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1、作者简介:梁玉萍(1978 )，女，本科，主管技师，主要从事卫生微生物检验工作。综述肉毒梭菌实验室检测方法的研究进展关键词:肉毒梭菌;检测方法中图分类号:378 8+3文献标识码:A文章编号:1004 8685(2014)06 0909 04近年来，我国有关食品安全的事件频发，尤其是2013 年的肉毒梭菌污染部分企业的奶制品事件，让人们再次对食品安全引起重视。肉毒梭菌是一种革兰氏阳性的厌氧菌，在厌氧环境中，其能分泌大量的肉毒毒素，可致人中毒，甚至死亡。肉毒梭菌的芽孢也有很强的抵抗力，能耐热，耐酸，这能促使其能很好地存活于罐头食品，乳制品，真空包装食品，冷冻食品和密封腌渍食物当中1。随着国内外对
2、肉毒梭菌的检测技术及其毒素的生物活性作了深入研究，现将几种方法概述如下。1生理生化检测技术生理生化检测技术是按照传统的检测模式对样品进行增菌培养，根据菌体生长的理化特性和毒素的生物活性进行分析的一种方法。1 1动物实验法根据肉毒毒素注射的物种、注射的体位以及肉毒毒素的药代动力学的不同，动物实验法可分为小鼠腹腔测定法、小鼠尾静脉检测法、小鼠膈肌检测法、半数麻痹单位检测法、鸟类(鸡)眼睑注射检测法2，而小鼠腹腔测定法是检测肉毒毒素最经典的方法，被公认为肉毒毒素检测的金标准3。但是，动物实验法存在一定的缺点，例如动物的个体差异性，试验所需动物的数量大，试验不能精确定量，不能快速诊断等，这些缺点都限制
3、了该方法在临床上检测肉毒梭菌的应用发展。1 2细菌培养法细菌培养法是通过增菌产毒培养物进行分离培养，利用肉毒梭菌在厌氧条件下接种在卵黄琼脂平板上生长并形成具典型菌落和特征性的虹彩样(或珍珠层样)薄层现象，除 G 型肉毒梭菌外，其他肉毒梭菌亚型均可用此来协助鉴定该菌3。但该方法耗时较长，且步骤繁琐。1 3孢子培养法孢子培养法是近年来新兴的一种检测方法，用于检测非蛋白质水解型(B，E，F 亚型)的肉毒梭菌孢子。由于非蛋白质水解型肉毒梭菌能在 3 的低温下生长并产生毒素蛋白，因此，非蛋白质水解型肉毒梭菌被认为是微加热冷藏食品中的主要健康危害。Plowman J 等建立并评价了非蛋白质水解型肉毒梭菌孢
4、子萌发条件的试验4，该试验将肉毒梭菌孢子置于 12 种不同组合的萌发条件中，探索出孢子萌发最佳的孵育条件，并利用 Bioscreen 自动化分析仪对萌发的孢子进行分析和检测，实验结果与用相差光学显微镜进行验证的结果相符。该方法具有专一、敏感的特点，适用于食品企业的内部检测，为食品工业微生物定量风险分析提供了重要的数据。2免疫学检测技术免疫学检测技术是以抗原和抗体的特异性反应为基础，通过病原体刺激机体产生免疫球蛋白(抗体)而建立的一种检测技术。免疫学方法是目前肉毒毒素检测领域应用最为广泛的检测方法，可定性定量检测，但这种方法检测必须存在高亲和性抗体，而且不能区分毒素是否具有活性。根据检测技术的不
5、同可分为免疫层析法、乳胶凝集法、酶免疫法等。2 1胶体金免疫层析法胶体金免疫层析技术是以纤维层析材料为固相，通过毛细作用使样品溶液在层析条上泳动，并同时使样品中的待测物与层析材料上相对应的受体(抗原或抗体)发生高特异性、高亲和性的免疫反应，层析过程中形成的抗原 抗体 金颗粒复合物被富集或截留在层析材料的一定区域(检测带)，从而得到直观的实验结果(显色)。该技术结合了胶体金标记技术、免疫检测技术和层析技术等多种方法，具有操作简单、敏感、特异、快速的特点，因而它被应用到检测食物、患者呕吐物或粪便以及血清和土壤中的肉毒毒素，制成免疫层析检测试纸条。左庭婷等研制了 A 型肉毒毒素胶体金免疫层析试纸条5
6、，可以特异性检测 A、B 和 E 型肉毒毒素，其灵敏度可达2 U/ml，且与金黄色葡萄球菌肠毒素等抗原无交叉反应，但还不能对毒素进行精确的定量。国外也有研究表明，胶体金免疫层析法对肉毒梭菌感染的快速检测具有非常重要的意义。Sharma 等对两种检测肉毒毒素的胶体金免疫层析试剂盒进行评估6。试剂盒的909中国卫生检验杂志2014 年 3 月第 24 卷第 6 期Chin J Health Lab Tec，Mar 2014，Vol 24，No 6检测限均为 10 ng/ml(毒素 A 和 B)，20 ng/ml(毒素E)，反应时间仅为 15 min 30 min。2 2乳胶凝集法乳胶凝集试验是以乳
7、胶颗粒作为载体的一种间接凝集试验，利用抗原与抗体特异性结合的特点，加上人工大分子的乳胶颗粒而发生肉眼可见的凝集反应。据研究表明，在检测 A、B 和 E 型肉毒梭菌毒素中，利用抗毒素组份免疫球蛋白致敏的乳胶粒进行凝集试验，能检出 4 ng/ml 8 ng/ml 毒素，且未见 A、B 和 E 毒素之间出现交叉反应，食物标本也不需要特珠处理，食物成份对检出没有干扰，其方法的灵敏度和特异性未见降低7，8。该方法简便、快速、特异，适用于现场检测，但容易出现假阳性，故逐渐被其他检测技术所取代。23酶免疫法酶免疫(Enzyme immunoassay，EIA)技术，是把抗原抗体免疫反应的特异性和酶的高效催化
8、作用有机地结合在一起的一种检测技术，可测抗原和抗体。在食品微生物检测中，应用较多的是酶联免疫吸附法(ELISA)9。据报道，ELISA 法可以检测纯毒素，肉毒梭菌培养物等其他干扰成分较少的样本，但是复杂样本(如食物、粪便、脓等)中的一些成分会对实验产生干扰，导致灵敏度降低10。常规 ELISA的灵敏度比小鼠活性实验低 10 倍 100 倍11，12。随着信号放大系统的研究发展，很多信号放大系统被引入常规 ELISA 以提高其灵敏度。Sharma 等使用地高辛标记抗体(digoxigenin labeled antibody)的 ELISA检测食物中肉毒梭菌 A、B、E、F 型毒素13，结果显示
9、，在 4 型毒素混合的酪蛋白缓冲液中，4 种毒素的检测限为 60 pg/ml 176 pg/ml，而在食物样本中，可检出 2 ng/ml 的肉毒毒素。目前，该方法已被 FDA 认可作为肉毒毒素中毒的筛查手段之一，用于肉毒毒素的快速诊断，但完全确诊仍需进行小鼠活性试验。2 4电化学发光免疫法电化学发光免疫技术(Electrochemiluminescence immunoassay，ECLIA)是继放射免疫、酶免疫、荧光免疫、化学发光免疫测定以后的新一代标记免疫测定技术。该技术利用了钌标记抗体作为检测抗体，在加电压时可以发出可见光，通过测定发光强度可以用于检测。目前，已建立的电化学发光免疫方法的
10、检测限可以达到小鼠活性实验的水平。ivera 等采用电化学发光免疫检测技术 14，检测了未稀释的人血清、尿液等临床样本以及食物样品(全牛奶、苹果汁、牛肉和鸡蛋)中的 A、B、E 和 F 型肉毒神经毒素，并用 BioVeris M 系列 MI 分析仪进行分析。试验结果显示，检测临床样本的灵敏度为 A 型和 E 型毒素 50 pg/ml，B 型毒素100 pg/ml，F 型毒素400 pg/ml，检测食物样品的灵敏度为 A 型毒素50 pg/ml，B、E 和 F 型毒素 50 pg/ml 100 pg/ml。最近，电化学发光技术更被推广应用到多种生物毒素的检测当中，结合免疫磁性分离技术，可检测各种
11、生物毒素和细菌芽孢。Gatto 等人采用一种将免疫磁性分离和电化学发光传感器结合起来的自动检测系统15，对多种生物毒素进行了测定，试验显示 A 型肉毒杆菌毒素、霍乱 亚基、蓖麻毒素、葡萄球菌内毒素B 等多种生物毒素的检测限可达 10 g 15 g。该技术具有敏感、快速和稳定的特点，尤其对于测定可溶性或颗粒抗原时的灵敏度极高。但应当指出的是，检测基质对电化学发光影响大，仪器通用性不高，操作复杂，难以实现高通量检测。3分子生物学检测技术分子生物学检测技术是以聚合酶链式反应(Poly-merase chain reaction，PC)为基础的检测方法。病原微生物具有自己独特的核酸序列和基因结构，利用
12、分子生物学技术，确认被检样品中存在某种病原菌特有的核酸序列和基因产物，从而对病原菌做出诊断。3 1聚合酶链式反应(PC)聚合酶链式反应(PC)是一种核酸体外特异性扩增的技术，它以待扩增的两条核苷酸链为模板，由人工合成的寡核苷酸为介导，通过 DNA 聚合酶快速扩增核酸序列。近年来，该技术已被广泛应用于检测肉毒梭菌的各亚型，作为检测肉毒梭菌的一种辅助手段16 18。PC 技术与传统的生理生化检测方法相比，由于检测的标本经热裂解处理，迅速灭活了菌体和毒素，相对的实验操作危险性较低。但是，PC 技术目前仍存在一定的检测缺陷。国内有研究表明16，肉毒梭菌与食品混合后检测，其敏感性有所下降，只有 106
13、108。试验通过比较 10 种食品对 PC 反应的抑制程度，发现蜂蜜、牛奶、豆豉和花生酱的抑制效应最强，而玉米最弱。此外，赵晋等利用 PC 技术对 A、B、E、F 和 G 型肉毒梭菌进行检测时17，发现 PC 技术能扩增一些神经毒素原性酪酸菌的毒素基因，不能准确区分肉毒梭菌和神经毒素原性酪酸梭梭菌。3 2荧光定量 PC实时定量 PC(eal timePC)，即荧光定量 PC，是在 PC 反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个 PC 进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。该技术具有灵敏度高、特异性强、重复性好等特点，据报道19，20，荧光定量 PC 与普通 PC 相比
14、，其灵敏度提高约 100 倍，且与伤寒沙门菌、变形杆菌、金黄色葡萄球菌、肠出血型大肠埃希菌 O157H7 等 5 种食源性病原菌无交叉反应。此外，荧光定量 PC 在实际样品检测中具较好的适用性，试验可直接使用庖肉培养基进行检测，无需平板分离培养。张瑞玲等对牛肉罐头样品中 3 种肉毒梭菌不同含量(1 105cfu/g，1 104cfu/g，1 103cfu/g)的标准菌株进行检测21，检测灵敏度可达 1 103cfu/mL。相对于普通 PC，荧光定量 PC 更可靠，避免了普通 PC 因无法分辨相近大小的扩增片段或扩增产物带较弱以致无法准确判断结果的情况发生。019中国卫生检验杂志2014 年 3
15、 月第 24 卷第 6 期Chin J Health Lab Tec，Mar 2014，Vol 24，No 63 3环介导等温核酸扩增法环介导等温核酸扩增法(Loop mediated isothermal amplification，LAMP)是2000 年由 Notomi 等开发的一种新颖的恒温核酸扩增方法，它采用能特异识别靶序列上 6 个位点的 4 条引物及一种具有链置换活性的 DNA 聚合酶，在恒温条件下(60 65)进行核酸的指数扩增。该方法可通过肉眼进行观察判定，大大简化了操作过程，降低了操作成本，适用于现场检测。目前，LAMP 技术应用于肉毒梭菌、霍乱弧菌、白色念珠菌等重要病原微
16、生物的快速检测方面，其特异性强、敏感性高，比传统的细菌分离培养技术更快速更敏感22 24。国内有相关研究采用 LAMP 技术检测了婴幼儿食品中的多种致病微生物25，包括阪崎肠杆菌、空肠弯曲菌、肠毒素性产气荚膜梭菌、A 型肉毒梭菌和白色念珠菌等，并与普通 PC、实时荧光 PC 相比较。其中，在检测A 型肉毒梭菌时，LAMP 方法的最低检测限仅为11 1 pg/tube，其灵敏度略低于所用荧光 PC 方法的灵敏度。该研究同时指出，采用 LAMP 方法检测婴幼儿食品中的致病菌，需注意样品的前处理过程，以确保 DNA 提取效率。3 4PC DHPLCPC DHPLC 是 DNA 聚合酶链反应(PC)结
17、合变性高效液相色谱(denaturinghigh performance 1iquid chromatography，DHPLC)高通量核酸检测方法。变性高效液相色谱采用离子对反相高效液相色谱的原理，通过使用特殊的耐高温液相色谱分离柱，同时采用温度调控的方式，对核苷酸片段分子进行分析分离。该技术具有快速准确、自动化程度高等特点，可对食品中致病菌进行定性检测或进行相对定量检测。近年来，该技术已被应用于肉毒梭菌的检测中。杨大伟采用 PC DHPLC 对肉毒梭菌进行检测26，其最低检测限可达到 11 pg/tube，仅低于荧光定量 PC 方法的灵敏度。国内也有研究利用 PC DHPLC 技术对热加工
18、食品和水产品中的致病菌进行检测27。试验分别对肉毒梭菌等三种芽孢菌同时进行 PC DHPLC 和多重 PC DHPLC 检测，结果显示，该技术与经典的培养生化鉴定方法相比，具有很好的符合性和结果重现性，均无假阳性和假阴性结果产生。其中，肉毒梭状芽胞杆菌的检测限可达300 cfu/ml。同时，试验还对罐头、牛奶等6 大类3258 份热加工食品样品进行检验，检出的样本结果采用经典的国家标准方法验证，均证实多重 PC DH-PLC 方法与 GB 方法结果相符。但需要指出的是，若被检样品在与阳性扩增的同一位置上出现特异性吸收峰，但峰高 2 mV 时，则为可疑样品，需要通过国标方法或其他方法进行确认。4
19、结语综述所述，肉毒梭菌的检测方法是多样的。目前，小鼠活性试验仍然是我国检测肉毒梭菌的标准方法。虽然传统的检测方法有效、特异，但同时存在检测成本高、检测时间长等问题。而免疫学检测技术、分子生物学技术等新型技术的应用，弥补了传统检测方法的不足和缺陷，对于食品安全和临床诊断具有重要意义。随着人们对肉毒梭菌的菌体结构、基因片段及其毒素生物活性的深入研究，建立一种高通量、自动化、快速简便的肉毒梭菌检测方法是国内外学者研究的重点，而多种技术的联合检测应用将会是今后肉毒梭菌实验室检测发展的方向。参考文献 1马卫红，马卫平 肉毒梭菌毒素中毒J 新疆畜牧业，2002，(2):36 2张雪平 肉毒毒素生物学活性及
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21、AppliMicrobiol，2002，92(4):681 694 5左庭婷，端青，姜永强，等 A 型肉毒毒素胶体金免疫层析法检测试纸条的研制J 军事医学科学院院刊，2003，27(6):435 436 6Sharma SK，Eblen BS，Bull L，et al Evaluation of lateral flowClostridium botulinum neurotoxin detection kits for food analysisJAppl Environ Microbiol，2005，71(7):3935 3941 7齐铁英 用反向被动乳胶凝集试验检测肉毒梭菌毒素J 兽医药
22、品通讯，1986，(3):33 35 8郑玉玲，雷祚荣 反向乳胶凝集法快速检测肉毒 A、B 型毒素 J 中国公共卫生，1996，12(1):33 34 9杨向莹，江志毅，杨娜 快速方法在食品微生物检测中的应用 J 中国食品工业，2006，(5):49 50 10Guglielmo Viret V，Attre O，Blanco Gros V，et al Compari-son of electrochemiluminesence assay and ELISA for the detection ofClostridium botulinum type B neurotoxin J J Immu
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24、d enzymeimmunoassay for detection of botulinum neurotoxin type AJ Hy-bridoma(Larchmt)，2008，27(1):43 47 13Sharma SK，Ferreira JL，Eblen BS，et al Detection of type A，B，E and F Clostridium botulinum neurotoxins in foods by using an am-plified enzyme linked immunosorbent assay with digoxigenin la-beled an
25、tibodies J Appl Environ Microbiol，2006，72(2):12311238 14ivera V，Gamez FJ，Keener WK，et al apid detection of Clos-tridium botulinum toxins A，B，E and F in clinical samples，select-ed food matrices，and buffer using paramagnetic bead based elec-trochemiluminescence detectionJ Anal Biochem，2006，353(2):248
26、256 15Gatto Menking DL，Yu H，Brumo J G，et al Sensitive detectionof biotoxoids and bacterial spores using an immunomagnetic electro-119中国卫生检验杂志2014 年 3 月第 24 卷第 6 期Chin J Health Lab Tec，Mar 2014，Vol 24，No 6chemoluminescence sensorJ Biosens Bioelectron，1995，10(67):501 507 16王颖群，严共华，雷祚荣 PC 检测食品标本中 A_B_E
27、 和 F 型肉毒梭菌 J 中国公共卫生，1997，13(9):560 561 17赵晋，郭宗琪，杨小蓉，等 聚合酶链式反应对食物中肉毒的检测J 预防医学情报杂志，2006，22(1):113 115 18王兴民，孟筱琦，王成怀 多重聚合酶链式反应检测 C、D 型肉毒神经毒素基因J 中国人兽共患病杂志，1999，15(1):14 16 19Fach P，Micheau P，Mazuet C，et al Development of real timePC tests for detecting botulinum neurotoxins A，B，E，F produ-cing Clostridiu
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29、丽青，等 产霍乱毒素霍乱弧菌环介导等温扩增快速检测方法:中国，101386885P，2009 03 18 24雷质文，贺楠，姜英辉，等 白色念珠菌环介导等温扩增快速检测方法:中国，101381775P，2009 03 11 25贺楠 婴幼儿食品中几种致病微生物的 LAMP 技术构建及初步应用研究D 青岛:中国海洋大学，2009 26杨大伟 变性高效液相色谱技术在快速检测食品微生物中的应用研究 D 合肥:安徽农业大学，2011 27郑秋月 热加工食品和水产品中致病菌检测技术体系建立D 沈阳:沈阳农业大学，2009收稿日期:2013 10 18(上接第 908 页)标识规范;感染性样本采集与运输规
30、范;样本检测过程操作规范;应急装备、警报设备功能状态;人员健康状况;菌(毒)种、感染性样品的管理;意外事故处理的应急准备(如紧急淋浴器、洗眼器状况和急救箱装备完整性等);废弃物的分类收集、存放与消毒处置等。现场发现有偏离要求时，要求操作人员立即进行纠正;对较严重偏离的，则填写日常生物安全监督记录或不符合生物安全工作控制记录。监督员及时跟踪督促不规范工作和行为的整改。3 3人员健康管理为建立健全实验室人员的健康管理，首先对病原微生物检测、流调采样等风险岗位的人员建立个人健康监护档案。并通过以下措施有效地监控各风险岗位人员的健康状况。(1)由生物安全办公室负责每年组织各岗位人员进行一般性健康体检。
31、(2)评估各风险岗位可能接触的危险生物因子或某特定病原微生物，并尽可能给予相关的疫苗接种或预防服药。如甲肝疫苗、戊肝疫苗、流感疫苗、霍乱疫苗等。(3)对病原微生物检测人员(包括新进的检测人员在进行工作前)每年进行密切接触的微生物指标检测，如甲肝病毒、戊肝病毒、麻疹病毒、风疹病毒、HIV、梅毒螺旋体等的抗体检测，并保留本底血清。以上检验结果或免疫记录均存入个人健康监护档案。其次生物安全监督员日常负责监视本部门人员是否出现与从事的生物因子相关的临床症状、体征的疾病情况，若发现疑似与实验活动内容相关的异常情况将及时按程序要求上报，并立即采取有效控制错施。3 4生物安全演练生物安全演练是对实验室发生安
32、全事故时应急处置的综合检验。也是每年实验室安全计划中的重要内容。一般基层疾控机构内部的紧急事故(主要是发生于 BSL 2):包括未涉及人身伤害的一般性意外事故(如感染性材料的溢漏、安全设备意外失效事故、危险化学品意外泄露等);涉及人身伤害的意外事故(如刺伤、潜在感染性物质的食入、生物安全柜正压等)以及火灾、水灾、地震等。疾控机构外部的紧急事故:包括个人防护不当的职业暴露;样品采集的职业暴露;样品包装与运输的意外泄漏;废弃物管理疏失扩散等。通过定期选择安全事故的模拟演练，从而检查包括事故报警求援渠道畅通性、应急处置人员到达现场的及时性、个人防护装备使用的正确性、应急物质准备、安全撤离、现场控制和
33、消毒等。从而不断提高疾控机构实验室人员的生物安全意识和事故应急处置能力。3 5体系持续有效运行生物安全管理体系运行后，在生物安全办公室协调下，实验室管理层及相关部门各尽其职。依据体系文件管理要求，一方面与质量管理体系中共性的要求实行兼容管理(如实验室准入制度、文件控制、设施设备管理、内务检查管理、菌种保存与管理等)，另一方面保持生物安全体系运行的相对独立。结合基层疾控机构工作的特点，严格生物安全管理要求的有效实施，并通过体系独立的内部审核与管理审核，使管理体系不断得到改进和完善。从而防止了生物安全事故的发生，有效保护基层疾控机构实验室人员和公众的健康与安全。参考文献 1孙巍，许欣 实验室生物安全的发展现状J 中国卫生检验杂志，2005，15(9):1147 2何剑锋 基层疾控系统实验室生物安全现状分析和管理探讨 J 中国卫生检验杂志，2009，19(7):1666 1667 3祁国民 病原微生物实验室生物安全M 北京:人民卫生出版社，2006:28 35 4中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 GB19489 2008 实验室 生物安全通用要求 S 北京:中国标准出版社，2008收稿日期:2013 11 10219中国卫生检验杂志2014 年 3 月第 24 卷第 6 期Chin J Health Lab Tec，Mar 2014，Vol 24，No 6