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1、第三章 基因工程常规技术（P 3252）电泳技术 杂交技术 转化技术 PCR 扩增技术 文库构建技术 测序技术第一节 凝胶电泳技术Electrophoresis电 泳（electrophoresis)带电物质在电场中向相反电极移动的现象 核酸凝胶电泳是分子克隆核心技术之一，用于分离、鉴定和纯化DNA或RNA片段；一、琼脂糖凝胶电泳 用琼脂糖凝胶作为支持介质的区带电泳法。琼脂糖是一种线性多糖聚合物，是从红色海藻琼脂糖是一种线性多糖聚合物，是从红色海藻中提取而来。在高温水溶液下会溶解，常温下凝固中提取而来。在高温水溶液下会溶解，常温下凝固并形成一定大小孔径的惰性介质，凝胶孔径的大小并形成一定大小孔
2、径的惰性介质，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。决定于琼脂糖的浓度。1、原理DNADNA分子的磷酸基团在碱性缓冲液中带负电荷，分子的磷酸基团在碱性缓冲液中带负电荷，在外加电场作用下在外加电场作用下DNADNA分子向正极泳动分子向正极泳动琼脂糖凝胶电泳法分离琼脂糖凝胶电泳法分离DNADNA，主要是利用琼脂糖，主要是利用琼脂糖的分子筛效应，迁移速度与分子量的对数值成反的分子筛效应，迁移速度与分子量的对数值成反比关系。因而就可依据比关系。因而就可依据DNADNA分子的大小使其分离。分子的大小使其分离。该过程可以通过把该过程可以通过把分子量标准参照物分子量标准参照物和样品一起和样品一起进行电泳而得到检
3、测。进行电泳而得到检测。溴化乙锭（溴化乙锭（EBEB）为扁平状分子，在紫外光照射下发射）为扁平状分子，在紫外光照射下发射荧光。荧光。EBEB可与可与DNADNA分子形成分子形成EB-DNAEB-DNA复合物，其荧复合物，其荧光强度与光强度与DNADNA的含量成正比。据此可粗略估计样品的含量成正比。据此可粗略估计样品DNADNA浓度。浓度。注意事项：EB是致癌物质，切勿用手接触，更不要污染环境。2、琼脂糖凝胶电泳的影响因素 1）样品DNA分子大小和分子构型 2）琼脂糖浓度 p33 取决于所分离DNA片段的大小 3）缓冲液 TAETAE、TBETBE 4）电泳条件 电压：电压：3-5V/cm 3-
4、5V/cm 时间：时间：30-60min30-60min常用的电泳缓冲液 二、聚丙烯酰胺凝胶电泳 以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质，其分辨率高于以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质，其分辨率高于琼脂糖凝胶电泳，用于核酸和蛋白质的分离、纯化及琼脂糖凝胶电泳，用于核酸和蛋白质的分离、纯化及检测。分离小片段检测。分离小片段DNA(11000bp)DNA(11000bp)效果较好效果较好,其分辩其分辩力极高。力极高。聚丙烯酰胺由丙烯酰胺单体和甲叉双丙烯酰胺聚合聚丙烯酰胺由丙烯酰胺单体和甲叉双丙烯酰胺聚合而成。而成。三、脉冲电场凝胶电泳（PFGE）（Pulse-field gel electrophoresis）P
5、FGEPFGE是交替变换电场方向的电泳，以一定的角度一是交替变换电场方向的电泳，以一定的角度一定的时间变换电场方向。定的时间变换电场方向。DNADNA分子在交替变换方向的电场中作出反应所需的分子在交替变换方向的电场中作出反应所需的时间取决于它的大小。分子越大，改变构象的时间时间取决于它的大小。分子越大，改变构象的时间就越长，重新定向的时间就越长，移动也就慢，反就越长，重新定向的时间就越长，移动也就慢，反之越快。之越快。可区分长度为可区分长度为50-100Kb50-100Kb以上，甚至以上，甚至MbMb级别的大片段级别的大片段DNADNA分子。分子。第二节 分子杂交技术 杂交的基本原理 探针及探
6、针标记 杂交的基本方法一、基本原理 变性与复性杂交技术：是利用DNA分子的变性、复性以及碱基互补配对的高度精确性，对某一特异性DNA序列进行探查的技术。二、探针与探针标记 探针（probe）：用作检测的被标记的短片段特异DNA或RNA序列。（一）探针的种类基因组基因组DNADNA探针、探针、cDNA cDNA 探针、寡核苷酸探探针、寡核苷酸探针、针、RNARNA探针探针（二）标记物同位素标记：同位素标记：3232PP、3535SS、33HH等等非同位素标记：地高辛、生物素、荧光素等非同位素标记：地高辛、生物素、荧光素等 切口平移法 切口平移法 随机引物法 随机引物法 Klenow DNA Kl
7、enow DNA 聚合酶 聚合酶 3 3末端补平反应 末端补平反应 T4 T4多核苷酸激酶 多核苷酸激酶 5 5末端引入标记磷酸基团 末端引入标记磷酸基团 末端转移酶 末端转移酶 3 3末端连接标记的核苷酸 末端连接标记的核苷酸（三）探针标记方法11、均匀标记、均匀标记22、末端标记法、末端标记法l lDnase Dnase 使使DNADNA双链产生缺口双链产生缺口 l lDNADNA聚合酶将生物素标记的聚合酶将生物素标记的dNTPdNTP插入到缺口的插入到缺口的33端端 1）切口平移标记法2）随机引物法（random priming）以68 个核苷酸长的序列随机的寡核苷酸作为引物，在Klen
8、ow 片段作用下，加入带有标记的dNTP 进行随机扩增，即可形成放射性同位素标记的DNA 探针。优点：由于随机引物标记仅仅需要一种酶，比较简单，条件易于控制，杂交重复性好，所以应用较多。末端标记用用Klenow DNA Klenow DNA 聚合酶对聚合酶对DNADNA的的33末端进行标记末端进行标记用T4 多核苷酸激酶标记DNA5 末端 p-CGACG-OH OH 碱性磷酸酶(AKP）OH OH-CGACG-OH OH-32PATPT4噬菌体多核苷酸激酶（PNK）32P-CGA.CG-OH OH三、分子杂交的基本方法 Southern 杂交 Northern杂交 Western杂交 菌落（噬
9、菌斑）原位杂交 斑点杂交（一）Southern杂交 1975年，英国Edwen Southern创建 检测DNA杂交方法，即将DNA电泳、转印到固相支持物上，用探针进行检测的方法。Southern 杂交主要用来判断某一生物样品中是否存在某一基因，以及该基因所在的限制性酶切片段的大小。关键技术 1、Southern印迹转移：核酸样品在凝胶上进行分离后，通过影印的方式转移到固相支持物滤膜上的过程。2、分子杂交：将具有核酸印迹的滤膜同带有放射性标记的DNA/RNA探针进行杂交。因此，核酸杂交也被称为“DNA印迹杂交”。1、Southern印迹转移 可以通过毛细管虹吸法或电转移或真空转移的方式，将凝胶
10、上的 DNA 转移到硝酸纤维素滤膜或尼龙膜上。最后通过 80 处理或紫外线照射将 DNA 固定在滤膜上。吸水纸毛细管虹吸法Southern转膜2、分子杂交 预杂交 预杂交 将结合了 将结合了 DNA DNA 分子的滤膜先与特定的预杂液进行预杂 分子的滤膜先与特定的预杂液进行预杂交，也就是将滤膜的空白处用鱼精 交，也就是将滤膜的空白处用鱼精 DNA DNA 或牛奶蛋白封闭 或牛奶蛋白封闭起来，防止在杂交过程中滤膜本身对探针的吸附。起来，防止在杂交过程中滤膜本身对探针的吸附。杂交 杂交 在一定的溶液条件和温度下，将标记的核酸探针与滤膜 在一定的溶液条件和温度下，将标记的核酸探针与滤膜混合，如果滤膜
11、上的 混合，如果滤膜上的 DNA DNA 分子存在与探针同源的序列，分子存在与探针同源的序列，那么探针将与该分子形成杂合双链，从而吸附在滤膜上。那么探针将与该分子形成杂合双链，从而吸附在滤膜上。洗膜 洗膜 经过一定的洗涤程序将游离的探针分子除去。经过一定的洗涤程序将游离的探针分子除去。1.待测DNA样品的制备、酶切2.待测DNA 样品的电泳分离：琼脂糖凝胶电泳3.凝胶中DNA的变性：碱变性4.Southern转膜(印迹)：毛细管虹吸印迹法、电转移法、真空转移法5.Southern杂交(预杂交、杂交、洗膜)6.杂交结果的检测：放射性自显影/生化检测Southern杂交流程总结（a）（b）（c）（
12、d）（e）基因组DNA DNA限制片段 硝酸纤维素滤膜 同探针同源杂交的基因DNA片段 X光底片 Southern blottingSouthern blot的结果 Southern DNA Southern DNA 印迹杂交之 印迹杂交之X X光显像图片 光显像图片 水稻（水稻（Oryza sativa L Oryza sativa L.).)的叶绿体 的叶绿体DNA DNA分别用核酸内切限制酶 分别用核酸内切限制酶Bgl Bgl(A-C)(A-C)、BamH BamH（D-F D-F）、）、EcoR EcoR（G-I G-I）、和）、和Hind Hind（J-L J-L）消化，加样在含有）
13、消化，加样在含有EtBr EtBr染料的 染料的1%1%的琼脂糖凝胶电泳中作电泳分离，然后同 的琼脂糖凝胶电泳中作电泳分离，然后同32P 32P标记的玉米 标记的玉米psbA psbA探针作 探针作Southern Southern杂交。杂交。X X光底片中显现的阳性条带 光底片中显现的阳性条带，表明含有水稻的，表明含有水稻的psbA psbA基因序列。基因序列。A B C D E F G H I J K L（二）Northern 杂交 检测特定RNA（主要是mRNA）分子的方法 与Southern杂交的不同靶核酸：RNA RNA电泳:变性凝胶电泳 应用：检测在转录水平某基因是否表达（三）We
14、stern 杂交蛋白杂交蛋白杂交/蛋白质的免疫印迹蛋白质的免疫印迹检测蛋白质，即将电泳分离的蛋白质转移到固检测蛋白质，即将电泳分离的蛋白质转移到固相载体上，通过抗体以免疫反应形式检测滤膜相载体上，通过抗体以免疫反应形式检测滤膜上是否存在被抗体识别的蛋白质，并判断其分上是否存在被抗体识别的蛋白质，并判断其分子量。所用的探针不是子量。所用的探针不是 DNA DNA 或或 RNA RNA，而是而是针对某一蛋白质制备的特异性抗体。针对某一蛋白质制备的特异性抗体。主要步骤蛋白质样品的制备蛋白质样品的制备SDS-SDS-聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)(PAGE)电泳电泳蛋白质的电转移蛋白质的电转
15、移靶蛋白的免疫学检测靶蛋白的免疫学检测 靶蛋白于第一抗体（一抗）反应 靶蛋白于第一抗体（一抗）反应 与标记的第二抗体（酶标二抗）反应 与标记的第二抗体（酶标二抗）反应 显色反应：酶促反应 显色反应：酶促反应Western 杂交主要用来检测细胞或组织样品中是否存在能被某抗体识别的蛋白质，从而判断在翻译水平上某基因表达与否、表达量、分子量。酶标记的第二抗体第一抗体膜上结合的蛋白成分第一抗体膜上结合的蛋白成分（四）菌落（或噬菌斑）原位杂交 colony situ hybridization直接以菌落或噬菌斑为对象来检测重组子的技术。直接以菌落或噬菌斑为对象来检测重组子的技术。因为生长在培养基平板上的
16、菌落或噬菌斑，是按照因为生长在培养基平板上的菌落或噬菌斑，是按照原来的位置不变的转移到滤膜上，并在原位发生溶原来的位置不变的转移到滤膜上，并在原位发生溶菌、菌、DNADNA变性和杂交作用，故也称为原位杂交。变性和杂交作用，故也称为原位杂交。（五）斑点杂交 斑点杂交是分子杂交中最简单的一种，直接将 DNA 或 RNA 分子以斑点的形式固定在滤膜上，然后进行分子杂交。当核酸分子的斑点面积变得更小，在单位面积滤膜上处理的样品数量就更多，当检测的灵敏度进一步提高后，就发展成 DNA 芯片。9 9、静夜四无邻，荒居旧业贫。、静夜四无邻，荒居旧业贫。5 5 月 月-23-235 5 月 月-23-23Mo
17、nday,May 15,2023 Monday,May 15,2023 10 10、雨中黄叶树，灯下白头人。、雨中黄叶树，灯下白头人。16:08:16 16:08:1616:08:16 16:08:1616:08 16:085/15/2023 4:08:16 PM 5/15/2023 4:08:16 PM 11 11、以我独沈久，愧君相见频。、以我独沈久，愧君相见频。5 5 月 月-23-2316:08:16 16:08:1616:08 16:08May-23 May-2315-May-23 15-May-23 12 12、故人江海别，几度隔山川。、故人江海别，几度隔山川。16:08:16 1
18、6:08:1616:08:16 16:08:1616:08 16:08Monday,May 15,2023 Monday,May 15,2023 13 13、乍见翻疑梦，相悲各问年。、乍见翻疑梦，相悲各问年。5 5 月 月-23-235 5 月 月-23-2316:08:16 16:08:1616:08:16 16:08:16May 15,2023 May 15,2023 14 14、他乡生白发，旧国见青山。、他乡生白发，旧国见青山。15 15 五月 五月 2023 20234:08:16 4:08:16 下午 下午16:08:16 16:08:165 5 月 月-23-23 15 15、比不
19、了得就不比，得不到的就不要。、比不了得就不比，得不到的就不要。五月 五月 23 234:08 4:08 下午 下午5 5 月 月-23-2316:08 16:08May 15,2023 May 15,2023 16 16、行动出成果，工作出财富。、行动出成果，工作出财富。2023/5/15 16:08:16 2023/5/15 16:08:1616:08:16 16:08:1615 May 2023 15 May 2023 17 17、做前，能够环视四周；做时，你只能或者最好沿着以脚为起点的射线向前。、做前，能够环视四周；做时，你只能或者最好沿着以脚为起点的射线向前。4:08:16 4:08:
20、16 下午 下午4:08 4:08 下午 下午16:08:16 16:08:165 5 月 月-23-23 9 9、没有失败，只有暂时停止成功！。、没有失败，只有暂时停止成功！。5 5 月 月-23-235 5 月 月-23-23Monday,May 15,2023 Monday,May 15,2023 10 10、很多事情努力了未必有结果，但是不努力却什么改变也没有。、很多事情努力了未必有结果，但是不努力却什么改变也没有。16:08:16 16:08:1616:08:17 16:08:1716:08 16:085/15/2023 4:08:17 PM 5/15/2023 4:08:17 PM
21、 11 11、成功就是日复一日那一点点小小努力的积累。、成功就是日复一日那一点点小小努力的积累。5 5 月 月-23-2316:08:17 16:08:1716:08 16:08May-23 May-2315-May-23 15-May-23 12 12、世间成事，不求其绝对圆满，留一份不足，可得无限完美。、世间成事，不求其绝对圆满，留一份不足，可得无限完美。16:08:17 16:08:1716:08:17 16:08:1716:08 16:08Monday,May 15,2023 Monday,May 15,2023 13 13、不知香积寺，数里入云峰。、不知香积寺，数里入云峰。5 5 月
22、 月-23-235 5 月 月-23-2316:08:17 16:08:1716:08:17 16:08:17May 15,2023 May 15,2023 14 14、意志坚强的人能把世界放在手中像泥块一样任意揉捏。、意志坚强的人能把世界放在手中像泥块一样任意揉捏。15 15 五月 五月 2023 20234:08:17 4:08:17 下午 下午16:08:17 16:08:175 5 月 月-23-23 15 15、楚塞三湘接，荆门九派通。、楚塞三湘接，荆门九派通。五月 五月 23 234:08 4:08 下午 下午5 5 月 月-23-2316:08 16:08May 15,2023
23、May 15,2023 16 16、少年十五二十时，步行夺得胡马骑。、少年十五二十时，步行夺得胡马骑。2023/5/15 16:08:17 2023/5/15 16:08:1716:08:17 16:08:1715 May 2023 15 May 2023 17 17、空山新雨后，天气晚来秋。、空山新雨后，天气晚来秋。4:08:17 4:08:17 下午 下午4:08 4:08 下午 下午16:08:17 16:08:175 5 月 月-23-23 9 9、杨柳散和风，青山澹吾虑。、杨柳散和风，青山澹吾虑。5 5 月 月-23-235 5 月 月-23-23Monday,May 15,2023
24、 Monday,May 15,2023 10 10、阅读一切好书如同和过去最杰出的人谈话。、阅读一切好书如同和过去最杰出的人谈话。16:08:17 16:08:1716:08:17 16:08:1716:08 16:085/15/2023 4:08:17 PM 5/15/2023 4:08:17 PM 11 11、越是没有本领的就越加自命不凡。、越是没有本领的就越加自命不凡。5 5 月 月-23-2316:08:17 16:08:1716:08 16:08May-23 May-2315-May-23 15-May-23 12 12、越是无能的人，越喜欢挑剔别人的错儿。、越是无能的人，越喜欢挑剔
25、别人的错儿。16:08:17 16:08:1716:08:17 16:08:1716:08 16:08Monday,May 15,2023 Monday,May 15,2023 13 13、知人者智，自知者明。胜人者有力，自胜者强。、知人者智，自知者明。胜人者有力，自胜者强。5 5 月 月-23-235 5 月 月-23-2316:08:17 16:08:1716:08:17 16:08:17May 15,2023 May 15,2023 14 14、意志坚强的人能把世界放在手中像泥块一样任意揉捏。、意志坚强的人能把世界放在手中像泥块一样任意揉捏。15 15 五月 五月 2023 20234:
26、08:17 4:08:17 下午 下午16:08:17 16:08:175 5 月 月-23-23 15 15、最具挑战性的挑战莫过于提升自我。、最具挑战性的挑战莫过于提升自我。五月 五月 23 234:08 4:08 下午 下午5 5 月 月-23-2316:08 16:08May 15,2023 May 15,2023 16 16、业余生活要有意义，不要越轨。、业余生活要有意义，不要越轨。2023/5/15 16:08:17 2023/5/15 16:08:1716:08:17 16:08:1715 May 2023 15 May 2023 17 17、一个人即使已登上顶峰，也仍要自强不息。、一个人即使已登上顶峰，也仍要自强不息。4:08:17 4:08:17 下午 下午4:08 4:08 下午 下午16:08:17 16:08:175 5 月 月-23-23MOMODA POWERPOINTLorem ipsum dolor sit amet,consectetur adipiscing elit.Fusce id urna blandit,eleifend nulla ac,fringilla purus.Nulla iaculis tempor felis ut cursus.感 谢 您 的 下 载 观 看专家告诉