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1、中华妇产科杂志 2016 年5月第 51 卷第5期Chin J Obstet Gynecol，May 2016,Vol.51,No.5 321 临床指南荧光定量PCR技术在产前诊断中的应用专家共识荧光定量PCR技术在产前诊断中的应用协作组自2002年起，我国启动了以唐氏综合征等常见染色体异常为主要目标疾病的产前筛查及产前诊断，染色体核型分析技术是确诊的“金标准”。染色体核型分析技术准确、可靠，但以手工操作为主，需要进行细胞培养，存在耗时长、检测通量低、需培养专业人员及实验室建设周期长等诸多问题，已难以满足日益增长的临床产前诊断需求。近年来，分子遗传学诊断技术发展迅速，荧光定量 PCR（quan
2、titative fluorescent polymerase chainreaction,QF-PCR）技术、荧光原位杂交（fluorescencein situ hybridization,FISH）技术、多重连接探针扩增（multiplex ligation dependent probe amplification,MLPA）技术、实时（real time）荧光PCR技术、染色体 微 阵 列 分 析（chromosomal microarray analysis,CMA）技术、产前液相芯片（BACs-on-Beads,BoBs）技术、无创性产前基因检测（noninvasive pren
3、ataltesting,NIPT）等已逐渐成熟，并开始向临床转化。分子遗传学诊断技术多以遗传物质DNA为检测对象，不需要进行细胞培养，为传统的细胞染色体核型分析技术提供了有效的补充。QF-PCR技术是通过检测遗传标记短串联重复序列（STR）进行染色体异常的产前诊断，由Adinolfi等于1995年建立。一定人群中每个STR基因座有数个至数十个的等位基因，而每个个体STR基因座的等位基因数量与染色体数目具有对应关系。QF-PCR基于PCR扩增和毛细管电泳分离技术，通过 定 性、定 量 分 析 STR 的 多 态 性，能 诊 断 出99.2%100.0%目标染色体（21、18、13、X和Y等5种染
4、色体）的非整倍体异常1-4；除此之外，还能检测出三倍体和母体细胞污染5，以及根据STR等位基因的个性化信息判别多余染色体的父亲或母亲来源，为临床提供更多的遗传信息。与其他分子诊断技术相比，QF-PCR技术可半自动化和批量检测，2448 h内能得到结果6，在高通量检测、价格低廉7、可质量控制等方面具有突出优势，有望解决产前诊断技术资源的“缺口”问题。QF-PCR技术是快速靶向分子诊断技术，主要针对21、18、13、X和Y共5种染色体的数目异常，不能检测出所有的染色体异常。QF-PCR技术对高风险染色体异常（可导致异常临床表现）的漏诊风险是临床应用研究中关注的重点。Speevak等4发现，在所有的
5、产前诊断适应证下，QF-PCR技术能检测出98.5%的高风险染色体异常，如果把超声检查结果异常的适应证排除在外，则可以检测出99.92%的高风险染色体异常。2004 年，英国国家筛查委员会（UK NationalScreening Committee,UKNSC）建议，在产前诊断中可用QF-PCR或FISH技术取代染色体核型分析技术；2005年4月，英国临床细胞遗传学和临床分子遗 传 学 协 会（Association for Clinical Cytogeneticsand Clinical Molecular Genetics Society,ACC-CMGS）发布了第1版的QF-PCR应
6、用指南8，2012年又推出了新版8。近年来，世界其他地区的实验室也陆续进行了QF-PCR技术产前诊断的研究，并基本达成共识：在明确诊断适应证的情况下，即当胎儿超声检查未显示结构异常、且孕妇无染色体异常家族史时，QF-PCR技术能可靠地用于常见染色体异常的产前诊断，有助于降低染色体核型分析检测量、减少产前诊断费用、缓解孕妇及家属的等待焦虑9-11。QF-PCR技术在国外已有较广泛的应用，但目前尚未在国内产前诊断临床中普遍开展。为规范使用QF-PCR技术，由国家卫生和计划生育委员会召集、中国医学科学院北京协和医院产前诊断中心主办的“全国产前筛查与诊断技术管理规范编制研讨会”于 2015 年 11
7、月 14 日在成都召开，会议就QF-PCR等快速产前诊断技术的临床应用进展及其在国内应用中存在的具体问题进行了深入而广泛DOI：10.3760/cma.j.issn.0529-567x.2016.05.001通信作者：吕时铭，310006 杭州，浙江大学医学院附属妇产科医院检验科，Email： 322 中华妇产科杂志 2016 年5月第 51 卷第5期Chin J Obstet Gynecol，May 2016,Vol.51,No.5的探讨，并形成了QF-PCR技术在产前诊断中的应用专家共识。一、QF-PCR技术临床应用的适应证1.QF-PCR 技术单独用于产前诊断的指征：（1）常规产前筛查提
8、示染色体非整倍体高风险的孕妇或高龄孕妇（需告知局限性）：有常见染色体非整倍体产前诊断需求，无既往不良孕产史，超声筛查胎儿结构未发现明显异常。（2）NIPT高风险孕妇：已采用针对21三体、18三体、13三体等常见染色体非整倍体的NIPT筛查，提示高风险，需要明确诊断者。2.QF-PCR与其他细胞遗传学分子诊断技术联用的指征：（1）QF-PCR与染色体核型分析技术联合应用于染色体异常的产前诊断：染色体核型分析技术通常需要23周的时间发出报告。QF-PCR与染色体核型分析技术联合应用，有助于早期诊断常见染色体异常，使临床能早期处理异常胎儿，并有助于缓解孕妇及家属的等待焦虑。适用的产前诊断指征包括：产
9、前筛查高风险，高龄孕妇，超声检查示胎儿异常且提示为13、18、21、X、Y等染色体数目异常等。（2）QF-PCR与其他细胞遗传学分子诊断技术同时应用：QF-PCR技术检测的是样本DNA而不是活体细胞，所需样本量少，方便应用。在临床应用其他细胞遗传学分子诊断技术时，可同时应用QF-PCR技术获得13、18、21、X、Y等染色体数目的信息，有助于排除常见染色体异常情况，辨别是否存在母体细胞污染，或对其他分子诊断技术的检测结果进行验证等。其指征包括：在进行单基因遗传病分子诊断时，应用QF-PCR技术检测常见5种染色体的数目异常；在产前诊断操作中疑有母体细胞污染时，利用QF-PCR技术检测的STR多态
10、性信息辨别采集的胎儿标本中是否混有母体组织细胞；当其他用于常见染色体数目异常诊断的分子诊断技术（如FISH）的结果异常或不明确时，可采用QF-PCR技术进行验证。二、QF-PCR 技术在产前诊断应用中的相关问题1.不同的标本类型及处理建议：QF-PCR技术检测可采用各种类型的产前标本。所需要的标本量为羊水15 ml，或绒毛0.22.0 mg，或脐血0.22.0ml。需注意的是，（1）羊水标本离心后如肉眼可见红色血液污染，则需将羊水标本同孕妇外周血标本同时检测，判断有无母体细胞污染；（2）所有的绒毛标本均需将胎儿标本同孕妇外周血标本同时检测，以排除母体细胞污染；（3）由于局限性胎盘嵌合体现象的存
11、在，绒毛标本的细胞可能嵌合有正常及异常核型的细胞，采用绒毛标本提取DNA时应尽可能使用多条绒毛的混合细胞提取核酸；（4）如果绒毛标本经QF-PCR技术检测出染色体三体，而胎儿又无其他临床征象提示异常则建议对绒毛标本进行染色体核型分析，或抽取羊水进行QF-PCR技术检测。2.关于QF-PCR技术检测试剂：建议采用已注册的商品化试剂盒进行QF-PCR技术检测，按试剂盒说明书进行染色体非整倍体异常的诊断。参考ACC-CMGS指南8，试剂盒所采用的STR基因座应在所应用的人群中具有高度的异质性和多态性。其中，常染色体和X染色体的检测基因座应至少有4个，Y染色体特异性检测基因座至少两个（建议包含SRY基
12、因座），同时应包含能反映X染色体、Y染色体数量比例的基因座（如AMEL基因座）；建议加用1个X染色体计数基因座，如TAF9b基因座（同时位于3号染色体短臂和X染色体长臂上），当Y染色体缺如时可以对X染色体计数。3.特殊染色体数目异常的诊断：（1）关于X单体的诊断：如Y染色体特异性检测基因座（如SRY）未出现基因型，并且其余性别基因座均显示为单等位基因型，可初步考虑X单体高风险；确诊需要结合X染色体计数基因座（如TAF9b）的检测。需注意：性染色体的多态性检测（即STR检测）对单体而言只是筛查不是诊断，特别是当STR使用数量较少或家族具有同族血缘关系时假阳性风险更高。确诊必须采用X染色体计数基因
13、座，如果没有，则需应用其他产前诊断技术进行确诊或在出具的报告内说明局限性。（2）关于染色体三体的诊断提示：超过两条染色体的STR出现三等位基因型，其他染色体的STR检测无与之矛盾的结果，提示可能存在染色体三体，可采用其他产前诊断技术进一步验证。（3）关于三体嵌合体的诊断：当某染色体上有单个或多个STR出现多余等位基因（三体最多出现3 个等位基因），应注意观察是否存在嵌合体。QF-PCR技术一般可检测出嵌合比例在20%及以上的三体嵌合体。4.QF-PCR技术检测结果的应用：QF-PCR技术检测结果异常，可单独出具诊断报告，以便临床早期处理异常胎儿；QF-PCR技术检测结果未显示异中华妇产科杂志
14、2016 年5月第 51 卷第5期Chin J Obstet Gynecol，May 2016,Vol.51,No.5 323 常，不排除存在目标染色体以外的其他染色体异常，应在报告中告知QF-PCR检测的局限性和存在其他染色体异常风险等情况。三、产前遗传咨询的相关问题QF-PCR技术的优势在于快速、高通量检测、适用于多种标本类型，在产前诊断领域有广泛的适用性。但QF-PCR技术为目标靶向检测，存在技术固有的局限性。表现在：（1）不能检测出目标范围外的其他染色体异常；（2）无法可靠地检测出低于20%的嵌合体。在进行QF-PCR技术检测前应告知孕妇QF-PCR技术的优势与局限性，并签署知情同意书
15、，在检测后应结合孕妇的临床情况（如胎儿超声检查情况）进行遗传咨询。四、QF-PCR技术在产前诊断中的规范化应用1.产前诊断技术资质：QF-PCR技术临床检测项目应在有产前诊断资质的医疗机构中开展。项目申请的要求参照我国卫生行业标准 胎儿染色体异常与开放性神经管缺陷的产前筛查与诊断技术标准（WS 322.2-2010）。申请QF-PCR技术检测的医师应是经过产前诊断专业培训的、有资质的医师。2.产前遗传咨询资质：在进行产前QF-PCR检测前和检测后，必须对孕妇及家属进行相关的产前遗传咨询。根据2002年颁发的 产前诊断技术管理办法 的有关规定，从事产前诊断技术的卫生专业技术人员，必须经过系统的产
16、前诊断技术专业培训，通过省级卫生行政部门的考核并获得从事产前诊断技术的“母婴保健技术考核合格证书”。3.签署知情同意书：在进行产前QF-PCR技术检测之前，必须与孕妇有充分的知情谈话，需说明QF-PCR技术检测的内容、风险和技术局限性，并签署相关的知情同意书。4.标本采集：参照卫生行业标准 胎儿染色体异常与开放性神经管缺陷的产前筛查与诊断技术标准（WS 322.2-2010）进行标本采集。5.QF-PCR技术的实验室检测：QF-PCR技术检测应在获得体外基因扩增检测资质的PCR实验室中进行。实验室应配备毛细管电泳仪、PCR扩增仪等相应的实验设备，并建有实验操作技术文件；实验室操作人员应经过体外
17、基因扩增检验实验室技术的专业培训并获得许可资质；出具诊断报告的人员应是具备产前诊断资质的医师，并经过QF-PCR技术的相关培训。6.QF-PCR技术检测报告的应用：出具QF-PCR技术检测报告时，应在报告中明确说明检测结果的提示意义与局限性。QF-PCR 技术虽然不能检测完整核型，但对21三体、18三体、13三体及性染色体的数目异常而言，是1项性价比较高的产前分子遗传学诊断技术，有良好的应用前景。在产前筛查蓬勃发展，而国内产前细胞染色体核型分析诊断资源不足的情况下，规范应用QF-PCR技术有助于缓解细胞染色体核型分析供不应求的矛盾，也有助于加强我国染色体异常出生缺陷二级预防的力量，完成常见染色
18、体非整倍体异常的产前诊断，希望在降低严重缺陷儿出生率、提高出生人口素质等方面发挥出积极的社会意义和经济意义。荧光定量PCR技术在产前诊断中的应用协作组专家成员：边旭明（中国医学科学院北京协和医院）、王和（四川大学华西第二医院）、邬玲仟（中南大学医学遗传学国家重点实验室）、胡娅莉（南京大学医学院附属鼓楼医院）、廖世秀（河南省人民医院）、刘俊涛（中国医学科学院北京协和医院）、廖灿（广州市妇女儿童医疗中心）、朱宝生（云南省第一人民医院）、吕时铭（浙江大学医学院附属妇产科医院）、王华（湖南省妇幼保健院）、许争峰（南京市妇幼保健院）、杨慧霞（北京大学第一医院）、徐两蒲（福建省妇幼保健院）、王治国（国家卫
19、生计生委临床检验中心）、蔡艳（济南市妇幼保健院）、戚庆炜（中国医学科学院北京协和医院）、朱宇宁（浙江大学医学院附属妇产科医院）、尹爱华（广东省妇幼保健院）本共识执笔专家：朱宇宁（浙江大学医学院附属妇产科医院）、吕时铭（浙江大学医学院附属妇产科医院）参考文献1Cirigliano V,Ejarque M,Caadas MP,et al.Clinicalapplication of multiplex quantitative fluorescent polymerasechain reaction(QF-PCR)for the rapid prenatal detection ofcommon
20、chromosome aneuploidiesJ.Mol Hum Reprod,2001,7(10):1001-1006.2Ogilvie CM,Lashwood A,Chitty L,et al.The future ofprenatal diagnosis:rapid testing or full karyotype?An audit ofchromosomeabnormalitiesandpregnancyoutcomesforwomen referred for Downs Syndrome testingJ.BJOG,2005,112(10):1369-1375.DOI:10.11
21、11/j.1471-0528.2005.00695.x.3Cirigliano V,Voglino G,Marongiu A,et al.Rapid prenataldiagnosis by QF-PCR:evaluation of 30,000 consecutiveclinical samples and future applicationsJ.Ann N Y AcadSci,2006,1075:288-298.DOI:10.1196/annals.1368.039.4Speevak MD,McGowan-Jordan J,Chun K.The detection ofchromosom
22、e anomalies by QF-PCR and residual risks ascompared to G-banded analysisJ.Prenat Diagn,2011,31(5):454-458.DOI:10.1002/pd.2716.5Mann K,Ogilvie CM.QF-PCR:application,overview andreview of the literatureJ.Prenat Diagn,2012,32(4):309-314.DOI:10.1002/pd.2945.6Ogilvie CM,Donaghue C,Fox SP,et al.Rapid prenataldiagnosis of aneuploidy using quantitative fluorescence-PCR(QF-PCR)J.J Histochem Cytochem,2005,53(3):285-288.DOI:10.1369/jhc.4B6409.2005.