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1、第36章 RNA 的生物合成和加工(BiosynthesisandprocessingofRNA)一、DNA指导下RNA的合成二、RNA的转录后加工三、在RNA指导下RNA和DNA的合成遗传信息的流向转录和转录后的加工 贮存于DNA中的遗传信息须通过转录和翻译而得到表达。在转录过程中，以DNA的一条链作模板，在RNA聚合酶的催化下，利用4种NTP为原料，合成与模板链互补的RNA分子。与DNA模板链互补的另一条DNA单链为意义链。细胞内的各种RNA都是通过转录产生的（某些RNA病毒除外，它们有RNA的复制），转录出的RNA通常需要经过各种加工才能成为成熟的、有功能的RNA产物。DNA 意义链、模
2、板链和RNA、蛋白质的关系非模板链模板链非模板链也叫意义链或编码链转录的方向与模板链 在一个DNA分子长链上有许多基因，若将DNA分子的两条链分别称为A链和B链，有些基因的模板链位于A链上，有些基因的模板链位于B链上，这两类基因的转录方向刚好相反（对DNA双链分子而言）。注意：我们在描述一个基因的序列时，描述的是它的意义链。RNA一、DNA 指导下RNA 的合成 在DNA指导下合成RNA称为转录。在DNA长链上有许多基因，也有许多转录起始点和转录终止点，形成相应的转录单位。一个转录单位可以只含一个基因，称为单顺反子（monocistron）；也可以含多个基因，称为多顺反子（multicistr
3、on）。在每一个转录起始点附近都有特殊的序列，只有具有这种特殊序列才能在此处起始转录，这种特殊的序列叫启动子（promoter）。转录单位转录受到严格的调控 基因的转录是一种有选择的过程，随着不同的细胞类型、生长发育的不同阶段、外界环境条件的变化而转录不同的基因。转录是基因表达调控中最重要的层次。核酸合成酶类DNA指导的DNA聚合酶：DNA聚合酶（DNA-dircetedDNApolymerase，DDDP）DNA指导的RNA聚合酶：RNA聚合酶（DNA-directedRNApolymerase，DDRP）RNA指导的RNA聚合酶：复制酶（RNA-directedRNApolymerase，
4、RDRP）RNA指导的DNA聚合酶：反转录酶（逆转录酶）（RNA-directedDNApolymerase，RDDP）（一）DNA 指导的RNA 聚合酶 DNA指导的RNA聚合酶简称RNA聚合酶，它以4种NTP为底物，需要DNA模板，RNA链的合成方向也是53，5端的第一个核苷酸的5位带有3个磷酸，其后每加入一个核苷酸脱去一个焦磷酸，形成磷酸二酯键。RNA链合成的起始不需要引物。RNA聚合酶没有校对功能。大肠杆菌RNA 聚合酶 细菌的mRNA、rRNA和tRNA都由同一种RNA聚合酶转录。RNA聚合酶的转录速度在37约为50个核苷酸/s，与多肽链的合成速度（15个氨基酸/s）大致相当。大肠杆
5、菌RNA聚合酶由5种6个亚基组成，2，其中2是核心酶。大肠杆菌RNA聚合酶各亚基的性质和功能亚基 基因 分子量亚基数目功能rpoA 40,0002酶的装配与启动子上游元件及活化因子结合rpoB 155,0001结合核苷酸底物催化磷酸二酯键形成rpoC 160,0001与模板DNA结合rpoD32,00092,0001识别启动子促进转录的起始9,0001未知因子的功能 因子的功能在于引导RNA聚合酶稳定地结合到DNA启动子上，因子有多种，不同类型的启动子由不同的因子识别。因子的存在对核心酶的构象有较大影响，它导致RNA聚合酶与DNA的一般序列及启动子序列的亲和力有很大不同，极大地降低了酶与DNA
6、一般序列的结合常数和停留时间，同时又大大增加了酶与启动子的结合常数和停留时间。RNA 聚合酶与启动子的结合 全酶可通过扩散与DNA任意部位结合，这种结合是疏松的，随后酶结合的DNA部位迅速被置换，也可以说是酶在DNA上不断地变换结合位点，直到遇上启动子序列，随即由疏松结合变成牢固结合。此处DNA双链被局部解开，转录开始。转录开始后因子脱落，转录进入延伸阶段。大肠杆菌 RNA聚合酶与 DNA的相互作用因子与核心酶全酶全酶与DNA复合物核心酶钳住DNA因子脱落大肠杆菌的 RNA转录17bp起始双链DNA局部解开磷酸二酯键形成终止阶段解链区到达基因终点延长阶段53RNA启动子（promoter)终止
7、子(terminator)5RNA聚合酶5353553离开真核生物RNA 聚合酶 真核生物RNA聚合酶主要有3类，通常有814个亚基，并含有Zn2+。它们分别负责合成不同类型的RNA,利用它们对抑制剂-鹅膏蕈碱的敏感性的差异可以辨别它们。真核生物RNA聚合酶自身不能识别和结合到启动子上，它也没有因子，而是需要在启动子上由多种转录因子（各种参与转录的蛋白质）和RNA聚合酶组装成活性转录复合物才能起始转录。真核生物RNA 聚合酶的种类和性质酶的种类 功能 对抑制剂的敏感性RNA聚合酶转录45S rRNA前体，经加工产生5.8S、18S和28SrRNA对鹅膏蕈碱不敏感RNA聚合酶转录所有编码蛋白质的
8、基因和大多数snRNA对鹅膏蕈碱敏感RNA聚合酶转录小 RNA的基因，包括tRNA、5SrRNA、U6snRNA和scRNA对鹅膏蕈碱中等敏感真核生物细胞器RNA 聚合酶 真核细胞的线粒体和叶绿体中也有自己的RNA聚合酶，它们分别转录线粒体和叶绿体中的基因。线粒体和叶绿体RNA聚合酶不同于细胞核RNA聚合酶，它们的结构较简单，类似于原核生物的RNA聚合酶，能催化线粒体中和叶绿体中各种RNA的转录，并被原核生物RNA聚合酶的抑制剂利福平等抑制。（二）启动子和转录因子 利用足迹法（footprint）和DNA测序法可以确定启动子的序列结构。DNA-proteincomplexNakedDNApro
9、tein（ArrowsindicateDNasecleavagesites）DenaturedsDNA-Setsoflabeledfragments足迹法测定DNA 上蛋白质的结合位点RNA 聚合酶与DNA 的结合 习惯上DNA的序列按其意义链来描述。从左到右相当于53方向。转录单位的起点核苷酸编号为+1，往右依次为+2,+3,从+1往5上游编号依次为-1,-2,当RNA聚合酶全酶最初与DNA结合时，它覆盖的长度为7580bp，从启动子的-55+20。在转录起始阶段结束时，因子被释放，核心酶覆盖的长度约为60bp。到核心酶再向前移动若干核苷酸后，核心酶进入延伸阶段，只覆盖3040bp。大肠杆菌
10、 RNA聚合酶在转录的起始阶段缩短覆盖 DNA的长度原核生物启动子 在原核基因启动子中，有一个位于-10的pribnow box（TATAAT）和位于-35的 sextamabox（TTGACA）。这两个序列是决定启动子强度的重要因素。Pribnowbox是RNA聚合酶的牢固结合位点及解链位点，sextamabox是RNA聚合酶的识别位点。在-10区和-35区之间的序列并不重要，然而这两个区之间的距离却十分重要。天然启动子中这段距离大多为1520bp，实验表明这段距离为17bp时转录效率最高。大肠杆菌启动子共有序列的功能sextamaboxpribnowbox含70的RNA 聚合酶识别的几个启
11、动子rrnBP1大肠杆菌不同因子识别具有不同共有序列的启动子基因 因子 用途-35序列间隔-10序列rpoD 70通用TTGACA1618bpTATAATrpoH 32热休克CCCTTGAA1315bpCCCGATNTrpoE E热休克 未知 未知 未知rpoN 54氮源CTGGNA6bpTTGCAfli A F鞭毛CTAAA15bpGCCGATAA真核生物启动子 真核生物启动子有3类，分别由RNA聚合酶、起始转录，起始转录需要许多转录因子的参与，启动子的识别也是靠转录因子的作用。类别启动子控制的基因有许多拷贝，往往成簇存在。RNA聚合酶转录45S rRNA前体，经加工产生5.8S、18S和2
12、8SrRNA类别启动子的结构 类别启动子由两部分保守序列组成：1.核心启动子（corepromoter）位于转录起点附近，从-45+20；2.上游控制元件（upstreamcontrolelement）位于-180-107。两部分都有富含GC的区域。RNA聚合酶 对其转录需要两种转录因子的参与。真核生物类别启动子的转录因子 UBF1和SL1是参与类别 启动子转录的两种转录因子，其中UBF1为单链蛋白，SL1为四聚体蛋白。真核生物的类别启动子类别启动子包含4类控制元件：基本启动子（basalpromoter）起始子（initiator）上游元件（upstreamelement）应答元件（resp
13、onseelement）RNA聚合酶 转录所有编码蛋白质的基因和大多数snRNA几种真核基因的基本启动子 类别启动子中的基本启动子序列为中心在-25-30左右的7bp保守区，根据基本启动子中保守序列的特点，也将其称为TATABOX。RNA 聚合酶和转录因子在启动子上的装配TF:transcriptionfactor转录起始复合物的装配CTD:C-terminaldomain起始子 起始子是转录起始点处的一个保守序列，其共有序列如下PyPyANPyPy+1TA上游元件和应答元件见P463表36-4真核生物类别启动子 类别 启动子涉及一些小分子RNA的转录。5S rRNA、tRNA以及 scRNA
14、（small cytosolRNA）基因的启动子位于转录起始点的下游，即在基因的转录区域内部。snRNA（smallnuclearRNA）基因的启动子在转录起始点的上游，与通常的启动子类似。爪蟾5SrRNA基因的启动子位于+55+80。RNA聚合酶转录小 RNA的基因，包括tRNA、5SrRNA、U6snRNA和scRNA类别启动子的结构特点下游启动子snRNA基因的上游启动子OCT：八聚体基序PSE：邻近序列元件（三）终止子和终止因子 提供转录停止信号的DNA序列称为终止子（terminator），协助RNA聚合酶识别终止信号的蛋白辅助因子称为终止因子（terminationfactor）。
15、有些终止子的作用可被特异的因子所阻止，使RNA聚合酶越过终止子继续转录，这称为通读。这类能够抗终止的蛋白质因子称为抗终止因子（antiterminationfactor）。原核生物终止子的结构特点 大肠杆菌有两类终止子：一类称为不依赖于因子的终止子，或简单终止子；另一类称为依赖于因子的终止子。简单终止子有一段回文结构，其后还有一系列U（约有6个），回文结构中通常有一段富含GC的序列，寡聚U序列可能提供信号使RNA聚合酶脱离模板。依赖于因子的终止子其回文结构不含富有GC区，回文结构之后也无寡聚U。依赖于因子的终止子在细菌染色体中少见，而在噬菌体中广泛存在。原核生物的两类终止子不依赖于因子的终止子
16、 依赖于因子的终止子不依赖因子的转录终止机制 在转录过程中，RNA聚合酶沿着模板链向前移动，它感受的终止信号来自刚转录出的RNA中，而不是感受DNA模板上的信号。在转录出终止子序列后，RNA上的终止序列形成发夹结构，使RNA聚合酶感受到终止信号（发夹结构），整个复合物构象发生变化，新合成的寡聚U与模板链上的寡聚A结合不紧密，新生RNA链与模板DNA分开，RNA聚合酶也脱落。不依赖 因子的转录终止机制依赖因子的转录终止机制 因子以六聚体的形式存在，在有RNA存在时它能水解NTP，最近发现 因子有 RNA-DNA解旋酶的活性。抗终止作用 抗终止作用主要见于某些噬菌体基因表达的时序控制。在早期基因转
17、录表达出抗终止蛋白后，使得转录通读，进入晚期基因表达。这种方式可使一个启动子控制后面基因的时序表达。真核生物基因的转录终止 真核生物转录的终止信号和终止过程还不清楚。实验表明，RNA聚合酶的转录产物在3末端切断，然后加上腺苷酸尾（polyA）。真核生物基因的转录终止（五）RNA 生物合成的抑制剂1.嘌呤和嘧啶类似物 它们抑制核苷酸合成酶类，或形成相应的核苷酸后掺入到核酸中，影响RNA转录，也能影响DNA复制，从而可以用于癌症治疗。嘌呤和嘧啶类似物 6-巯基嘌呤 硫鸟嘌呤 5-氟尿嘧啶 8-氮鸟嘌呤 2,6-二氨基嘌呤 6-氮尿嘧啶（五）RNA 生物合成的抑制剂2.DNA模板功能的抑制物烷化剂：
18、修饰碱基，引起细胞突变和致癌。放线菌素：与DNA形成非共价复合物，低浓度可抑制RNA转录，高浓度抑制DNA复制。嵌入染料：可插入双链DNA的相邻碱基对之间，导致移码突变，也能抑制转录和复制。碱基的烷化剂苯丁酸氮芥环磷酰胺放线菌素D放线菌素D 针剂【作用特点】本品为细胞周期非特异性药物，选择性地与DNA中的鸟嘌呤结合，抑制以DNA为模板的RNA聚合酶，从而抑制RNA的合成，阻止癌细胞生长。静脉注射后迅速分布至各组织，广泛与组织结合，但不易透过血脑屏障。T1/2为36小时，在体内代谢的量很小。缓慢自尿及粪排泄，原形药10%由尿排出，50%由胆道排出，9日后仅能发现注射剂量的30%。【功能主治】主用
19、于恶性淋巴瘤、肾母细胞瘤、绒毛膜上皮癌及恶性葡萄胎等。放线菌素D 针剂【用法用量】静脉注射或静脉滴注:每次0.20.4mg，用生理盐水1020ml溶解后推注，或加于5%葡萄糖液500ml中滴注，每日或隔日l次，1014次为一个疗程，疗程间隔1014天。胸、腹腔注射:每次0.40.6mg。【不良反应】1.可引起白细胞及血小板减少，厌食、恶心、呕吐等。2.静脉注射可引起静脉炎，漏出血管可引起疼痛、局部硬结及溃破。3.可有脱发、皮炎、发热、肝功能损伤。4.有免疫抑制作用。5.对妊娠者可引起畸胎。6.长期应用可抑制睾丸或卵巢功能，引起闭经或精子缺乏。嵌入染料吖啶黄原黄素吖啶橙溴乙锭（五）RNA 生物合
20、成的抑制剂3.RNA聚合酶的抑制剂利福霉素：抑制细菌RNA聚合酶的活性。利链菌素：抑制细菌RNA聚合酶的活性。-鹅膏蕈碱：抑制真核生物RNA聚合酶活性。利福平和利福霉素的结构式 鹅膏蕈碱的结构式二、RNA 的转录后加工（一）原核生物中RNA 的加工原核生物tRNA 的转录后加工原核生物tRNA 的转录后加工2iPA=2-异戊烯基腺苷2mG=2-O-甲基鸟苷4tU=4-硫尿嘧啶核苷=假尿嘧啶核苷tRNA3 末端CCA 的产生 所有成熟tRNA分子的3端都有CCA结构，它对于接受氨酰基是必要的。细菌tRNA前体存在两类不同的3端序列。一类其自身具有CCA的结构，将3端多余的序列切除后刚好暴露出CC
21、A序列；另一类是当切除3端多余序列后，通过tRNA核苷酰转移酶加上CCA。tRNA的加工还包括碱基的修饰。原核生物mRNA 前体的加工 细菌中的mRNA大多不需要加工，一经转录即可直接进行翻译。甚至在转录出部分mRNA序列时就已经开始了翻译，也就是一边转录一边翻译，翻译滞后一些。但也有少数多顺反子mRNA须通过核酸内切酶切割成较小的单位，然后再翻译。这些较小的单位可以是单个基因，也可以是多个基因序列的组合。原核生物中的边转录边翻译（二）真核生物中RNA 的一般加工 真核生物rRNA和tRNA前体的加工过程与原核生物相似，但mRNA前体必须经过复杂的加工，才能成为成熟的mRNA。真核生物rRNA
22、 前体的加工 哺乳类动物的18S、5.8S和28SrRNA基因构成一个转录单位，转录产生45SrRNA前体，然后通过剪切加工成各个成熟的rRNA。真核生物rRNA 的修饰 rRNA在成熟过程中可被甲基化，主要的甲基化位点也在核糖2羟基上。还有尿嘧啶转变成假尿嘧啶的修饰。这些修饰和切割是由核仁小RNA（smallnucleolarRNA,snoRNA）指导的。snoRNA 指导rRNA位点特异的修饰snoRNAsnoRNA C/DsnoRNAH/ACAsnoRNA指导2-O-甲基化指导假尿苷酸化 Cbox DboxHboxACAboxrRNA真核生物tRNA 前体的加工 真核生物tRNA的加工与
23、原核生物类似，只是真核生物tRNA3端的CCA都是后加的。部分真核生物tRNA前体有内含子。真核生物tRNA 前体的加工Primary transcript Intermediate真核生物tRNA 前体的加工IntermediateMature tRNATyr真核生物mRNA 前体的加工 mRNA的 前 体 称 为 核 内 不 均 一RNA（heterogeneous nuclear RNA，hnRNA），因为一个细胞中有许多种不同的mRNA，也就有许多种不同的前体。hnRNA在加工成熟的过程中有5端加帽、3端加尾、去除内含子等过程。5 端加帽(m7Gppp)大约转录出30个核苷酸时，在鸟苷
24、转移酶催化下，GTP与新生RNA链的5端的三磷酸发生缩合反应，在RNA的5端加上G残基的帽子，在帽子上再进行甲基化，通常甲基化的位点是碱基上的7位，核糖的2位也可以甲基化。帽子结构将在其后的翻译中发挥重要作用；另一个作用可能是保护新生的RNA，避免其在合成过程中被降解。mRNA5 端的帽子结构存在于所有类型帽子中在类型帽子中，此位点也可被甲基化G通过55键加入存在于类型帽子中存在于类型帽子中3 端加多聚腺苷酸尾 真核生物mRNA的3端通常都有20200个腺苷酸，但也有例外，如组蛋白、呼肠孤病毒和不少植物病毒的mRNA没有多聚腺苷酸尾。加尾过程在细胞核内进行，通过多聚腺苷酸聚合酶催化反应完成（不
25、需要模板）。polyA尾的存在可以提高mRNA的稳定性。（三）RNA 的拼接、编辑 大多数真核基因都是断裂基因，但也有少数编码蛋白质的基因以及一些tRNA和rRNA基因是连续的。断裂基因的转录产物须通过拼接，去除插入部分（intron，内含子），连接保留部分（exon，外显子）成为连续序列。典型的真核生物基因结构各种RNA 前体的剪接 类型 类型 核mRNA的 核tRNA的 自我剪接 自我剪接 剪接体剪接 酶促剪接各种剪接类型的分布 类型 自我剪接的内含子分布很广，存在于真核生物的线粒体和叶绿体基因、低等真核生物核的rRNA基因、细菌和噬菌体的个别基因中。类型 内含子也具有自我催化功能，它与类
26、型内含子自我剪接的差别在于转酯反应无需游离鸟苷酸（或鸟苷）发动。类型 内含子只见于某些真菌线粒体和植物叶绿体基因。有些和型内含子中也编码有核酸内切酶、逆转录酶或成熟酶等。反式剪接 反式剪接是分子间剪接，从两个不同的转录本中各取一段连接起来。存在于锥虫的众多mRNA，其5端有一共同的35个核苷酸长的前导序列。该前导序列来自一些重复单位的转录产物，从这些转录产物中剪下前导序列再连接到其他mRNA的5端。反式剪接示意图选择性剪接 一个基因的转录产物，通过不同的剪接方式，可以产生不同的mRNA，从而翻译出不同的蛋白质。一个基因转录本通过选择性剪接产生的不同蛋白质称为同源体（isoform）。选择性剪接
27、示意图RNA 编辑 RNA编辑是指修饰或轻微改变mRNA的核苷酸序列，使它们与对应的模板DNA序列有所不同的预定过程。迄今发现真核生物线粒体中存在的RNA编辑类型有：核苷酸的转录后插入和缺失；转录物在C转换成U时创造终止密码子UAA；碱基间的转换。常见的RNA编辑是CU的转换。碱基转换Cytosine（C）Uracil（U）RNA 编辑的发现 1986年Benne R等在研究锥虫线粒体DNA时发现，其细胞色素氧化酶亚基（co）基因与酵母或人的相应基因对比存在一个 1的移码突变，然而酶的功能又是正常的。进一步比较co 基因与其转录物的序列，发现转录物在移码突变位点附近有4个不被基因DNA编码的额
28、外尿苷酸，正好纠正了基因的移码突变。由于用分子杂交技术在线粒体内找不到第二个co 基因，所以认为这些尿苷酸是在转录中或转录后插进去的。锥虫co 基因与其表达产物的序列比较DNA正链序列GAGAAmRNA序列GAUUGUAUA蛋白质序列AspCysIleRNA 编辑的生物学意义可以纠正基因突变造成的损害增加基因产物的多样性与生物发育和分化有关有利于生物进化RNA 的降解 RNA降解是涉及基因表达的一个重要环节。rRNA和 tRNA是稳定的 RNA，其更新率较低。mRNA是不稳定的RNA，其更新率非常高。细胞内有各种能够降解RNA的酶，如53外切核酸酶、35外切核酸酶、核酸内切酶等。不同的RNA其
29、稳定性不同，稳定性与其结构有关，mRNA的5帽子、polyA尾、发卡结构等都有稳定RNA的作用。三、在RNA 指导下RNA和DNA 的合成 从有些感染RNA病毒的细胞中可以分离出RNA复制酶，这种酶以病毒RNA为模板，在有4NTP及Mg2+存在时，能够合成出与模板RNA互补的RNA链。再以新合成的RNA链为模板，合成出与原RNA一样的RNA，这就是RNA的复制。（一）RNA的复制噬菌体QRNA 的复制 Q噬菌体的复制酶由4个亚基组成，噬菌体RNA只编码其中的亚基，另外3个亚基都是利用宿主细胞中的蛋白质。Q噬菌体的RNA本身就是mRNA，称为正链，侵入宿主细胞后即可翻译出复制酶的亚基，亚基与来自
30、宿主的其他亚基结合后，成为有活性的复制酶，复制自身的RNA。复制酶有底物特异性，它只复制病毒的RNA，而不复制宿主细胞中的其他RNA。噬菌体 QRNA的复制病毒RNA 复制的主要方式正链RNA病毒：先复制出负链，再复制出正链。（侵入的正链可翻译出蛋白质，产生复制酶）负链RNA病毒：先转录出正链，再复制出负链。（带入复制酶）双链RNA病毒：先转录出正链，再复制出负链。（带入复制酶）逆转录病毒：先逆转录成DNA，再转录出RNA。（带入逆转录酶）ssRNA 的极性如果单链RNA可作为mRNA，可充当翻译的模板，叫做正链RNA。正极性如果单链RNA与mRNA互补，则无充当翻译模板的可能，叫做负链RNA。负极性双意RNA：一个病毒核酸的RNA某一部分正极性，另一部分负极性。RNA 的逆转录 以RNA为模板合成DNA的过程称为逆转录（反转录），催化此反应的酶称为逆转录酶（反转录酶）。逆转录酶催化的DNA合成反应以4dNTP为底物，要求有模板和引物，体内的引物一般为tRNA。逆转录酶除了能以RNA为模板外，也可以以DNA为模板，所以它也是DNA聚合酶。逆转录酶还有RNaseH活性，此活性专门降解DNA-RNA杂交双链中的RNA。