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1、人体显微形态学技术综合内容第1 页，本讲稿共23 页一、动物取材（一）动物处死要求：动作迅速，及时解剖、取材与固定动作迅速，及时解剖、取材与固定第2 页，本讲稿共23 页（二）（二）动物处死动物处死的方法：的方法：可采用麻醉法、空气栓塞法、颈椎脱臼或断头、动脉放 可采用麻醉法、空气栓塞法、颈椎脱臼或断头、动脉放血等。血等。1 1、狗用麻醉法或击头法、狗用麻醉法或击头法22、猫用窒息法、猫用窒息法33、兔用栓塞法、兔用栓塞法44、小白鼠用断颈法、小白鼠用断颈法第3 页，本讲稿共23 页（三）动物取材选择 根据实验要求首先选择动物种类，其次选择组织部位及取材的大小，取材时应熟悉组织器官的结构特点。
2、1、动物选择2、部位选择3、切面方向选择第4 页，本讲稿共23 页（四）取材要求1、新鲜2、小而薄 1.5cm1.5cm 0.5cm 3、保持原有的形态4、注意环境温度的影响5、刀、剪要锋利第5 页，本讲稿共23 页二、动物组织固定（一）（一）固定的目的和意义：固定的目的和意义：防止离体组织、细胞自溶与腐败，保持组织、细胞与生活时相似的形态和结构；防止离体组织、细胞自溶与腐败，保持组织、细胞与生活时相似的形态和结构；使细胞内的蛋白质、脂肪、糖、酶等各种成分转变成不溶性物质，使其保持原有的结构；使细胞内的蛋白质、脂肪、糖、酶等各种成分转变成不溶性物质，使其保持原有的结构；使组织中的各种物质沉淀、
3、凝固后产生不同的折射率，形成光学上的差异，以便染色后易于 使组织中的各种物质沉淀、凝固后产生不同的折射率，形成光学上的差异，以便染色后易于观察和鉴别；观察和鉴别；固定剂有硬化作用，可增加组织硬度，便于制片；固定剂有硬化作用，可增加组织硬度，便于制片；保存抗原及 保存抗原及DNA DNA、RNA RNA，特别是准备用于做免疫组化染色和核酸原位杂交的标本，及，特别是准备用于做免疫组化染色和核酸原位杂交的标本，及时而恰当的固定尤其重要。时而恰当的固定尤其重要。第6 页，本讲稿共23 页（二）动物组织取材与固定1、成年家兔栓塞法处死 取下列组织 心肌 心肌（心脏乳头肌）入（心脏乳头肌）入ADFADF液
4、液 中固定 中固定24h 24h骨骼肌（舌肌）入骨骼肌（舌肌）入中性甲醛的固定液中性甲醛的固定液液中固定液中固定24h24h 神经节（颈胸椎处）入 神经节（颈胸椎处）入高尔基体固定液高尔基体固定液 中固定 中固定18h 18h脊髓（颈胸椎处）入脊髓（颈胸椎处）入2%2%的硝酸银水溶液 的硝酸银水溶液 中固定 中固定每班两只每班两只 两组同学完成。两组同学完成。第7 页，本讲稿共23 页2、成年猫窒息法处死 取下列组织神经节（颈胸椎处）入神经节（颈胸椎处）入高尔基体固定液高尔基体固定液中固定中固定脊髓（颈胸椎处）入脊髓（颈胸椎处）入2%2%的硝酸银水溶液的硝酸银水溶液中固定中固定卵巢卵巢 入入中
5、性甲醛固定液中性甲醛固定液中固定中固定膈肌膈肌入中性甲醛固定液中性甲醛固定液中固定 每班壹只每班壹只 两组同学完成两组同学完成第8 页，本讲稿共23 页3、一月龄家兔栓塞法 栓塞法 处死 处死 取肋间肌 取肋间肌，剪成 剪成0.2cm0.2cm 0.2cm0.2cm 见方的肌肉颗粒（共 见方的肌肉颗粒（共 剪 剪100 100颗）。颗）。取剪好的肌肉组织入蚁酸溶液中固定 取剪好的肌肉组织入蚁酸溶液中固定15min 15min 左右，呈半透 左右，呈半透明状即可。明状即可。不经水洗，直接放入 不经水洗，直接放入1%1%的氯化金水溶液中浸染 的氯化金水溶液中浸染15-60min 15-60min
6、左 左右，肉眼观察见肌肉组织呈金黄色即可，如已成棕色表明浸 右，肉眼观察见肌肉组织呈金黄色即可，如已成棕色表明浸染过度，所以应随时观察。染过度，所以应随时观察。将已经还原好的肌肉组织用蒸馏水涤数次，放在滤纸上将 将已经还原好的肌肉组织用蒸馏水涤数次，放在滤纸上将组织上的水分沾干，再转入甘油酒精（甘油一份，组织上的水分沾干，再转入甘油酒精（甘油一份，50%50%酒精 酒精一份）中保存备用。一份）中保存备用。第9 页，本讲稿共23 页4、小白鼠 断颈法 断颈法处死处死 取小肠，用生理盐水将肠道内清洗干净，取小肠，用生理盐水将肠道内清洗干净，剪成 剪成2cm 2cm 长的 长的小段，小段，入入Reg
7、aud Regaud 固定液 固定液中固定中固定 第10 页，本讲稿共23 页线粒体切片标本的制作1 1、取材、取材：小白鼠小肠或肝 小白鼠小肠或肝2 2、固定：、固定：入 入Regaud Regaud 固定液 固定液 固定 固定2 2 天（每天需更换一次固定液）天（每天需更换一次固定液）3 3、媒染、媒染：入：入3%3%重铬酸钾水溶液中媒染 重铬酸钾水溶液中媒染7 7 天（每两天更换一次新 天（每两天更换一次新液）液）4 4、冲洗：、冲洗：先用自来水冲洗 先用自来水冲洗24 24 小时，然后用蒸馏水浸洗数次。小时，然后用蒸馏水浸洗数次。第1 1 页，本讲稿共23 页5、脱水透明：在酒精中从低
8、浓度到高浓度依次脱水，100%以下的浓度每次1 小时，在100%酒精中2 次，每次30 分钟，转入二甲苯2 次透明，每次30 分钟。6、浸蜡包埋：等量二甲苯与软蜡1 次，软蜡1次，硬蜡1 次，每次30 分钟，用纸盒或金属包埋盒包埋。（包埋时注意切面方向）第12 页，本讲稿共23 页7、切片贴片烤片：载玻片上涂少许蛋白甘油，切片厚度2-4微米，在贴片容器中贴片，入37。C 恒温箱中烘烤24 小时。8、脱蜡入水：二甲苯2 次，每次10min,100%酒精中2 次,每次5min,100%以下的浓度每次2min，下行至蒸馏水。9、媒染：入5%铁明矾水溶液中媒染24 小时（37。C 恒温箱中）。10、染
9、色：蒸馏水速洗后入苏木精染液中染色24 小时。第13 页，本讲稿共23 页11、分色：蒸馏水速洗后入2.5%铁明矾水溶液中分色，数秒后，显微镜下镜检，见细胞核和线粒体呈黑色，细胞质呈无色或灰色即可。此步骤非常关键，一定要不间断镜检。12、返蓝：自来水浸泡数小时13、脱水透明：与第8 步骤（脱蜡入水）相反方向操作即可。14、镜检封固：镜下检查，染色合格的切片滴1 滴中性树胶，盖上盖玻片。放入凉片盒中。第14 页，本讲稿共23 页高尔基体切片标本的制作1、取材：猫或兔的神经节2、固定：入高尔基体固定液固定8-18 小时3、冲洗：用蒸馏水速洗2 次。4、镀银：入2%硝酸银水溶液中镀银48 小时（室温
10、下、避光）5、冲洗：用蒸馏水速洗2 次6、还原：入硝酸银还原液中24 小时第15 页，本讲稿共23 页7、冲洗：用蒸馏水速洗2 次8、脱水透明：在酒精中从低浓度到高浓度依次脱水，100%以下的浓度每次40 分钟，在100%酒精中2 次，每次20 分钟，转入二甲苯2 次透明，每次20 分钟。9、浸蜡包埋：等量二甲苯与软蜡1 次，软蜡1次，硬蜡1 次，每次20 分钟，用纸盒或金属包埋盒包埋。第16 页，本讲稿共23 页10、切片贴片烤片：载玻片上涂少许蛋白甘油，切片厚度3-6微米，在贴片容器中贴片，入37。C 恒温箱中烘烤24 小时11、脱蜡入水：二甲苯2 次，每次10min,100%酒精中2 次
11、,每次5min,100%以下的浓度每次2min，下行至蒸馏水。12、调色：入1%氯化金水溶液中2 小时第17 页，本讲稿共23 页常规组织切片制作（HE 染色）组织切片的染色方法很多，最常用的是HE 染色法，该方法适用于人体或动物多种组织，对任何液体固定的组织和各种包埋的切片均可使用，所以，HE 染色法显微制片技术的基本方法。第18 页，本讲稿共23 页1、取材：动物多种组织（如：大动脉、大静脉、腹腔AV 伴行处、疏松结缔组织、膀胱、鼻腔上皮组织、胃、睾丸、输精管、体皮、脑垂体、大脑皮质、卵巢 等）2、固定：入中性甲醛固定液中固定24 小时3、冲洗：自来水冲洗时间24 小时。4、脱水透明：在酒
12、精中从低浓度到高浓度依次脱水，100%以下的浓度每次2 小时，在100%酒精中2 次，每次1.5 小时，转入二甲苯2 次透明，每次1.5 小时。第19 页，本讲稿共23 页5、浸蜡包埋：等量二甲苯与软蜡1 次，软蜡2次，硬蜡2 次，以上各级每次1-1.5 小时，用纸盒或金属包埋盒包埋。6、切片贴片烤片：载玻片上涂少许蛋白甘油，切片厚度6-8微米，在贴片容器中贴片，入37。C 恒温箱中烘烤24 小时。第20 页，本讲稿共23 页7、脱蜡入水：二甲苯2 次，每次10min,100%酒精中2 次,每次5min,100%以下的浓度每次2min，下行至蒸馏水。以下程序按教材材要求进行。注意事项：在0.5
13、%的盐酸酒精中分色过程中，数秒后，必须要在显微镜下镜检，见细胞核呈蓝色，细胞质呈无色或灰色即可。此步骤非常关键，一定要不间断镜检。第21 页，本讲稿共23 页神经元纤维切片的制作1、取材：猫或兔的脊髓2、固定：入2%硝酸银水溶液固定3-6d，避光,35。C 恒温箱中。3、冲洗：用蒸馏水速洗2 次。4、还原：室温入硝酸银还原液24 小时。5、冲洗：用蒸馏水速洗2 次6、脱水：入100%酒精脱水24 小时第22 页，本讲稿共23 页7、浸蜡包埋：等量二甲苯与软蜡1 次，软蜡2次，硬蜡2 次，以上各级每次1-1.5 小时，用纸盒或金属包埋盒包埋8、切片贴片烤片：载玻片上涂少许蛋白甘油，切片厚度6-8微米，在贴片容器中贴片，入37。C 恒温箱中烘烤24 小时。9、脱蜡镜检：二甲苯中脱蜡，镜检封片。第23 页，本讲稿共23 页