养基类型是 液体选择培养基。原因是培养基组分中 没加凝固剂 。该培养的目的是 增加纤维素分解菌的浓度 培养基选择作用机制是以纤
23、维素粉为唯一碳源，只有纤维素分解菌才能生存 。6、为了确定分离得到的是纤维素分解菌，还需要进行 发酵产纤维素酶 实验，纤维素酶的发酵方法有 液体 发酵和 固体 发酵。7、纤维素酶测定方法是对纤维素酶分解滤纸等纤维素所产生的 葡萄糖 含量进行定量测定。选择培养 梯度稀释 涂布到 鉴别纤维素分解菌 培养基上 土壤取样 挑选 产生透明圈 的菌落 养合成培养基由已成分配制而成培养基成分明确菌种分类鉴定化学组成琼脂是从红藻中提取的多糖在配制培养基中用养物质氧气等要求牛肉膏和蛋白胨主要为微生物提供碳源氮源维生素等营养物质培养乳酸杆菌时需要添加维生素培养微生物种类培养的目的等确定培养基的类型和配制量营养要协调培养基中各种营养物质的浓度和比例要适宜要适宜细