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1、复习动物细胞工程快速复习题1.动物细胞工程的基础是什么？2.动物细胞培养的基本原理是什么？3.动物细胞培养液的主要成分是什么？4.进行动物细胞培养的材料一般有何特点？动物细胞培养技术动物细胞培养技术离体的细胞在适宜的条件下可以增殖离体的细胞在适宜的条件下可以增殖通常含有葡萄糖、氨基酸、促生长因子、无机通常含有葡萄糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素、盐、微量元素、动物血清动物血清等。等。一般取胚胎组织或幼龄动物的组织做动物细胞培养。因为胚胎组织或幼龄动物的组织的细胞生命力旺盛，分裂能力强。5.原代培养与传代培养有何区别?6.动物体细胞培养技术能将一个分化的体细胞培养成为一个动物体吗？为什么
2、？7.为什么要将组织分散成了单个细胞再进行培养？将动物组织消化后的初次培养就是原代培养。当原代培养的细胞贴满瓶壁后，用胰蛋白酶处理，制成细胞悬浮液后再次分瓶继续培养就是传代培养。不能单个细胞容易和周围环境进行物质交换获得营养物质、氧气等，排出代谢废物；分散成单个细胞培养能使细胞水平操作的其他技术得以实现。动动物物组组织织单单个个细细胞胞细细胞胞悬悬液液贴贴壁壁生生长长 分分瓶瓶培培养养10代细胞50代细胞不死细胞原代培养原代培养传代培养传代培养胰蛋白酶 胰蛋白酶剪碎 剪碎 加培养液 加培养液接触抑制 接触抑制少数癌变 少数癌变少数 少数动物细胞培养技术流程畸形分化 畸形分化8.怎样将动物组织分
3、散成单个的细胞？9.胰蛋白酶的作用是什么呢？细胞间隙主要含有什么物质成份？10.为何要定期用胰蛋白酶使细胞从瓶壁上脱离下来？11.细胞贴壁生长对培养容器有何要求？用剪刀剪碎组织，再用胰蛋白酶处理。胰蛋白酶将动物组织细胞间隙中的蛋白质分解，使细胞分散开。当贴壁细胞生长到表面相互接触时，细胞就会停止分裂增殖细胞出现接触抑制。培养瓶的内表面要光滑、无毒、易于贴附。12.哪些细胞会失去接触抑制？13.在体外培养动物细胞需要什么物质和环境条件？14.动物细胞培养有何应用价值？肿瘤细胞无菌无毒环境、充足营养（血清或血浆）、适宜温度、PH、气体环境（O2和CO2，C02的主要作用是维持培养液的PH）。.大规
4、模生产生物制品，如病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体等；.药性、毒性检测；.培养基因工程中的受体细胞15.为什么对动物细胞进行培养时通常要添加血清？16.动物细胞培养要经过脱分化的过程吗？为什么 血清中含有蛋白质、氨基酸、葡萄糖、激素等，其中必需氨基酸动物细胞本身不能合成，必须由培养液提供。血清激素有胰岛素、生长激素等以及多种生长因子，能促进细胞的生长、增殖和贴附。不需要。因高度分化的动物细胞发育潜能变窄，失去了发育成完整个体的能力，所以，动物细胞也就没有类似植物组织或细胞培养时的脱分化过程了。动物组织块 动物组织块细胞悬液 细胞悬液原代培养原代培养传代培养传代培养胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理分胰蛋白酶
5、或胶原蛋白酶处理分散成单个细胞散成单个细胞幼龄动物的器官组织；动物胚胎幼龄动物的器官组织；动物胚胎动物细胞培养过程细胞贴壁细胞贴壁接触抑制接触抑制原代培养原代培养传代培养传代培养加入培养液加入培养液用胰蛋白酶等用胰蛋白酶等处理贴壁细胞处理贴壁细胞适宜条件适宜条件不死性细胞不死性细胞17.什么是动物细胞核移植？18.多莉羊的诞生在生物学发展史上有何意义？19.为什么用于核移植的供体细胞一般都选用传代 10代以内的细胞？将动物的一个细胞核，移入一个已经去掉细胞核的卵母细胞中，使其重组并发育成为一个新的胚胎，新的胚胎最终发育为动物个体（克隆动物）。说明已经分化的说明已经分化的动物体细胞核，仍然具有全
6、能性动物体细胞核，仍然具有全能性，在，在合适的条件下合适的条件下，仍然可以发育成新的个体。，仍然可以发育成新的个体。1010代以内的细胞一般能保持正常的二倍体核型。代以内的细胞一般能保持正常的二倍体核型。培养的动物细胞一般当传代至培养的动物细胞一般当传代至10105050代左右时，部分代左右时，部分细胞核型可能会发生变化，其细胞遗传物质可能会发生突细胞核型可能会发生变化，其细胞遗传物质可能会发生突变。变。20.体细胞核移植获得高产奶牛过程中，利用了哪些现代生物技术手段？21.你认为用上述体细胞核移植方法生产的克隆动物，是对体细胞供体动物进行了100%的复制吗？22.体细胞核移植技术有哪些应用前
7、景？动物细胞培养技术、亚显微操作技术、核移植技术、动物细胞培养技术、亚显微操作技术、核移植技术、胚胎移植技术、细胞融合技术胚胎移植技术、细胞融合技术 否。绝大部分否。绝大部分DNADNA来自于供体细胞核，但其核外还有来自于供体细胞核，但其核外还有少量的少量的DNADNA，即线粒体中的，即线粒体中的DNADNA是来自于受体卵母细胞。是来自于受体卵母细胞。加速家畜遗传改良的进程加速家畜遗传改良的进程保护濒危物种保护濒危物种生产医用蛋白质及组织器官的移植生产医用蛋白质及组织器官的移植了解胚胎发育和衰老过程；追踪研究疾病的发展过程和了解胚胎发育和衰老过程；追踪研究疾病的发展过程和治疗疾病治疗疾病卵细胞
8、母绵羊母绵羊乳腺细胞细胞质细胞核细胞核移植早期胚胎卵裂C 母绵羊子宫（代孕母体）胚胎移植多莉羊分娩 妊娠多莉羊的培育过程重组细胞23.体细胞核移植技术还存在什么问题？成功率非常低；绝大多数克隆动物还存在健康问题24.什么是克隆？生物克隆需要哪3个基本条件？从一个共同的祖先通过无性繁殖的方法繁殖出来的一从一个共同的祖先通过无性繁殖的方法繁殖出来的一群遗传特征相同的群遗传特征相同的DNADNA分子、细胞或个体的过程。分子、细胞或个体的过程。具有包含本物种完整基因组的细胞核的活细胞具有包含本物种完整基因组的细胞核的活细胞（如：乳（如：乳 腺上皮细胞、牛耳细胞等）；腺上皮细胞、牛耳细胞等）；能有效调控
9、细胞核发育的细胞质物质能有效调控细胞核发育的细胞质物质（如去核卵的细胞（如去核卵的细胞 质）；质）；完成胚胎发育的必要的环境条件完成胚胎发育的必要的环境条件（如诱导核（如诱导核质重组细质重组细 胞生长、分化的实验条件和怀胎母体的子宫环境）胞生长、分化的实验条件和怀胎母体的子宫环境）。25.无性繁殖和有性繁殖的主要区别是什么？26.动物细胞融合的基本原理是什么？27.什么是病毒的灭活？有性繁殖是通过产生有性生殖细胞有性繁殖是通过产生有性生殖细胞配子（包括精配子（包括精细胞、卵细胞），配子结合后生长成新的个体。细胞、卵细胞），配子结合后生长成新的个体。无性繁殖是不经生殖细胞结合的受精过程，由母体的
10、无性繁殖是不经生殖细胞结合的受精过程，由母体的一部分直接产生子代的繁殖方法。一部分直接产生子代的繁殖方法。细胞膜的流动性细胞膜的流动性 灭活是指用物理或化学手段使病毒失去感染能力，但灭活是指用物理或化学手段使病毒失去感染能力，但是并不破坏病毒的抗原结构。是并不破坏病毒的抗原结构。28.灭活病毒诱导细胞融合的原理是什么？病毒表面含有的糖蛋白和一些酶能够与细胞膜上的糖病毒表面含有的糖蛋白和一些酶能够与细胞膜上的糖蛋白发生作用，使细胞互相凝聚，细胞膜上的蛋白质分子蛋白发生作用，使细胞互相凝聚，细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合。和脂质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融
11、合。因为灭活的病毒能使细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合 29.什么是抗体？抗体抗体是机体受是机体受抗原抗原刺激后产生的、并能与该抗原发生刺激后产生的、并能与该抗原发生特异性结合特异性结合的具有的具有免疫功能免疫功能的的球蛋白。球蛋白。30.抗体有什么应用价值？（11）诊断疾病：）诊断疾病：如对癌症、乙肝等疾病的诊断如对癌症、乙肝等疾病的诊断（22）治疗疾病：）治疗疾病：如治疗毒蛇咬伤等如治疗毒蛇咬伤等（33）物质检测：）物质检测：如目的基因表达的检测如目的基因表达的检测31.怎样获得抗体？向动物体内反复注射某种抗原，使动物产生抗体，从向动物体内反复注射某种抗原，
12、使动物产生抗体，从血清中分离出的抗体血清中分离出的抗体,称为称为血清抗体血清抗体。特点特点：多种抗体的混合物，纯度差、特异性差、产量低。多种抗体的混合物，纯度差、特异性差、产量低。32.如何获得单一种类抗体？由于每一个由于每一个BB细胞只分泌一种特异性抗体。要想获得细胞只分泌一种特异性抗体。要想获得大量的单一抗体，必须大量的单一抗体，必须克隆单一的克隆单一的BB淋巴细胞淋巴细胞，形成细胞形成细胞群群。利用利用动物细胞培养技术动物细胞培养技术，培养单个，培养单个BB淋巴细胞，就可淋巴细胞，就可以克隆单一以克隆单一BB淋巴细胞，获得单一种类抗体。淋巴细胞，获得单一种类抗体。33.正常情况下，一个B
13、淋巴细胞不能无限增殖形成细胞群，怎样才能克隆出单一的B淋巴细胞？设法使一种能产生特定抗体的设法使一种能产生特定抗体的BB淋巴细胞与能在体外淋巴细胞与能在体外大量增殖的骨髓瘤细胞进行融合，所得到的大量增殖的骨髓瘤细胞进行融合，所得到的融合细胞既能融合细胞既能大量增殖，又能产生足够数量的特定抗体大量增殖，又能产生足够数量的特定抗体。34.怎样才能获得产生特定抗体的B淋巴细胞？用某种抗原（多次）注射实验动物，使其发生特异性用某种抗原（多次）注射实验动物，使其发生特异性免疫反应，分化形成能产生特定抗体的免疫反应，分化形成能产生特定抗体的BB淋巴细胞淋巴细胞34.从何处取得经过免疫的B淋巴细胞？35.可
14、以采用什么方法诱导动物细胞融合？36.把B淋巴细胞和骨髓瘤细胞放在一起融合时，有几种融合方式？离心、振动、电激；聚乙二醇；灭活的病毒 从免疫动物的脾脏获取。B-B融合细胞 杂交瘤细胞 瘤-瘤融合细胞资料：资料：细胞合成细胞合成DNADNA有有DD和和SS两条途径，其中两条途径，其中DD途径能被氨基嘌途径能被氨基嘌呤阻断。淋巴细胞有这两种呤阻断。淋巴细胞有这两种DNADNA的合成途径，但一般不分的合成途径，但一般不分裂增殖。裂增殖。骨髓瘤细胞中只有骨髓瘤细胞中只有DD途径而没有途径而没有SS途径，但能不断途径，但能不断分裂增殖。分裂增殖。在培养液中加入氨基嘌呤，收集增殖的细胞，就是杂交瘤细胞。这
15、种培养基被称为“HAT”选择培养基。37.如何筛选杂交瘤细胞？38.杂交瘤细胞有什么特点？既能大量繁殖，又能产生专一抗体。39.筛选出的杂交瘤细胞产生的是同一种抗体吗？否，由于与骨髓瘤细胞融合的B淋巴细胞有许多种，因此从这些种杂交瘤细胞中提取抗体的仍然是多种抗体的混合物。抗原 抗原针对同种抗原 针对同种抗原的多种抗体 的多种抗体40.怎样从众多杂交瘤细胞中筛选到能产生我们需要的产生特异性抗体的杂交瘤细胞？通常采用有限稀释克隆细胞的方法获得单细胞克隆，再利用抗原抗体杂交法检测，筛选出分泌产生所需特异抗体的杂交细胞株，然后进行扩大培养。多孔动物细胞培养板 多孔动物细胞培养板 将含有杂交瘤细胞的培养
16、液按比例稀释，分别加入多孔细胞培养板的小孔中，稀释度保证每个小孔中的细胞数不多于1个，进行细胞培养。抗原抗体杂交法检验呈抗原抗体杂交法检验呈阳性阳性利用抗原抗体杂交法检测杂交瘤细胞产生的特异性抗体阳性孔方法方法抗原抗原-抗体杂交法抗体杂交法 在单克隆抗体制备过程中，两次筛选的原理和方法是不相同的。第一次筛选 第一次筛选第二次筛选 第二次筛选41.如何得到大量的单一抗体？42.如何培养杂交瘤细胞？培养特异的杂交瘤细胞，从中提取出单一抗体，即单克隆抗体。体外培养或体内培养43.单克隆抗体的概念 由单个杂交瘤细胞进行无性繁殖,也就是通过克隆，形成细胞群，这一细胞群所产生的化学性质单一、特异性强的抗体
17、称为单克隆抗体。44.单抗隆抗体的特点特异性强、灵敏度高 可以大量制备45.单抗隆抗体有何应用价值？作为诊断试剂作为诊断试剂 具有具有准确、高效、简易、快速的优点准确、高效、简易、快速的优点，可定位诊，可定位诊断肿瘤、心血管畸形等疾病。断肿瘤、心血管畸形等疾病。定位诊断肿瘤、心血管畸形等疾病定位诊断肿瘤、心血管畸形等疾病用于治疗疾病和运载药物用于治疗疾病和运载药物 制成生物导弹制成生物导弹，将药物定向带到癌细胞所在的位置，将药物定向带到癌细胞所在的位置，在原位杀死癌细胞，疗效高、副作用小。在原位杀死癌细胞，疗效高、副作用小。单克隆抗体单克隆抗体筛筛选选杂交细胞杂交细胞杂交瘤细胞杂交瘤细胞体外或
18、体内体外或体内细胞培养细胞培养筛选筛选骨髓瘤骨髓瘤细胞细胞诱导细胞融合诱导细胞融合特异性杂交瘤细胞特异性杂交瘤细胞杂交瘤细胞系杂交瘤细胞系提取提取经过免疫的经过免疫的BB淋巴细胞淋巴细胞动物动物细胞细胞融合融合技术技术动物动物细胞细胞培养培养技术技术单克隆抗体的制备过程：特点：既能产生专一 特点：既能产生专一抗体又能大量繁殖 抗体又能大量繁殖特点：特异性强灵敏 特点：特异性强灵敏度高可大量制备 度高可大量制备注射抗原注射抗原免疫免疫46.动物细胞融合与植物体细胞杂交过程有何不同47.诱导动物细胞融合与植物原生质体融合的原理和方法是否基本相同?植物体细胞融合前需去掉细胞壁，然后再融合；动物细胞融
19、合是两个体细胞直接融合。诱导动物细胞融合与植物原生质体融合的基本原理相同细胞膜的流动性，方法也基本类似，不同的是除物理法、化学法外，还用到生物方法，即灭活的病毒。19751975年年KohlerKohler和和MilsteinMilstein的单克隆抗体技术在生产和使用的单克隆抗体技术在生产和使用抗体方面开创了新纪元，图抗体方面开创了新纪元，图1010示单克隆抗体制备流程阶段示单克隆抗体制备流程阶段示意图。请据图回答下列问题：示意图。请据图回答下列问题：（11）该技术是在动物细胞培养）该技术是在动物细胞培养技术和技术和 技术的基础技术的基础上发展起来的。上发展起来的。（22）图）图1010中细
20、胞中细胞AA体外培养体外培养不具有分裂能力，但能分泌不具有分裂能力，但能分泌，细胞，细胞BB体外体外培养能够培养能够。（33）动物细胞融合常用的）动物细胞融合常用的方法是方法是。图10动物细胞融合动物细胞融合 分泌特异性抗体分泌特异性抗体无限增殖无限增殖PEGPEG（灭活的病毒、电激）（灭活的病毒、电激）图10（44）细胞融合是随机的过程，）细胞融合是随机的过程，在在HATHAT培养基中培养，要筛选出培养基中培养，要筛选出 细胞。在细胞培养过细胞。在细胞培养过程中，为了促进细胞摄取葡萄糖，程中，为了促进细胞摄取葡萄糖，常向培养液中加入常向培养液中加入(激素激素)（55）培养）培养22周后，即测
21、定培养周后，即测定培养细胞的特征，筛选出细胞的特征，筛选出 细胞置于不细胞置于不同孔内（如图所示）培养。此操同孔内（如图所示）培养。此操作前要将培养细胞稀释到作前要将培养细胞稀释到771010个细胞个细胞/ml/ml，每孔滴入，每孔滴入0.1ml0.1ml细胞稀释液，其目的是细胞稀释液，其目的是。（66）要获得大量的单克隆抗体，可对获得的杂交瘤细胞）要获得大量的单克隆抗体，可对获得的杂交瘤细胞进行进行 培养。培养。保证每个孔内不多于一个细胞，达到单克隆培养的目的（单 保证每个孔内不多于一个细胞，达到单克隆培养的目的（单一细胞培养以保证抗体的纯度）一细胞培养以保证抗体的纯度）体外或体内体外或体内
22、杂交瘤杂交瘤胰岛素胰岛素 特异性分泌抗特异性分泌抗XX蛋白抗体的蛋白抗体的例（09山东卷）人类在预防与诊疗传染性疾病过程中，经常使用疫苗和抗体。已知某传染性疾病的病原体为RNA病毒，该病毒表面的A蛋白为主要抗原，且疾苗生产和抗体制备的流程之一如下图：提取 提取 病毒 病毒 RNA RNADNA DNA A A 基因 基因A A 基因 基因表 表 达 达 载 载体 体受体 受体细胞 细胞A A 蛋白 蛋白小 小 鼠 鼠 皮 皮下 下小 小 鼠 鼠 骨 骨髓 髓 瘤 瘤 细 细胞 胞效 效应 应B B淋 淋巴细胞 巴细胞X X抗 抗 A A 蛋 蛋 白 白 的 的单 单 克 克 隆 隆 抗 抗体
23、体 请回答：（1）过程代表的是。（2）过程构建A基因表达载体时，必须使用 和 两种工具酶。DNADNA连接酶连接酶 逆转录逆转录限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶 病毒 病毒 RNA RNADNA DNA A A 基因 基因A A 基因 基因表达载体 表达载体受体 受体细胞 细胞A A 蛋白 蛋白小鼠皮下 小鼠皮下小 小 鼠 鼠 骨 骨 髓 髓瘤细胞 瘤细胞效 效 应 应 B B淋 淋巴细胞 巴细胞X X抗 抗 A A 蛋 蛋 白 白 的 的单克隆抗体 单克隆抗体（3）过程采用的实验技术是，获得的X是。（4）对健康人进行该传染病免疫预防时，可选用图中基因工程生产的 所制备的疫苗。对该传染病疑似患
24、者确诊时，可以疑似患者体内分离病毒，与已知病毒进行 _ 比较；或用图中的 _ _ 进行特异性结合检测。抗抗AA蛋白的单克隆抗体蛋白的单克隆抗体细胞融合细胞融合 杂交瘤细胞杂交瘤细胞AA蛋白蛋白核酸（基因）序列核酸（基因）序列 该RNA病毒表面的A蛋白为主要的抗原，故而可选用通过基因工程生产的A蛋白制备疫苗；确诊时为判断该病毒是否为题目中的RNA病毒，可以进行核酸序列的比对；也可以利用单克隆抗体具备特异性，利用抗A蛋白的特异性单克隆抗体通过能否特异性结合判断病毒表面是否有A蛋白的存在进一步进行检测是否为目的RNA病毒。写出写出、所指的细胞工程各称：、所指的细胞工程各称：。实施细胞工程时，所需的受
25、体实施细胞工程时，所需的受体细胞大多采用动物卵细胞的原因是细胞大多采用动物卵细胞的原因是：。多莉面部的毛色是多莉面部的毛色是，判断依据是判断依据是：。继植物组织培养之后，克隆绵羊继植物组织培养之后，克隆绵羊培育成功，证明动物细胞也具有培育成功，证明动物细胞也具有。请举例说明克隆绵羊培育成功的请举例说明克隆绵羊培育成功的实际意义实际意义：。例例.世界上第一只克隆绵羊世界上第一只克隆绵羊“多莉多莉”的培育等程序如图所的培育等程序如图所示。请仔细看图后回答问题：示。请仔细看图后回答问题：黑面绵羊去核卵细胞白面绵羊卵腺细胞核重组细胞早期胚胎另一头母绵羊子宫克隆绵羊多莉ab电脉冲处理妊娠、出生核移植 核
26、移植 胚胎移植 胚胎移植卵细胞体积大，易于操作，卵细胞中有 卵细胞体积大，易于操作，卵细胞中有启动核基因表达的物质 启动核基因表达的物质白色 白色多利的核基因全部来自白面绵阳 多利的核基因全部来自白面绵阳全能性 全能性保存濒危物种，繁殖优良品种，医学上克隆器官 保存濒危物种，繁殖优良品种，医学上克隆器官3.科学家用小鼠骨髓癌细胞与某种细胞融合，得到杂交细胞，经培养可产生大量的单克隆抗体，与骨髓癌细胞融合的是 A.经过免疫的B淋巴细胞B.不经过免疫的T淋巴细胞C.经过免疫的T淋巴细胞 D.不经过免疫的B淋巴细胞A4.科学家将雌黑鼠乳腺细胞的细胞核移入白鼠去核的卵细胞内，待发育成早期胚胎后移植入褐
27、鼠的子宫，该褐鼠产下小鼠的体色和性别分别是 A.黑、雌 B.褐、雌 C.白、雄 D.黑、雄 A5.将小鼠骨髓瘤细胞与一种B淋巴细胞融合，可使融合的细胞经培养产生单克隆抗体，其依据是 A.B淋巴细胞可以产生抗体，但不能无限增殖 B.B淋巴细胞只有与骨髓瘤细胞融合后才能产生抗体 C.骨髓瘤细胞可以无限增殖，但不能产生抗体 D.骨髓瘤细胞可以产生抗体，但不能增殖（多选）ACC4单克隆抗体是指 A、单个骨髓瘤细胞增殖产生的抗体 B、单个B淋巴细胞增殖产生的抗体C、单个杂交瘤细胞增殖产生的抗体 D、单个抗体通过克隆化，产生大量抗体5.下列哪一项属于克隆？A.将鸡的某个DNA片段整合到小鼠的DNA分子中 B.将抗药菌的某基因引人草履虫的细胞内 C.将鼠骨髓瘤细胞与经过免疫的脾细胞融合成杂交瘤细胞 D.将某肿瘤细胞在体外培养繁殖成一个细胞系 D6.一只羊的卵细胞核被另一只羊的体细胞核置换后，这个卵细胞经过多次分裂，再植入第三只羊的子宫内发育，结果产下一只羊羔。这种克隆技术具有多种用途，但是不能 A有选择地繁殖某一性别的家畜 B.繁殖家畜中的优秀个体C用于保存物种 D.改变动物的基因型D7.在动物细胞融合和植物体细胞杂交的比较中，正确的是（）A.结果是相同的 B.杂种细胞的形成过程基本相同 C.操作过程中酶的作用相同 D.诱导融合手段的手段相同B