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1、实验二实验二 毛细血管采血、微量吸管及改良牛毛细血管采血、微量吸管及改良牛鲍计数板使用及显微镜法红细胞计鲍计数板使用及显微镜法红细胞计数数 医学检验技术教研室医学检验技术教研室 13级检验用级检验用一、毛细血管采血法目的：掌握毛细血管采血方法。实验器材：专用“采血针”、微量定量吸管、标本容器等。标本：末梢血。操作方法首先用手指按摩采血部位，使中指或无名指指尖自然充血，再用75%酒精棉球消毒皮肤，待酒精挥发干燥后，用左手拇指和食指固定采血部位，右手持消毒刺针，自指尖腹侧迅速刺入2 mm3 mm，让血液自然流出，用消毒棉球擦去第一滴血后，按需要依次采血，采血完毕，用消毒干棉球压住伤口片刻即可。注意
2、事项 所选择的采血部位，不能有冻疮、紫绀、水肿、炎所选择的采血部位，不能有冻疮、紫绀、水肿、炎症等；皮肤消毒后，一定要乙醇挥发干燥后采血，否则流症等；皮肤消毒后，一定要乙醇挥发干燥后采血，否则流出的血会四处扩散而不成滴；为避免交叉感染，采血针在出的血会四处扩散而不成滴；为避免交叉感染，采血针在使用前应进行高压灭菌，并严格实行一人一针制；如穿刺使用前应进行高压灭菌，并严格实行一人一针制；如穿刺后血液不易流出，可于伤口远端稍加压力，或重新穿刺。后血液不易流出，可于伤口远端稍加压力，或重新穿刺。切忌用力挤压，以免混入大量组织液，使血液稀释影响检切忌用力挤压，以免混入大量组织液，使血液稀释影响检验结果
3、，且血液更易凝固；进行多项检查时，采取标本的验结果，且血液更易凝固；进行多项检查时，采取标本的顺序为血小板计数、红细胞计数、血红蛋白测定、白细胞顺序为血小板计数、红细胞计数、血红蛋白测定、白细胞计数等；出血时间测定需另外刺一部位，凝血时间另行测计数等；出血时间测定需另外刺一部位，凝血时间另行测定。定。二、微量吸管使用1、目的：掌握微量吸管的实验方法。2、原理：挤压乳胶头使微量吸管产生负压而吸取液体。3、实验用品：一次性微量吸管、带孔乳胶吸头、试管、2ml吸管、NS等。4、标本：新鲜抗凝血5、操作方法（1）准备吸管 将带孔的乳胶吸头套在微量吸管上，连接处应严密不漏气。（2）加稀释液 取试管1支，
4、加生理盐水2ml.（3）持管吸血 右手拇指和中指夹住吸管及吸头交接处，示指盖住吸头小孔，三个指头轻微用力，排出适量的气体使管内形成较小的负压，将管尖插入抗凝血（或末梢血），三个指头慢慢松劲，吸取抗凝血到所需刻度后，抬起示指，注意管尖始终不要离开液面，以免吸入气泡，也不要过度用力将血液吸入乳胶吸头。（4）拭净余血 用干棉球顺微量吸管口拭净余血。（5）稀释血液 将微量吸管插入含生理盐水（或稀释液）的试管底部，慢慢排出吸管内的血液，再用上清液冲洗管内余血2-3次。（6）洗涤吸管 依次用蒸馏水洗净，95%乙醇脱水。乙醚干燥。如为一次性微量吸管，可省略该步骤。6、注意事项（1）操作步骤3需反复练习才能准
5、确吸取血液到所需量。（2）一次吸取血液到所需的量，吸管内不能有空节也不能吸取血液过多，最好不要超过所需刻度的2mm.（3）稀释血液前一定要拭净管外余血，释放血液时的动作不能太剧烈，避免破坏血液成分或不能利用上清液将管内血液洗净。7、实验评价 微量吸管使用是手工法血细胞分析的第一步，有很多因素影响检验结果的准确性和精确度，如一次性吸管的质量、操作者的技术熟练程度和责任心等。三、改良牛鲍计数板的使用（一）目的：掌握改良牛鲍计数板结构及使用方法。（二）原理：一定倍数稀释的血液或体液混匀后滴入具有固定体积和精密划分刻度的改良牛鲍计数板中，在显微镜下对所选择的区域中的细胞进行计数，在乘以稀释倍数，即可换
6、算成单位体积内的细胞数。（三）、实验用品1、器材 改良牛鲍计数板、专用盖玻片、光学显微镜、绸布、微量吸管、带孔乳胶吸头、刻度吸管、试管。2、试剂 红细胞稀释液（四）标本：抗凝血（五）操作1、稀释血液 取试管1支，加红细胞稀释液2ml,加抗凝血10微升，立即混匀，制成红细胞悬液。2、准备计数板 用绸布拭净改良牛鲍计数板和专业盖玻片，采用推式法从计数板下缘向前平推盖玻片，将其盖在计数池上。3、冲池 用完了吸管吸取制备好的再次混匀的红细胞悬液，沿盖玻片与计数板之间的缝隙冲入计数池。充液量以恰好充满一侧计数池为宜，不可过多、过少或有气泡，否则需重新操作。附：牛鲍计数板基本结构 血球计数板是一块特制的厚
7、型载玻片，载玻片上有四个槽构成三个平台。中间的平台较宽，其中间又被一短横槽分隔成两半，每个半边上面各刻有一小方格网，每个方格网共分九个大方格，中央的一大方格作为计数用，称为计数区。计数区的刻度有两种：一种是计数区分为16个中方格（大方格用三线隔开），而每个中方格又分成25个小方格；另一种是一个计数区分成25个中方格（中方格之间用双线分开），而每个中方格又分成16个小方格。但是不管计数区是哪一种构造，它们都有一个共同特点，即计数区都由400个小方格组成。计数区边长为1mm，则计数区的面积为lmm2，每个小方格的面积为1/400mm2。盖上盖玻片后，计数区的高度为0.1mm，所以每个计数区的体积为
8、0.1mm3，每个小方格的体积为1/4000mm3。四、显微镜法红细胞计数 原理 用用等渗等渗稀释液将血液稀释一定的稀释液将血液稀释一定的倍数后，滴入计数板，在显微镜下计倍数后，滴入计数板，在显微镜下计数一定范围内红细胞数，经换算可求数一定范围内红细胞数，经换算可求得每升血液中的红细胞数。得每升血液中的红细胞数。红细胞稀释液HayemHayem液（液（赫姆氏红细胞稀释液赫姆氏红细胞稀释液）枸橼酸钠稀释液枸橼酸钠稀释液普通生理盐水或加普通生理盐水或加1%1%甲醛的生理盐水甲醛的生理盐水 Hayem液主要成分及作用：主要成分及作用：uNaClNaCl 调节渗透压；调节渗透压；uNaNa2 2SOS
9、O4 4 调节渗透压，提高比重防止细胞调节渗透压，提高比重防止细胞粘连；粘连；uHgClHgCl2 2 防腐；防腐；缺点：遇高球蛋白血症患者，由于蛋白质沉缺点：遇高球蛋白血症患者，由于蛋白质沉淀而使红细胞易凝集。淀而使红细胞易凝集。枸橼酸钠稀释液主要成分及作用：主要成分及作用：NaClNaCl 调节渗透压；调节渗透压；枸橼酸钠枸橼酸钠 调节渗透压，抗凝；调节渗透压，抗凝；甲醛甲醛 防腐；防腐；优点：配制简单，可使红细胞在稀释后较长优点：配制简单，可使红细胞在稀释后较长时间保持正常形态并且不凝集，故应用较时间保持正常形态并且不凝集，故应用较广。广。普通生理盐水或加1%甲醛的生理盐水 急时用。急时
10、用。【操作方法操作方法】l、取红细胞稀释液、取红细胞稀释液1.99ml毫升，放入一小试毫升，放入一小试管内。管内。2、用微量吸管吸血至、用微量吸管吸血至l0ul处。处。3、擦去管尖外部余血将血液迅速轻轻吹入盛、擦去管尖外部余血将血液迅速轻轻吹入盛有红细胞稀释液的试管内，吸上清液嗽洗有红细胞稀释液的试管内，吸上清液嗽洗吸管吸管2-3次，立即摇匀。次，立即摇匀。4、用微量吸管或玻棒取混悬液少量，充入计、用微量吸管或玻棒取混悬液少量，充入计数池内。数池内。5、待、待23分钟，让红细胞完全下沉后，将计分钟，让红细胞完全下沉后，将计数板平放在显微镜台上，用低倍镜观察，数板平放在显微镜台上，用低倍镜观察，
11、如红细胞分布均匀即可换高倍镜进行计数。如红细胞分布均匀即可换高倍镜进行计数。红细胞计数的区域红细胞计数的区域:中心大方格中的中心大方格中的5个中方格个中方格(正中一正中一个和四角各一个个和四角各一个)。充液位置充液位置充液位置充液位置为为红红细细胞胞计计数数区区域域 计数原则计数原则:数上不数下，数左不数右的计数原则数上不数下，数左不数右的计数原则 即凡压在中方格边线即凡压在中方格边线(双线双线)上的红细胞，上的红细胞，只计上侧与左侧线上的细胞，而压在下侧只计上侧与左侧线上的细胞，而压在下侧与右侧线上者不计入。与右侧线上者不计入。压线细胞的计数原则压线细胞的计数原则：数左不数右数左不数右，数上
12、不数下数上不数下 【计算计算】红细胞数红细胞数/L=5个中方格内红细胞数个中方格内红细胞数510200106/L=5个中方格内红细胞数个中方格内红细胞数1010/L =5个中方格内RBC数/1001012 式中式中:5:5个中方格换算成个中方格换算成1个大方格个大方格 10:1个大方格容积为个大方格容积为0.1ul，换算成，换算成 1.0 uL。200：血液的稀释倍数血液的稀释倍数 106:由由1uI换算成换算成1L例：例：红细胞稀释液红细胞稀释液1.99ml1.99ml，加血，加血10ul10ul，混匀。充液，静置混匀。充液，静置2 23min3min，计数中央大，计数中央大方格内四角和正中
13、五个中方格内的红细方格内四角和正中五个中方格内的红细胞胞，共共600600个个，请计算红细胞计数结果。请计算红细胞计数结果。RBC/LRBC/L600600 /525525 1010200200 10106 66.0106.0101212报告方式：报告方式：RBC:X.XX l012/L七七.参考值参考值男性：男性：(4.0 (4.05.5)105.5)101212L L 女性：女性：(3.5 (3.55.0)105.0)101212L L新生儿：新生儿：(6.0(6.07.0)107.0)101212L L 400 400550550 万万/ulul 350 350500500 万万/ulu
14、l(RBC)【注意事项注意事项】1、吸管、试管要注意清洁、干燥以防溶、吸管、试管要注意清洁、干燥以防溶血，操作迅速避免血液凝固，如有血凝块应重血，操作迅速避免血液凝固，如有血凝块应重新采血。新采血。同时做血红蛋白测定，白细胞计数和分类同时做血红蛋白测定，白细胞计数和分类计数，在采血时应先做血膜再做红细胞，然后计数，在采血时应先做血膜再做红细胞，然后做白细胞，血红蛋白检验，避免红细胞破坏。做白细胞，血红蛋白检验，避免红细胞破坏。2、充液：、充液：充液前，红细胞复液要充分摇匀，红细充液前，红细胞复液要充分摇匀，红细胞悬液注入计数池内要求分布均匀，不可胞悬液注入计数池内要求分布均匀，不可有气泡，亦不可有多余液体外溢。有气泡，亦不可有多余液体外溢。3、质量控制：、质量控制：中方格内红细胞分布应均匀，健康成人中方格内红细胞分布应均匀，健康成人每中方格红细胞数约为每中方格红细胞数约为80100个，各中方个，各中方格内之红细胞相近，如悬殊过大格内之红细胞相近，如悬殊过大(超过超过10个个细胞以上的细胞以上的)应重混匀再充填。应重混匀再充填。1.1.HayemHayem红细胞稀释液由哪些成分组成？红细胞稀释液由哪些成分组成？各有什么作用？各有什么作用？2.2.请说出红细胞计数的参考值。请说出红细胞计数的参考值。黔东南民族职业技术学院