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1、基因工程 基本原理及技术基因克隆(genecloning)：是指目的基因与载体DNA 连接构成的DNA 重组体在受体细胞内进行复制、扩增（也包括目的基因的无细胞扩增-PCR）的技术。基因表达(geneexpression)：是基因的转录、转译过程，也就是遗传信息从核酸到蛋白质的传递和实现。基因工程（geneengineering）或称重组DNA 技术（recombinantDNAtechnique）：是指将获取的目的基因片段在体外与载体DNA 通过人工剪切、编接构成DNA 重组体，将其导入受体细胞并使之无性繁殖（称之为“克隆”）和 表达，这种有目的的应用分子克隆技术,人为的改造基因,改变生物的
2、遗传性状的系列过程,总称为基因工程.基因工程基本步骤目的DNA 制备；载体DNA 选择DNA 体外重组技术（DNA 酶切实验、连接实验）重组DNA 的转化（转染）试验 重组克隆的筛选与鉴定（重组体的表型筛选，指纹图谱法，PCR 方法，探针杂交法）目的基因表达产物的筛选与鉴定（遗传互补法，免疫化学法Western 印杂交法，微细胞法(microcellmethod)图l 基因工程操作流程一.基因克隆(一)“工程原料”的获取-获取目的基因基因工程的原料就是目的基因。所谓目的基因，是指已被或欲被分离、改造、扩增和表达的特定基因或DNA 片段，能编码某一产物或某一性状。获取目的基因有三个途径：1.从生
3、物基因组中分离纯化（鸟枪法shotgun）：原核细胞DNA 遗传背景不清。组建基因文库 检测鉴定。2.人工合成：依照某一蛋白质的氨基酸序列，即可按密码子推算出其基因的核苷酸序列，随后应用化学合成法，就可在短时间内合成目的基因。用于结构清楚、分子量较小的基因3.酶促合成法-反向转录法：这种方法主要用于分子量较大而又不知其序列的基因.mRNA 逆转录cDNA 做目的基因。可PCR 法合成。Principle of PCRDNA polymerase use single strand DNA as template to synthesize new DNA in vitro,(dNTP;Buff
4、er;Mg2+,Primers)Chain reaction:Repeated cycles of reaction under the same condition.The PCR reactionAnnealPrimers45-68CtemplatePrimers,dNTPs,Taqpolymerase,Mg2+ExtendPrimers72CDenature95CWhat do we achieve by cycling temperature in the presence primers,dNTP,Taq polymerase?Round1AnnealprimersExtendpri
5、mersThe exponential amplification of the gene in PCRThe first 4 cycles of a PCR reaction in detail.In the 3rd cycle two double strands of the right length are copied(the forward and reverse strand are the same in length).In the 4th cycle,8 double strands of the right length are copied.Optimum condit
6、ion of PCRCorrectsourcesoftemplateDNABesttemperatureselectinthreestepsAppropriateprimersinbothendOthers:Mg2+;Inhibitoretal.Primer Design Is Vital1.Primers should usually be 18-25 bases long2.Need as much sequence information as possible outside target3.3 end of primer is most important:best to have
7、G or C at end4.Primers should have approximately equal melting temperatures5.Avoid repetitive sequence(internal hairpin structures)6.Aim for 40-60%G+C content7.Avoid complementarities within or between primers8.Can modify 5 ends to add restriction sites etcTA Cloning Of PCR Products Requires“A”sA AP
8、CRproductpGEM-TpCR2.1-TOPOTaq-yesPfu-noTypical Reaction Mixture25 or 50l in a micro Eppendorf(0.5ml)tubeCOMPONENT VOLUME FinalConcentration10PCRbuffer 5l 110dNTPs(2mM)5l 200MForwardprimer(10pmols/l)5l 1M(50pmols/50l)Reverseprimer(10pmols/l)5l 1M(50pmols/50l)GenomicDNAtemplate 2l 1gThermostablepolyme
9、rase(2U/l)0.5l 1unitH2O(to50lFinalvolume)27.5lThe Perfect ResultReliable PCR form every Sample(二)、载体载体(Vector)是目的基因的运载工具，其作用是将目的基因带入受体细胞中，并使目的基因扩增和表达。载体应具备下列条件：(1)有复制起点，能自我复制；(2)具有高效调控表达系统；(3)对某一种限制酶只有一个切点；(4)必须有一种选择性遗传标记；(5)携带外源基因的幅度宽；(6)分子量小，拷贝数多.载体的种类按来源分：质粒载体(plasmidvector)原核、噬菌体载体(phagevector)原
10、核、柯氏质粒载体(cosmidvector)真核、病毒载体(virusvector)真核.按作用分：克隆载体(cloningvector)、表达载体(expressionvector)、穿梭载体(shuttlevector)1.质粒载体:(1)分子量较小,在细菌中有较多的拷贝数。(2)松驰型:质粒复制与染色体不同步和蛋白质合成功能无关。(3)具有一个以上的标志，便于筛选。(4)具有数个或一个单一的酶切点。天 然 的 质 粒 不 能 具 备 以 上 所 有 条 件，所 以 实际 应 用 的 都 是 人 工 构 建 的 质 粒，其 中 最 常 用 的是pBR322，pUC19。AmprLacZor
11、iop2.噬菌体载体野 生 型 噬 菌 体(Wildtypephage，wt)DNA 长度 约 为48.5kb(分 子 量3.2107)，在 病 毒 颗 粒 中 为 双链 线 形 分 子，具有12bp的粘性末端(cohesiveend)，进入大肠杆菌之后立即互补成环。入噬菌体作为克隆载体有两个优点：1)转染效率高:可 在 体 外 包 装，产 生 有 感 染 性 的噬菌体颗粒，每个颗粒都可能感染一个大肠杆菌.2)筛选程序简便:一定长度的噬菌体才能包装.现 改 建 的 载 体 类 型 有：插 入 型 载 体 如gt11;替 换型载体EMBL3、EMBL4。3.柯氏质粒或称粘尾质粒(cosmid)是
12、指含有入噬菌体粘性末端的杂种质粒。由入DNAcos 区与质粒重组建造而成.在宿主细胞中可以作为正常噬菌体进行复制，但不表达噬菌体的任何功能。cosmid 的构造特点:(1)含有抗药标志和复制起始部位。(2)一个或多个单一酶的限制位点(3)带有入噬菌体粘性末端。(4)分子小，约46kb，可容纳大至40-50kb 的外源DNA 片段。适用于构建真核细胞的基因文库特。另外，由于非重组体cosmid 很小，不能在体外包装,因此非重组体的本底很低，利于重组克隆的筛选。如cosmidpHC794病毒载体常用的动物病毒表达载体可分为两大类：整合型（integrated）载体即外源基因通过这种病毒载体与宿主细
13、胞的染色体整合，外源基因随宿主细胞基因组的复制而扩增。这类载体的代表是SV40 PSV 系列和逆转录病毒逆转录病毒表达载体pLPGHL、pMSV 等。游离型(transient)或称病毒颗粒型载体，这类载体携带外源基因后，本质上仍然是一种完整或缺损的病毒，能够以病毒颗的形式在宿主内自行复制或在辅助病毒存在下进行复制。这类载体有痘苗病毒、腺病毒、杆状病毒。5克隆载体(cloningvector)用 于 在 受 体 细 胞 中 进 行 目 的 基 因 扩 增 的载 体。一 般 具 有 较 低 的 分 子 量、较 高 的 拷 贝 数和 松 弛 型 复 制 子。主 要 由 细 菌 质 粒 或 与 其
14、它 质粒、噬 菌 体 及 真 核 生 物 病 毒 的DNA 重 组 构 建。常用载体pUC18pUC19.6表达载体(expressionvector)使 目 的 基 因在 宿 主 细 胞 中 得 以 表 达 的 载 体。可 将 重 组 体DNA 导 入 适 合 的 受 体 细 胞，使 所 载 荷 的 目 的 基因能够复制、转录和翻译。7穿梭载体(shuttlevector)又 称 双 功 能 载 体(bifunctionalvector)。能 在两种不同的生物体内复制和往来穿梭的载体.其 可 同 时 具 有细菌质粒的复制原点 和真核生物可识别的病毒复制原点或酵母菌的自主复制序列（ARS），它
15、 即 能 在 原 核 细 胞 中 扩 增 又 能 在 真 核细 胞 中 复 制 和 表 达。主 要 用 于 原 核 细 胞 与 真 核 细胞 之 间 进 行 基 因 转 移，通 常 是 将 载 体 和 待 克 隆 的真 核 生 物DNA 片 段 先 在 细 菌 中 克 隆，再 转 移 到 真核 细 胞 中 表 达，并 可 提 高 外 源 基 因 的 表 达 效 率。如pKSV一10、pJDB219 载体等。oriPoLacZkmram2（三）.限制性核酸内切酶限制酶是一种必不可少的工具酶，是进行DNA分子切割的特殊工具。因此它有“分子剪刀”或“分子手术刀”之称。1、概念：限制性核酸内切酶(re
16、strictionendonuclease)是指能专一地识别DNA 分子上特定的碱基序列并将DNA 切断的内切酶。2、识别序列的特点(1)专一；(2)常由46 个碱基组成；(3)具有回文序列(palindromicsequence)切口类型：(1)形成粘末端(cohesiveend)：DNA 分子末端的单链片段能与其他DNA 单链片段互补配对形成双链者，这两个DNA 分子末端单链片段即为粘末端：如BamH 5-GGATCC-33-CCTAGG-55-NNNNNN-GGATCC-NNN-33NNNNNN-CCTAGG-NNN-5（2）形成平末端；Sma CCCGGGGGGCCC4、酶切反应条件：
17、（1）需 要 合 适 的 底 物：底 物（DNA）纯 度要 高.不 能 含 有RNA 和 蛋 白 质;也 不 能 含 有 过高 的EDTA。更 不 能 含 有 酚、氯 仿、乙 醇、SDS 和其他有机试剂。DNA 的 浓 度 不 宜 过 高，高 浓 度 的DNA 会 使溶 液 的 粘 待 度 增 加 从 而 抑 制 酶 分 子 的 扩 散 导致 酶 切 反 应 不 彻 底。常 为 50ul 内 含 1ugDNA）（2）合 适 的 酶 量：酶 和 底 物 比 例210u/ugDNA,避免使用过高的酶浓度（3）合 适 的 反 应 介 质（缓 冲 体 系）：反 应 均以Tris-Hcl 作 缓 冲 液
18、；PH 值 多 在7.48.0 之 间；反 应 需 要Mg2+激 活；多 数 酶 反 应 尚 需 要2巯基 乙 醇（BME）或 二 硫 基 苏 糖 醇（DTT）的存 在。此 外，许 多 酶 反 应 还 需 要NaCl，但 不同的酶对NaCl 的需要量各有差别。（4）温度和作用时间等：大多数限制酶的反应温度为370C，个别酶则需要500C、600C 或650C 的高温。一般在适宜的缓冲液和温度条件下，每微克DNA 用15 单位的酶，保温12 小时。(四)DNA重组(连接)和基因转移1、DNA重组（DNArecombination）不同的DNA 片段之间的连接需要另一种工具酶-连接酶的帮助.目的D
19、NA 酶切片断载体DNA 酶切片断T4DNAligase DNA 重组体.T4DN 连接酶(T4DNligase):是从感染T4 噬菌体的E coli中分离得到的一种连接酶，其催化两个DNA 片段的3 一0H 与5 一P 末端形成磷酸二酯键。（1）粘末端连接(cohesiveendligate)：（a）目的基因和载体 用 同 一 种 限 制 酶 切 割 后连接。载体易自身环化。用 碱 性 磷 酸 酶(能 除 掉DNA-5 端P 基 团，使5端带一OH)处理载体，可防止载体自身环化。（b）目 的 基 因 和 载 体 用 两 种 产 生 粘 末 端 的 限 制酶 切 割 后 连 接，可 控 制 目
20、 的 基 因 的 插 入 方 向(定向克隆)。(2)平末端连接(bluntendligate)：目的基因和载体用同一种能产生平末端的酶切割后连接，重组后保留原来的酶切位点，如SmalCCC GGG所用酶量要大.连接反应条件连接酶的活性;DNA的纯度,载体与目的基因的比例;PH值7.2-7.8适宜;镁离子、DTT(二硫基苏糖醇,有促进连接作用);ATP；;14(不高于16)过夜。2、基因转移（genetransfer）把 重 组DNA 导 入 受 体 细 胞 进 行 扩增.根 据 所 用 载 体 的 特 性 选 择 适宜 的 受 体 细 胞 及 选 择 适 宜 的 转 化或 转 染 的 方 法。
21、(1)受体细胞：大肠杆菌E.coli（EK 系统）；优点:细菌细胞作为表达系统的优点是：操作简单、增代时间短、价格低廉。某些蛋白质的表达水平很高缺点:表达多肽分子常不能适当地折叠,蛋白质常无生物活性。异体蛋白质，常对细菌有毒性作用.缺乏真核细胞进行转录后修饰的酶，例如在蛋白质上加上磷酸根(phosphate)和糖基.枯草杆菌；酵母菌细胞；哺乳动物细胞；昆虫细胞。受体细胞应具备的主要条件是R-M-(限制酶和修饰酶缺陷)。受体菌处于感受态(2)转化(transformation)：以 质 粒DNA 为 载 体 构 成 的DNA 重 组 体 转 入受体细胞的方式称转化。制 备感受态细胞（compet
22、ent cell）：取 对数 生 长 期 菌 细 胞，用CaCl2(冰 冷)处 理，使 其 易于接受外源DNA。感 受 态 菌 与 重 组DNA 混 合 放 冰 浴40分 钟；42热 休 克2分 钟；(如 用AP 平 板 培 养 基 筛 选，需37培 养1小 时)；涂 到 含 有 抗 生 素 的 平 校 培养基上，37培养过夜。(3)转染(trasfection)以噬菌体或病毒为载体构建的DNA重组体导入受体细胞的方式称转染。选 用 受 体 细 胞 不 同，转 染 方 式 不 同。若 以大 肠 杆 菌 为 受 体 菌 转 染 重 组 噬 菌 体DNA 时，需要 用 噬 菌 体 的 包 装 蛋
23、白 进 行 体 外 包 装，形 成 有感 染 性 的 噬 菌 体 颗 粒，才 能 感 染 大 肠 杆 菌 受 体细 胞。以 哺 乳 动 物 细 胞 做 受 体 细 胞 时 用 磷 酸 钙转 染 技 术 和 电 穿 孔（electroportion）转 染 技 术直接转染重组体DNA。（五）克隆株的筛选与鉴定1.根据重组体的表型筛选抗性基因插入失活（负性选择法）pBR322；显色平板筛选法：如pUC19做载体(-互补）.LacZ-受体菌编码-半乳糖苷酶羧基端（C端）片断pUC载体编码-半乳糖苷酶氨基端（N端）的肽转化菌株含APr,X-gal和IPTG培养基菌落颜色pUC19rDNAZ基因失活、不
24、表达一半无色(白颜色)乳糖苷酶、Xgal不被分解pUC19DNAZ基因表达一半乳糖苷酶蓝色(自身环化）LacZopAPr2.检测目的基因（1）质粒DNA图谱或指纹图谱法(fingerprint）提取质粒DNA 直接电泳或用相应的内切酶消化后电泳，根据电泳带的数目、分子量大小分析确定。(2)PCR方法：提取重组质粒DNA，用已知的特异引物扩增，扩增产物进行凝胶电泳检测有无相应电泳带。（3）核酸杂交法(nucleic acid hybridization)：用已知的特异DNA探针（probe）与变性重组质粒DNA杂交。fig 2.P1.fingerpringt map ofrecombinatio
25、nplasmid1.MolecularStandard(SPP1DNA/EcoR1)2.pUC19 plasmid DNA digestedwithSalIandEcoR13.pUC19plasmidDNA4.Recombination plasmid DNAdigestedwithSalIandEcoR15.RecombinationplasmidDNA3.目的基因表达产物的筛选与鉴定表型筛选法当外援基因携带遗传标记转入受体细胞后，使受体细胞获得或缺失标记表形。遗传互补法使用受体菌是营养缺陷型,培养基是基础培养基,当目的基因在受体菌内表达时,受体菌的营养缺陷被纠正,因而在基础培养基上能生长.
26、免疫化学法该方法是用已知的抗体检查克隆菌株目的基因表达的蛋白抗原。如Westernblot 印迹杂交法：提取克隆菌株菌体蛋白SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳转印NC 膜特异抗体酶标抗抗体 酶底物观察特异显色带。噬菌斑形成筛选法当噬菌体载体包装外援重组DNA 即可形成活性噬菌体克力在培养板上形成噬斑，借此可以初筛。利用报告基因筛选转化细胞 用融合基因顺时表达系统将报告基因置于顺式调控因子下游，据报告基因活性衡量顺式调控因子的转录能力9、静夜四无邻，荒居旧业贫。5月-235月-23Saturday,May20,202310、雨中黄叶树，灯下白头人。19:12:3519:12:3519:125/20/20
27、237:12:35PM11、以我独沈久，愧君相见频。5月-2319:12:3519:12May-2320-May-2312、故人江海别，几度隔山川。19:12:3519:12:3519:12Saturday,May20,202313、乍见翻疑梦，相悲各问年。5月-235月-2319:12:3519:12:35May20,202314、他乡生白发，旧国见青山。20五月20237:12:35 下午19:12:355月-2315、比不了得就不比，得不到的就不要。五月237:12 下午5月-2319:12May20,202316、行动出成果，工作出财富。2023/5/2019:12:3519:12:3
28、520May202317、做前，能够环视四周；做时，你只能或者最好沿着以脚为起点的射线向前。7:12:35 下午7:12 下午19:12:355月-239、没有失败，只有暂时停止成功！。5月-235月-23Saturday,May20,202310、很多事情努力了未必有结果，但是不努力却什么改变也没有。19:12:3519:12:3519:125/20/20237:12:35PM11、成功就是日复一日那一点点小小努力的积累。5月-2319:12:3519:12May-2320-May-2312、世间成事，不求其绝对圆满，留一份不足，可得无限完美。19:12:3519:12:3519:12Sat
29、urday,May20,202313、不知香积寺，数里入云峰。5月-235月-2319:12:3519:12:35May20,202314、意志坚强的人能把世界放在手中像泥块一样任意揉捏。20五月20237:12:35 下午19:12:355月-2315、楚塞三湘接，荆门九派通。五月237:12 下午5月-2319:12May20,202316、少年十五二十时，步行夺得胡马骑。2023/5/2019:12:3519:12:3520May202317、空山新雨后，天气晚来秋。7:12:35 下午7:12 下午19:12:355月-239、杨柳散和风，青山澹吾虑。5月-235月-23Saturda
30、y,May20,202310、阅读一切好书如同和过去最杰出的人谈话。19:12:3519:12:3519:125/20/20237:12:35PM11、越是没有本领的就越加自命不凡。5月-2319:12:3519:12May-2320-May-2312、越是无能的人，越喜欢挑剔别人的错儿。19:12:3519:12:3519:12Saturday,May20,202313、知人者智，自知者明。胜人者有力，自胜者强。5月-235月-2319:12:3519:12:35May20,202314、意志坚强的人能把世界放在手中像泥块一样任意揉捏。20五月20237:12:35 下午19:12:355月
31、-2315、最具挑战性的挑战莫过于提升自我。五月237:12 下午5月-2319:12May20,202316、业余生活要有意义，不要越轨。2023/5/2019:12:3519:12:3520May202317、一个人即使已登上顶峰，也仍要自强不息。7:12:35 下午7:12 下午19:12:355月-23 MOMODAPOWERPOINTLoremipsumdolorsitamet,consecteturadipiscingelit.Fusceidurnablandit,eleifendnullaac,fringillapurus.Nullaiaculistemporfelisutcursus.感 谢 您 的 下 载 观 看专家告诉