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1、霍乱弧菌肠道定植动力学研究进展DOI:10.3969/j.issn.1006-2084.2018.15.003基金项目:国家自然科学基金(81460317);贵州省科学技术基金(黔科合 LH 字 2014 7553)通信作者 E-mail:minxunzmu163 com摘要:霍乱是一种烈性肠道传染病，致病的关键环节是霍乱弧菌经口腔随被污染的食物进入胃及小肠，最终定植在小肠并释放毒力因子从而引起腹泻型霍乱。霍乱弧菌肠道定植动力学相关机制如下:在霍乱弧菌定植初始阶段，其对宿主胃酸的应激反应能力，以及霍乱弧菌通过形成生物膜促进其在胃液中的存活能力;霍乱弧菌通过对宿主上皮细胞的趋向性运动，接触并穿过
2、黏液层;霍乱弧菌通过感知特定的宿主信号发挥可逆与不可逆黏附作用，从而调控其在肠道中的定植;在定植的最后阶段，霍乱弧菌通过在宿主体内形成微菌落，从而对霍乱弧菌致病能力进行调控。关键词:霍乱弧菌;肠道定植;黏附;毒力因子;致病esearch Progress on Intestinal Colonization Kinetics of Vibrio CholeraeCHEN Yuxi1，HUANG Jian1，2，LI Xiao-ting1，XU Mei1，MIN Xun1，2(1 Department of Laboratory Medicine，Zunyi Medical College，Zu
3、nyi 563003，China;2 Department of Laboratory Medicine，the Affiliated Hospital of Zunyi Medical College，Zunyi 563003，China)Abstract:Cholera is a potent intestinal infectious disease The key to its pathogenesis is Vibrio cholerae entering thestomach and small intestine after ingesting food through the
4、oral cavity，and finally colonizing the small intestine andreleasing virulence factors to cause diarrhea cholera The mechanisms of intestinal colonization dynamics of Vibrio cholerae:In the initial stage of colonization of Vibrio cholerae，its ability of stress response to host gastric acid and the ab
5、ility ofpromoting its survival in succus gastricus by forming biofilm;Vibrio cholerae contacts with and swims through the mucouslayer through the directionality towards the epithelium;Vibrio cholerae plays a reversible and irreversible attachment bysensing a specific host signals，thereby regulating
6、its colonization in the intestine;In the final stage of colonization，Vibriocholerae forms microcolonies in the host to regulate its pathogenicityKey words:Vibrio cholerae;Intestinal colonization;Adhesion;Virulence factor;Pathopoiesis霍乱是我国甲类传染病，临床上多以分泌性腹泻为主要症状1。霍乱弧菌首次于 1905 年在埃及被发现2。霍乱弧菌是一类革兰阴性致病菌，根据
7、O 抗原不同，可分为 200 多种血清型，其中 O1 群和O139 群能引起霍乱暴发流行，致病因子主要是霍乱毒素(cholera toxin，CT)和毒素共调菌毛(toxincoregulated pilus，TCP)3。霍乱的易感人群多集中于免疫力低下的人群，如肝硬化和肿瘤患者 4-5。非O1/O139 群霍乱弧菌是指除 O1 群和 O139 群霍乱弧菌以外的其他霍乱弧菌的总称，临床上主要引起肠胃炎、切口感染、菌血症以及散发的腹泻等。自1817 年以来，霍乱已经在世界范围内引起 7 次暴发流行6。目前对于霍乱的治疗主要是补液，辅以抗生素治疗，重度未经治疗的霍乱患者的病死率高于77%7-8。经
8、及时治疗后，病死率可低于10%9-10。霍乱的预防，目前主要以口服疫苗为主11。霍乱经消化道感染人体，当食入或饮入含霍乱弧菌的食物或水后，细菌到达胃。一般情况下，胃酸能够将霍乱弧菌杀死，但当感染的细菌量较多或胃酸分泌不足时，霍乱弧菌成功穿过胃到达小肠，抵御肠腔和黏液中胆汁和抗菌肽的杀菌作用，穿透小肠组织的黏液层，进入小肠上皮细胞，并在其表面附着和增殖，最终有效地定植在小肠，释放相应的毒力因子从而引起腹泻型霍乱。现着重介绍霍乱弧菌在肠定植方面的相关机制，以期为深入研究和后续微生物致病的机制研究提供新的策略。1定植初始阶段1 1霍乱弧菌的耐酸反应(acid tolerance response，A
9、T)一般情况下，游离的霍乱弧菌对胃的正常低pH 环境非常敏感，但某些疾病或其他原因导致胃pH 升高时，引起疾病症状所需的细菌数量可以减少5 7 个数量级。有文献报道，流行地区部分霍乱患者的胃酸量较少，表明这些个体可能比其他人更容易感染霍乱弧菌12。霍乱弧菌能产生 AT，指细菌对胃酸的适应应激反应能力，能促进霍乱弧菌在致命的酸性环境中生存，AT 曾被证明能影响细菌的定植，对于霍乱的流行有重要作用。在幼鼠的小肠定植实验中发现了许多与定植相关的因子，可分为几个功能群，包括代谢活动、细菌定植过程的调节、感知及适应压力，还有一些未知的功能等。AT 与霍乱弧菌中外膜蛋白(outer membrane pr
10、otein Uporin，OmpU)、转录调节蛋白 Tox，CadC、解螺旋酶HepA、谷 胱 甘 肽 合 成 酶(glutathione synthetase，GshB)以及 DNA 修复和重组酶(DNA recombinationand repair enzyme，ecO)等 蛋 白 的 功 能 密 切 相关13-14。例如，转录调节因子 CadA 介导的赖氨酸脱羧是 AT 的一个重要组成部分，CadA 是 CadB 操纵子中的第二个基因，编码赖氨酸反转运蛋白，CadC 编码一种酸反应，是 CadAB 的正转录调节因子。CadC 是霍乱弧菌转录调节蛋白 Tox 家族中的一员，影响霍乱弧菌的
11、定植和毒力。另外，在对9 个耐酸突变体的竞争分析试验中，GshB，HepA 和ecO的基因突变导致细菌在小肠的定植量明显减少。表明霍乱弧菌的 AT 有利于细菌定植从而增强其毒力。活的非可培养状态(viable but non-cul-turable state，VBNC)是指细菌在不良环境条件下能收缩成球形，不能使用常规的培养方法将其培养出来，但仍具有代谢活性及传染性的特殊细胞存在形式，被认为是帮助霍乱弧菌越冬的一种“休眠状态”。针对其他物种的研究已经证实，处于 VBNC的细菌耐酸性显著增强15。VBNC 有利于霍乱弧菌在环境中的长期生存，在霍乱弧菌感染人体及致病方面也发挥了重要作用。1 2生
12、物膜能促进霍乱弧菌的存活生物膜是指附着于有生命或无生命物体表面被细菌胞外大分子包裹的有组织的细菌群体，被认为是细菌在抵抗不良环境条件下(营养缺乏、温度变化、pH 改变、抗生素等抵抗因素)的一种生存策略，能促进细菌的存活。有研究表明，在孟加拉国每年春季和秋季出现霍乱小暴发时，生物膜内的不可培养细胞也在这两个季节出现生长高峰16。表明生物膜与霍乱流行有很大关系。研究证实，霍乱弧菌生物膜可成功存活于人类低 pH 胃液环境中17。无论霍乱弧菌生物膜是否完整，其感染宿主的剂量均较未形成生物膜的同类细菌数量级低18。Hung 等19 的研究表明，胆汁能够刺激霍乱弧菌生物膜形成。然而，也有研究提示牛磺胆酸盐
13、(胆汁的一种组分)能够诱导霍乱弧菌生物膜的降解20。因此，胆汁对生物膜的作用仍有待进一步研究。在霍乱流行的早期阶段，霍乱弧菌主要附着于宿主表面，产生 AT，形成生物膜，进入 VBNC，有利于细菌抵抗外界的不良环境条件，促进自身的存活。当霍乱开始大面积流行时，该类细菌主要以微菌落的形式脱落而使患者处于高度传染状态。2接触并穿过黏液层2 1对上皮细胞的趋向性运动运动性是霍乱弧菌成功定植到肠上皮并引起宿主感染的关键因素21。Guentzel 和 Berry22 证实运动性能够驱使细菌穿透宿主肠道黏液层，进一步抵达肠上皮细胞层引发宿主感染，而无运动性的霍乱弧菌突变体的毒力显著减弱。运动性对霍乱弧菌在近
14、端小肠的定植至关重要，但对远端小肠的定植并不是必需的23。可能与细菌的动力能在宿主小肠腔内转移有关，其他基于非动力的致病因素可使霍乱弧菌渗透到小肠绒毛间隙中。趋化性在霍乱弧菌感染中的作用仍存在争议。研究表明，霍乱弧菌的非趋化性突变体在幼鼠模型中较野生型霍乱弧菌更易引起感染，感染所需的非趋化性霍乱弧菌的菌量比野生型少，主要是鞭毛由顺时针旋转变为逆时针旋转24。野生型霍乱弧菌主要定植在远端小肠，而非趋化性突变体能够分布于整个小肠。趋化性在霍乱弧菌肠道的整体分布中所起的作用可能比从肠腔到肠上皮的渗透作用更为普遍。Kamp 等25 证实绝大多数趋化性基因对于感染是不必要的，但对于霍乱弧菌在池塘水中的存
15、活具有重要作用。7292医学综述 2018 年 8 月第 24 卷第 15 期 Medical ecapitulate，Aug.2018，Vol.24，No.15胆汁与碳酸氢盐在黏液层的浓度差异促进了霍乱弧菌的肠定植。CT 和 TCP 是霍乱流行的主要毒力因子，毒力调节蛋白 ToxT/TcpN 是霍乱弧菌毒力的主要调节剂，能控制 TCP 和 CT 的表达26。胆汁中发现的脂肪酸通过与其调节结构域结合来抑制ToxT 的活性，从而抑制毒力级联的表达，直到细菌到达适宜的环境。相反，碳酸氢盐通过增加 ToxT 对DNA 的亲和力而对细菌的毒力级联产生正向调控作用27-28。黏液层的肠腔面和上皮细胞面的
16、胆汁与碳酸氢盐浓度变化是相反的，肠腔面胆汁浓度高、碳酸氢盐浓度低，而上皮细胞面则相反，其胆汁浓度低、碳酸氢盐浓度高，使霍乱弧菌在刚进入黏液层时抑制毒力的级联，而定植于上皮细胞时促进毒力的级联，充分发挥霍乱弧菌的致病作用。2 2穿过黏液层霍乱弧菌抵达宿主肠上皮细胞并产生毒力，其必须穿透约 150 m 厚的高黏性黏液层，是霍乱弧菌菌体长的 50 75 倍29。霍乱弧菌可依赖黏蛋白酶复合物以分解黏蛋白，如血凝素/蛋白酶(hemagglutinin/protease，Hap)，由 HapA 基因编码。研究证实，HapA 的表达与细菌通过黏液层的能力呈正相关。由于黏蛋白诱导 HapA 启动子活性，Hap
17、 可能在霍乱弧菌初始穿透黏液层阶段具有重要作用。此外，HapA 往往在感染后期高表达，也提示 HapA 有利于宿主上皮细胞的脱落和感染后黏液的清除30-32。有文献报道，霍乱弧菌可在肠上皮的定植位置附近表达特异性黏蛋白酶，其中金属蛋白酶(Tox-activated gene A protein，TagA)能够在毒力诱导条件下被霍乱弧菌表达并分泌。其与 TCP 及其他毒力因子呈正相关，TagA 可能在通过肠黏膜运动的后期定植阶段中起重要作用33。另一种霍乱弧菌毒力因子是神经氨酸酶(neuraminidase，NanH)，它是一种细胞外酶，从 GM1 神经节苷脂(一种含唾液酸的寡糖)上皮细胞表面裂
18、解两个唾液酸基团，从而激活受体 CT34。作为一种在感染中具有特定作用的黏蛋白酶，NanH 在促使霍乱弧菌通过黏液层到达特定感染部位方面起着重要作用。黏液素是肠道上皮细胞黏液层的主要成分，黏液素能保护宿主细胞抵抗病原菌的入侵。在霍乱弧菌与宿主的相互作用中，霍乱弧菌会抵抗黏液素的防御作用。此外，黏液素中有一部分对细菌有利的物质，细菌能通过趋化性来感知物质的存在从而加快了游动性。目前，关于黏液素的作用机制及其对游动性的调节作用仍有待进一步研究。3可逆与不可逆黏附31可逆黏附当霍乱弧菌侵入肠道黏液层后抵达上皮细胞，首先会附着于上皮细胞。体内实验证实，霍乱弧菌在定植初期与肠上皮细胞相互作用，而黏附素基
19、因缺失的霍乱弧菌菌株则在幼鼠模型中表现为定植缺陷35-36。霍乱弧菌产生多种非特异性黏附素，在初次与宿主上皮接触时维持其达到适当的位置而不致紧密附着等方面发挥重要作用。目前，已鉴定的霍乱弧菌黏附素包括鞭毛(除了它的运动功能外)，多价黏附分子 7(multivalent adhesionmolecule 7，Mam-7)，N-乙酰氨基葡萄糖结合蛋白(N-acetylglucosamine-binding protein，GbpA)，外膜蛋白(OmpU)37-39。研究证实，Mam-7 是参与霍乱弧菌定植的一个非特异性黏附素。在成纤维细胞培养实验中，随着Mam-7 的减低，霍乱弧菌的附着能力下降约
20、 50%。Mam-7 不与特定的受体或分子结合，而是通过蛋白质-蛋白质以及蛋白质-脂质的相互作用而发挥其毒力效应。Mam-7 可介导许多革兰阴性细菌与不同宿主细胞的结合。Mam-7 是一种通用的黏附因子，可以促进对各种底物的附着，每个物种都能编码特定的黏附素，这些特定编码的黏附素在促进细菌与宿主黏附方面发挥更大的作用。总之，在霍乱弧菌中，Mam-7 可能在肠上皮细胞的起始黏附中起重要作用。GbpA 是霍乱弧菌的另一个非特异性黏附素，有助于细菌黏附在桡足类节肢动物的肠上皮和壳多糖(几丁质)表面。GbpA 能与附着在肠上皮细胞和黏液上的 N-乙酰氨基葡萄糖(N-acetylglucosamine，
21、GlcNAc)分子特异性结合40-41。GbpA 通过上调相应基因增加 HT-29 肠上皮细胞中肠分泌黏蛋白(Mucin2，Mucin3，Mucin5)的产生。与野生型霍乱弧菌相比，GbpA 的基因缺失株对上皮细胞的黏附作用下降 50%。OmpU 是潜在的非特异性黏附素。在弧菌属中外膜孔蛋白有助于附着于生物和非生物表面42。OmpU 在鱼类的黏附中起着重要作用，在细菌对上皮细胞的黏附中有一定作用，有关霍乱弧菌在人体内的黏附作用仍在进一步研究中43。8292医学综述 2018 年 8 月第 24 卷第 15 期 Medical ecapitulate，Aug.2018，Vol.24，No.15研
22、究发现，O1 群霍乱弧菌与 GM1 神经节苷脂发生物理相互作用。霍乱弧菌对 GM1 神经节苷脂包被的脂质双层的黏附作用增加 5 倍44。表明NanH 和 GM1 神经节苷脂在 O1 群霍乱弧菌中可能充当非特异性黏附素或黏附素受体的作用。在定植过程中，非特异性黏附素作为早期附着因子，可以使霍乱弧菌在不利于长时间附着的情况下与底物分离(例如缺乏特定的营养物质时)。一旦霍乱弧菌附着在具有非特异性黏附素的首选底物上，细菌可能随后就会产生特异性黏附素，从而能够进行定向附着，类似于水生环境中富营养基质上生物膜形成的早期阶段。3 2不可逆黏附在霍乱弧菌肠道定植过程中，仍有可能进入不可逆黏附阶段。从可逆黏附转
23、为不可逆黏附，霍乱弧菌必须能够感知特定的宿主信号(如特定碳源)，表明细菌已经到达适当的位置。有研究提供了霍乱弧菌优先使用特定碳源的证据，霍乱弧菌利用肠道中富含的唾液酸(N-乙酰神经氨酸)和 GlcNAc 两种氨基糖，使其在乳鼠感染模型中存在竞争优势45-46。此外，ToxT 控制小 NA TarA的表达，通过影响其编码的葡萄糖转运蛋白(phos-photransferasesystemglucose-specificcomponent，PtsG)，进而影响葡萄糖的摄取。当毒力级联表达时，由于对 ptsG mNA 有负向调控作用，使 TarA 降低葡萄糖的摄取47。结果表明霍乱弧菌具有在肠道黏膜
24、中优先使用某些碳源(葡萄糖)的机制。4定植最后阶段当霍乱弧菌黏附于肠上皮后，细菌降低运动性开始增殖，并启动毒力级联48。由 TCP 介导所形成的霍乱弧菌细菌集簇称为微菌落。微菌落起源于到达肠上皮的单个游离细菌。TCP 在形成微菌落定植方面的作用主要有:TCP 增强细菌对肠上皮细胞的黏附并促进细菌间的相互作用，在体外发挥自凝集效应从而促使细菌聚集，其形成微菌落的能力与定植能力密切相关49。TCP 是 CTX 噬菌体(编码 CT 的丝状噬菌体)的受体。TcpA 的框内缺失突变体在体内显示出编码 CT 主要亚基的基因的表达高度减少，表明完整的 TCP 似乎对于毒力级联是必不可少的50。TCP 也是分
25、泌可溶性定植因子TcpF 所必需的51。在体内，TcpF 突变体有严重的定植缺陷。虽然 TcpF 突变体仍然能够形成微菌落，但是它们较为松散，并且减少了边缘的黏附性。在宿主体内形成微菌落对霍乱弧菌致病是有利的，包括更有效地吸收营养和保护其免受胆汁及其他抗菌药物的影响。微菌落的形成可以使细菌定植能力增强而不被脱落。在具有功能性群体感应系统的菌株中，其毒性在高细菌密度下受到抑制，提示群体感应在霍乱弧菌毒性中作用有限，这可能由于霍乱弧菌的各种产毒株在转录调节因子 Hap 中均有一个自然发生的移码突变，该突变编码群体感应的主调节因子。5小结霍乱弧菌通常以游离菌、微菌落、生物膜的形式进入人体，在肠腔中通
26、过趋向运动与黏液层接触，释放一些黏蛋白酶使细菌穿过高黏性的黏液层到达肠上皮。在肠上皮进行由非特异性黏附素介导的可逆性黏附，如 GbpA、Mam-7 等。随后发生特异性黏附，导致细菌大量繁殖，达到一定浓度时产生 TCP、微菌落和其他毒素而致病。霍乱弧菌肠道定植动力学的相关机制尚不完全清楚，如胆汁和碳酸氢盐的化学梯度对霍乱弧菌毒力基因表达的作用，整个小肠中黏液组分分布和所涉及降解功能的酶，人体感染期间趋化性的特定作用，延长附着所需的条件以及特异性黏附素的识别和鉴定等，仍需要进一步的研究和探索。参考文献 1Nelson EJ，Harris JB，Morris JG Jr，et al Cholera
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