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1、食品中大肠菌群的检验1.食品微生物检验的意义l有害微生物对人类和生产的影响：引起食品变质引起食物中毒导致人体患病1.食品微生物检验的意义l是衡量食品卫生质量的重要指标,也是判定被检食品能否食用的科学依据l可以判断食品加工环境及食品卫生的情况,为卫生管理工作提供科学依据l可以有效地防止或减少食物中毒和人畜共患病的发生l保证产品的质量,避免不 必要的损失生产环境的检验生产环境的检验生产环境的检验生产环境的检验原辅料的检验原辅料的检验原辅料的检验原辅料的检验食品加工、储藏、销售食品加工、储藏、销售食品加工、储藏、销售食品加工、储藏、销售储环节的检验储环节的检验储环节的检验储环节的检验食品的检验食品的
2、检验食品的检验食品的检验2.食品微生物检验的范围3.食品卫生标准中的微生物指标l指示菌概念:在常规安全卫生监测中，用以指示检样卫生状况及安全性的指示性微生物类型：一般性、特定性（如粪便污染）、其他项目：菌落总数、大肠菌群、耐热大肠菌群、总大肠菌群l食源性致病菌及其毒素沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌及其肠毒素、溶血性链球菌、蜡样芽孢杆菌、副溶血性弧菌、单增李斯特菌、阪崎肠杆菌、空肠弯曲菌、致病性大肠埃希氏菌等l霉菌酵母菌及其毒素黄曲霉毒素B1、B2等l其他项目抗生素残留、beta-内酰胺酶、商业无菌等商业无菌l概念：罐头食品经过适度的杀菌后，不含有致病性微生物，也不含有在通常温度下能在其中繁
3、殖的非致病性微生物。这种状态叫做商业无菌。l保温：低酸性罐头食品36，10天酸性罐头食品30 1，10天预定输往热带地区的低酸性食品55 1，57天l每日检查 是否胖听、泄露开罐留样pH测定感官检查涂片染色接种4.常用仪器设备4.0 光学显微镜4.1 培养箱4.2 水浴箱4.常用仪器设备4.3 超净工作台：侧流式、直流式和外流式4.4 干燥箱4.5 高压蒸汽灭菌器4.常用仪器设备4.6 离心机4.7 滤菌器4.8 均质器（匀浆器）4.9 冰箱4.常用仪器设备l玻璃器材及其他试管三角烧瓶烧杯玻璃棒培养皿接种环涂布棒酒精灯移液管移液器剪刀、镊子试管架一、实验目的一、实验目的l1.1.了解大肠菌群在
4、食品检验中的意义。了解大肠菌群在食品检验中的意义。l2.2.掌握检验的程序和步骤。掌握检验的程序和步骤。l3.3.通过通过MPNMPN检索表的检索得出实验结果。检索表的检索得出实验结果。二、基本原理二、基本原理l大肠菌群系指一群在大肠菌群系指一群在32323737下下24h24h内，能内，能发酵乳糖产酸、产气、需氧或兼性厌氧的革发酵乳糖产酸、产气、需氧或兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。该菌群主要来源于人兰氏阴性无芽孢杆菌。该菌群主要来源于人畜粪便，故以此作为粪便污染指标，来评价畜粪便，故以此作为粪便污染指标，来评价食品卫生质量状况，推断食品中肠道致病菌食品卫生质量状况，推断食品中肠道致病菌污染
5、的可能。具有广泛的卫生学意义。污染的可能。具有广泛的卫生学意义。大肠菌群的食品卫生学意义大肠菌群的食品卫生学意义l作为粪便污染食品的指标菌，MPN值愈低则说明食品受粪便污染程度及对人体健康危害程度愈低l作为肠道致病菌污染食品的指针，大肠菌群数量越多则肠道致病菌存在的可能性就越高，但两者之间并不总是呈平行关系l要求食品中大肠菌群完全不存在是不可能的，重要的是其污染程度即菌量产产气气克雷白氏菌克雷白氏菌ETEC EIEC 阴沟阴沟肠肠杆菌杆菌EHEC 大肠菌群大肠菌群耐热大肠菌群（粪大肠耐热大肠菌群（粪大肠菌群）菌群）大肠杆菌产气气克雷白氏菌克雷白氏菌大大肠埃希氏菌埃希氏菌柠檬檬酸杆菌酸杆菌O15
6、7：H7大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌是人和温血动物肠道是人和温血动物肠道是人和温血动物肠道是人和温血动物肠道内普遍存在的细菌，是粪便中内普遍存在的细菌，是粪便中内普遍存在的细菌，是粪便中内普遍存在的细菌，是粪便中的主要菌种。一般生活在人大的主要菌种。一般生活在人大的主要菌种。一般生活在人大的主要菌种。一般生活在人大肠中并不致病，但它侵入人体肠中并不致病，但它侵入人体肠中并不致病，但它侵入人体肠中并不致病，但它侵入人体一些部位时，可引起感染一些部位时，可引起感染一些部位时，可引起感染一些部位时，可引起感染 。大肠菌群大肠菌群大肠菌群大肠菌群并非细菌学分类命名，而是卫生细菌领域的用语，并非细菌
7、学分类命名，而是卫生细菌领域的用语，并非细菌学分类命名，而是卫生细菌领域的用语，并非细菌学分类命名，而是卫生细菌领域的用语，它不代表某一个或某一属细菌，而指的是具有某些特性的一它不代表某一个或某一属细菌，而指的是具有某些特性的一它不代表某一个或某一属细菌，而指的是具有某些特性的一它不代表某一个或某一属细菌，而指的是具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌，这些细菌在生化及血清学方面并组与粪便污染有关的细菌，这些细菌在生化及血清学方面并组与粪便污染有关的细菌，这些细菌在生化及血清学方面并组与粪便污染有关的细菌，这些细菌在生化及血清学方面并非完全一致。一般认为可包括大肠埃希氏菌、柠檬酸杆菌、非完全一
8、致。一般认为可包括大肠埃希氏菌、柠檬酸杆菌、非完全一致。一般认为可包括大肠埃希氏菌、柠檬酸杆菌、非完全一致。一般认为可包括大肠埃希氏菌、柠檬酸杆菌、产气克雷伯氏菌和阴沟肠杆菌等。产气克雷伯氏菌和阴沟肠杆菌等。产气克雷伯氏菌和阴沟肠杆菌等。产气克雷伯氏菌和阴沟肠杆菌等。总大肠菌群总大肠菌群总大肠菌群总大肠菌群系指一系指一系指一系指一群在群在群在群在3737培养培养培养培养2424小小小小时能发酵乳糖、产时能发酵乳糖、产时能发酵乳糖、产时能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼酸产气、需氧和兼酸产气、需氧和兼酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性厌氧的革兰氏阴性厌氧的革兰氏阴性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。性无芽
9、胞杆菌。性无芽胞杆菌。性无芽胞杆菌。耐热大肠菌群耐热大肠菌群耐热大肠菌群耐热大肠菌群即粪大肠菌即粪大肠菌即粪大肠菌即粪大肠菌群，作为一种卫生指标菌，群，作为一种卫生指标菌，群，作为一种卫生指标菌，群，作为一种卫生指标菌，耐热大肠菌群中很可能含耐热大肠菌群中很可能含耐热大肠菌群中很可能含耐热大肠菌群中很可能含有粪源微生物，因此耐热有粪源微生物，因此耐热有粪源微生物，因此耐热有粪源微生物，因此耐热大肠菌群的存在表明可能大肠菌群的存在表明可能大肠菌群的存在表明可能大肠菌群的存在表明可能受到了粪便污染，可能存受到了粪便污染，可能存受到了粪便污染，可能存受到了粪便污染，可能存在大肠杆菌。但是，耐热在大肠
10、杆菌。但是，耐热在大肠杆菌。但是，耐热在大肠杆菌。但是，耐热大肠菌群的存在并不代表大肠菌群的存在并不代表大肠菌群的存在并不代表大肠菌群的存在并不代表对人有什么直接的危害。对人有什么直接的危害。对人有什么直接的危害。对人有什么直接的危害。致病性大肠杆菌致病性大肠杆菌致病性大肠杆菌致病性大肠杆菌能引起食物能引起食物能引起食物能引起食物中毒。致病性菌株能侵入肠中毒。致病性菌株能侵入肠中毒。致病性菌株能侵入肠中毒。致病性菌株能侵入肠粘膜上皮细胞，具有痢疾杆粘膜上皮细胞，具有痢疾杆粘膜上皮细胞，具有痢疾杆粘膜上皮细胞，具有痢疾杆菌样致病力。肠致病性大肠菌样致病力。肠致病性大肠菌样致病力。肠致病性大肠菌样
11、致病力。肠致病性大肠杆菌（杆菌（杆菌（杆菌（EPECEPEC）、肠毒素性大）、肠毒素性大）、肠毒素性大）、肠毒素性大肠杆菌（肠杆菌（肠杆菌（肠杆菌（ETECETEC）和肠侵袭性）和肠侵袭性）和肠侵袭性）和肠侵袭性大肠杆菌（大肠杆菌（大肠杆菌（大肠杆菌（EIECEIEC）等。）等。）等。）等。O157:H7O157:H7（EHEC)EHEC)肠出血性大肠杆菌，感染性腹泻肠出血性大肠杆菌，感染性腹泻肠出血性大肠杆菌，感染性腹泻肠出血性大肠杆菌，感染性腹泻是近年来新发现的危害严重的肠是近年来新发现的危害严重的肠是近年来新发现的危害严重的肠是近年来新发现的危害严重的肠道传染病，已逐渐成为威胁人群道传染
12、病，已逐渐成为威胁人群道传染病，已逐渐成为威胁人群道传染病，已逐渐成为威胁人群健康的重要公共卫生问题。健康的重要公共卫生问题。健康的重要公共卫生问题。健康的重要公共卫生问题。大肠菌群、粪大肠菌群、大肠杆菌的从属关系大肠菌群、粪大肠菌群、大肠杆菌的从属关系大肠菌群、粪大肠菌群、大肠杆菌的从属关系大肠菌群、粪大肠菌群、大肠杆菌的从属关系GB 4789.3-2010 GB 4789.3-2010 大肠菌群计数大肠菌群计数第一法：大肠菌群第一法：大肠菌群MPNMPN计数法计数法第二法：大肠菌群平板计数法第二法：大肠菌群平板计数法三、检测方法三、检测方法第一法：大肠菌群第一法：大肠菌群MPN计数法计数法
13、大肠菌群计数检验流程0将产气的试管内将产气的试管内样品接种到样品接种到BGLB肉汤肉汤LST不产气（不产气（-）小导管里无气泡小导管里无气泡LST产气（产气（+）需要用到的培养基需要用到的培养基（1 1）LSTLST肉汤培养基：月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤培养基：月桂基硫酸盐胰蛋白胨成分：成分：胰蛋白胨或胰酪胨（胰蛋白胨或胰酪胨（TryticaseTryticase）20g20g，NaCL NaCL 5.0g5.0g，乳糖，乳糖5.0g5.0g，K K2 2HPOHPO4 4 2.75g 2.75g，KHKH2 2POPO4 4 2.75g 2.75g，月桂基硫酸钠月桂基硫酸钠0.1g0.1g，蒸
14、馏水，蒸馏水1000mL1000mL。制法：制法：将各成分溶解于蒸馏水中。分装到有倒立发酵将各成分溶解于蒸馏水中。分装到有倒立发酵管的管的20mm150mm20mm150mm试管中，每管试管中，每管10mL10mL。121121高压灭高压灭菌菌15min15min。最终。最终pH6.80.2pH6.80.2。（2 2）BGLBBGLB：煌绿乳糖胆盐肉汤：煌绿乳糖胆盐肉汤成分：成分：蛋白胨蛋白胨10.0g10.0g，乳糖，乳糖10.0g10.0g，牛胆粉溶，牛胆粉溶液液200mL200mL，0.1%0.1%煌绿水溶液煌绿水溶液13.3mL13.3mL，蒸馏，蒸馏水水800mL800mL，pH7.
15、20.1pH7.20.1。制法：略制法：略抑菌剂的选择抑菌剂的选择l大大肠肠菌菌群群检检验验中中常常用用的的抑抑菌菌剂剂有有胆胆盐盐、十十二二烷烷基基硫酸钠、洗衣粉、煌绿、龙胆紫、孔雀绿等。硫酸钠、洗衣粉、煌绿、龙胆紫、孔雀绿等。l抑抑菌菌剂剂的的主主要要作作用用是是抑抑制制其其它它杂杂菌菌，特特别别是是革革兰兰氏氏阳阳性性菌菌的的生生长长。国国家家标标准准中中LSTLST肉肉汤汤利利用用十十二二烷烷基基硫硫酸酸钠钠作作为为抑抑菌菌剂剂，BGLBBGLB肉肉汤汤利利用用煌煌绿绿和和胆胆盐盐作为抑菌剂。作为抑菌剂。l抑菌剂虽可抑制样品中的一些杂菌，而有利于大抑菌剂虽可抑制样品中的一些杂菌，而有利
16、于大肠菌群细菌的生长和挑选，但对大肠菌群中的某肠菌群细菌的生长和挑选，但对大肠菌群中的某些菌株有时也产生一些抑制作用。些菌株有时也产生一些抑制作用。实验步骤及操作要点：1）无菌取样并制作梯度稀释液；）无菌取样并制作梯度稀释液；2）样品匀液的）样品匀液的pH 值应在值应在6.57.5 之间，必要时分之间，必要时分别用别用1 mol/L NaOH 或或1 mol/L HCl 调节。调节。3）从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超）从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过过15 min。l4）初发酵试验）初发酵试验 每个样品，选择每个样品，选择3个适宜的连续稀释度的样品个适宜的连续稀释度的样
17、品匀液（液体样品可以选择原液），每个稀释度接匀液（液体样品可以选择原液），每个稀释度接种种3管月桂基硫酸盐胰蛋白胨（管月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤，每管）肉汤，每管接种接种1mL（如接种量超过（如接种量超过1 mL，则用双料，则用双料LST肉肉汤），汤），361 培养培养24 h2 h，观察倒管内是否，观察倒管内是否有气泡产生，有气泡产生，24 h2 h产气者进行复发酵试验，产气者进行复发酵试验，如未产气则继续培养至如未产气则继续培养至48 h2 h，产气者进行复，产气者进行复发酵试验。未产气者为大肠菌群阴性。发酵试验。未产气者为大肠菌群阴性。LST结果判断结果判断l大肠菌群的产气量，多
18、者可以使发酵倒管全部充大肠菌群的产气量，多者可以使发酵倒管全部充满气体，少者可以产生比小米粒还小的气泡。如满气体，少者可以产生比小米粒还小的气泡。如果对产酸但未产气的乳糖发酵如有疑问时，可以果对产酸但未产气的乳糖发酵如有疑问时，可以用手轻轻打动试管。用手轻轻打动试管。5）复发酵试验）复发酵试验 用接种环从产气的用接种环从产气的LST肉汤管中分别取肉汤管中分别取培养物培养物1环，移种于煌绿乳糖胆盐肉汤环，移种于煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB）管中，）管中，36 1培养培养48 h2 h，观察产气情况。产气者，计为大肠菌群，观察产气情况。产气者，计为大肠菌群阳性管。阳性管。6）大肠菌群最可能数（）大肠
19、菌群最可能数（MPN）的报告）的报告 按按5）确证的大肠菌群）确证的大肠菌群LST阳性管数，检阳性管数，检索索MPN表（见附录表（见附录B），报告每），报告每g（mL）样品中大肠菌群的样品中大肠菌群的MPN值。值。表表B.1 大肠菌群最可能数（大肠菌群最可能数（MPN）检索表）检索表第二法：大肠菌群平板计数法第二法：大肠菌群平板计数法 需要用到的培养基需要用到的培养基（1 1）VRBAVRBA：结晶紫中性红胆盐琼脂：结晶紫中性红胆盐琼脂成分：蛋白胨成分：蛋白胨7.0g7.0g，酵母膏，酵母膏3.0g3.0g，乳糖，乳糖10.0g10.0g，氯，氯化钠化钠5.0g5.0g，胆盐或，胆盐或3 3号
20、胆盐号胆盐1.5g1.5g，中性红，中性红0.03g0.03g，结晶紫结晶紫0.002g0.002g，琼脂，琼脂15g15g18g18g，蒸馏水，蒸馏水1000mL1000mL，pH7.4pH7.40.11）样品的稀释）样品的稀释：如第一法：如第一法2）平板计数平板计数 选取选取2个个3个适宜的连续稀释度个适宜的连续稀释度,每个稀释度接种每个稀释度接种2个个无菌平皿，每皿无菌平皿，每皿1 mL。同时取。同时取1 mL生理盐水加入无菌平生理盐水加入无菌平皿作空白对照。皿作空白对照。3）及时将）及时将15 mL20 mL冷至冷至46 的结晶紫中性红胆盐琼的结晶紫中性红胆盐琼脂（脂（VRBA）约倾注
21、于每个平皿中。小心旋转平皿，将培）约倾注于每个平皿中。小心旋转平皿，将培养基与样液充分混匀，待琼脂凝固后，再加养基与样液充分混匀，待琼脂凝固后，再加3 mL4 mLVRBA覆盖平板表层。翻转平板，置于覆盖平板表层。翻转平板，置于36 1 培养培养18 h24 h。实验步骤及操作要点：4）平板菌落数的选择）平板菌落数的选择 选取菌落数在选取菌落数在15 CFU150 CFU 之间的之间的平板，分别计数平板上出现的典型和可疑大平板，分别计数平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落。肠菌群菌落。典型菌落为紫红色，典型菌落为紫红色，菌落周围有红色的胆菌落周围有红色的胆盐沉淀环，菌落直径盐沉淀环，菌落直径为为
22、0.5 mm 0.5 mm 或更大。或更大。5）证实试验）证实试验 从从VRBA 平板上挑取平板上挑取10 个不同类型的典个不同类型的典型和可疑菌落，分别移种于型和可疑菌落，分别移种于BGLB 肉汤管肉汤管内，内，36 1 培养培养24 h48 h，观察产气，观察产气情况。凡情况。凡BGLB 肉汤管产气，即可报告为肉汤管产气，即可报告为大肠菌群阳性。大肠菌群阳性。6）大肠菌群平板计数的报告）大肠菌群平板计数的报告 经最后证实为大肠菌群阳性的试管比例乘以经最后证实为大肠菌群阳性的试管比例乘以4）中计数的平板菌落数，再乘以稀释倍数，即为）中计数的平板菌落数，再乘以稀释倍数，即为每每g（mL）样品中
23、大肠菌群数。）样品中大肠菌群数。例：例：10-4样品稀释液样品稀释液1 mL，在，在VRBA平板上有平板上有100个个典型和可疑菌落，挑取其中典型和可疑菌落，挑取其中10个接种个接种BGLB肉汤肉汤管，证实有管，证实有6个阳性管，则该样品的大肠菌群数为：个阳性管，则该样品的大肠菌群数为：1006/10104/g（mL）=6.0105CFU/g（mL）。）。三三 大肠菌群大肠菌群PetrifilmTM测试纸片法测试纸片法四、美国四、美国FDAFDA标准方法标准方法行业标准采用两步法：行业标准采用两步法：用于对出口食品中大肠菌群进行检验用于对出口食品中大肠菌群进行检验 推测试验推测试验证实试验证实
24、试验样品稀释后，样品稀释后，选择三个稀释选择三个稀释度，每个稀释度，每个稀释度接种三管度接种三管LST肉汤发酵肉汤发酵管。管。361培培养养482h，观察，观察是否产气。是否产气。将产气发酵管将产气发酵管培养物转种于培养物转种于煌绿乳糖胆盐煌绿乳糖胆盐（BGLBBGLB）肉汤）肉汤中，中，361培培养养482h ，观观察是否产气察是否产气。以以BGLBBGLB产产气为阳性，气为阳性，查查MPN表，表，报告每报告每ml（g）样品中大样品中大肠菌群的肠菌群的MPN值。值。思考题思考题1大大肠肠菌菌群群的的检检验验分分哪哪几几个个步步骤骤？各各有有何何作作用？用？2在在糖糖发发酵酵试试验验中中，若若发发现现发发酵酵倒倒管管内内存存在在极极微微小小的的气气泡泡，这这种种情情况况可可否否算算作作产产气气阳阳性？性？3造成本实验误差的主要原因有哪些？造成本实验误差的主要原因有哪些？演讲完毕，谢谢观看！