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1、 基金项目重庆市卫生局中医药科技资助项目(ZY20132132);重庆市永川区创新能力建设平台资助项目(Ycstc2014bf5001);重庆市大足区科技计划资助项目(DZKJ，2014ACC1084);重庆医科大学附属永川医院院级重点研究资助项目(YJZD201302，YJZQN201534);重庆医科大学第五临床学院大学生创新实验资助项目(201606)作者简介黎，男，硕士研究生，主治医师，研究方向:微流控芯片临床血液分析，Tel:023-85381760 作者单位 1 重庆医科大学附属永川医院中心实验室，重庆402160;2 重庆市血液中心永川分中心，重庆402160;3 重庆医科大学附
2、属永川医院输血科，重庆402160;4 重庆市大足区中医院，重庆402360 通讯作者李远，Tel:18983022607，E-mail:liyuan_1985999163 com在生理流动条件下分析血小板黏附聚集的简易微流控芯片技术 摘要 目的发展一种在生理流动条件下分析血小板黏附聚集的简易微流控芯片技术。方法微流控分析芯片基本结构由直微通道及两侧的样品池和出口组成;利用理论计算和有限元数值软件 ANSYS 对微通道流体动力学行为进行分析;微通道用型胶原蛋白修饰，分别在 200 s1静脉生理性剪切率和 1000 s1动脉生理性剪切率条件下使血液流过微通道，同时通过荧光显微摄像动态记录血液中荧
3、光标记血小板与型胶原蛋白表面的黏附聚集图像。结果理论和数值分析显示，700 m 70 m(宽深比 10 1)的微通道具有最优的流体剪切率大小分布;相比 200 s1低剪切率，在 1000 s1剪切率条件下血小板初始黏附时间、聚集速率和最大表面覆盖面积均显著降低(P 0 05);在 1000 s1剪切率条件下，抗凝药物替罗非班处理呈浓度依赖性地降低血小板表面聚集率，IC50值为238 nmol/L。结论该微流控芯片技术可在生理相关性流体剪切率环境下动态分析血小板黏附聚集，血样少，方法简单易行，未来可用于血小板功能临床检测、抗凝药物药效和小型动物模型凝血分析。关键词 微流控芯片;微通道;血栓;血小
4、板黏附;剪切率 中图分类号-331;446 1 文献标志码 A 文章编号 1674-9960(2017)07-0586-08DOI:10 7644/j issn 1674-9960 2017 07 008A simple microfluidic technology for assaying platelet adhesion and aggregationunder physiological flowLI Yang1，DING Ling2，DENG Su-rong3，YANG Wei1，XIAO Wen-hai4，LI Yuan1*(1 Central Laboratory of Yon
5、gchuan Hospital，Chongqing Medical University，Chongqing 402160，China;2 YongchuanBlood Center of Chongqing，Chongqing 402160，China;3 Blood Transfusion Department of Yongchuan Hospital，ChongqingMedical University，Chongqing 402160，China;4 Dazu TCM Hospital，Chongqing 402360，China)*Corresponding author，Tel
6、:18983022607，E-mail:liyuan_1985999163 com Abstract ObjectiveTo develop a simple microfluidic chip technology for analyzing platelet adhesion and aggregationunder the condition of physiological flow MethodsThe basic structure of the proposed microfluidic chip was a straightmicrochannel，where a sample
7、 pool and an outlet were located on each side respectively The fluid dynamic behavior，of thefluid in the microchannel was analyzed by theoretical calculation and finite element numerical analysis software ANSYSThe microchannel was first coated with type collagen protein Then，blood flowed through the
8、 microchannel at 200 s1venous physiological shear rate and 1000 s1arterial physiological shear rate respectively The behavior of the fluorescencelabeled platelet adhesion and aggregation was recorded by fluorescence microscopy esultsTheoretical calculation andfinite element numerical analysis showed
9、 that the microchannel with a width of 700 m and a height of 70 m(aspectration 10 1)had a uniform fluidic shear rate distribution Compared with those at the 200 s1shear rate，the initialadhesion time，aggregation rate and the maximum surface cover rate of the platelet were significantly reduced at the
10、1000 s1shear rate(P 0 05)At the 1000 s1shear rate，tirofiban，an anticoagulant drug，significantly reduced theplatelet aggregation in a concentration-dependent manner and the IC50was 23 8 nmol/L ConclusionThe technologydeveloped in this paper can dynamically assay platelet adhesion and aggregation unde
11、r the condition of physiological flowThe proposed microfluidic methods have the advantage of simple implementation and low sample cousumpation，and can beused for point-of-care detection of human platelet function，assay of the efficacy of anticoagulant drugs and for inspection of685军事医学2017 年 7 月 第 4
12、1 卷 第 7 期Mil Med Sci，Vol 41，No 7，Jul，2017洋the thrombin behaviors of small animal models Key words microfluidic chip;microchannel;thrombus;platelet adhesion;shear rate血小板作为外周血重要成分参与众多生理、病理过程1。在凝血生理过程中，血管损伤处细胞外基质蛋白暴露在血液中，少量血小板将首先黏附在细胞外基质蛋白表面，随后血小板被激活，通过自分泌的二磷酸腺苷(ADP)和血栓素 A2(TXA2)等凝血因子从血液中募集其他血小板，最终通过血
13、小板的GPb/a 受体和纤维蛋白原结合发生聚集反应2。血小板黏附聚集功能抑制将导致出血风险3，而功能亢进将增加动脉粥样硬化、冠状动脉疾病、心肌梗死、卒中等血栓疾病风险4。因此，血小板黏附聚集功能的评价对于出血性或血栓性疾病的发病机制研究及临床诊断具有重要意义。目前，血小板聚集功能已成为临床的基础检测项目之一，现有检测技术和系统包括光电比浊法5、全血电阻法6、PFA-100 血小板功能仪7、PL-11 血小板分析仪8、Verifynow 系统9 及血栓弹力图仪10 等。然而，上述技术均在静态环境中分析血小板功能，与体内血小板发生黏附聚集行为所处的生理性流体剪切力环境存在较大差异。另一方面，一些研
14、究报道血小板黏附聚集行为与流体剪切力环境密切相关11，12，因此，现有的静态血小板功能分析技术得到的结果并不能真实地反映体内流动血小板的黏附聚集功能。为考虑血小板功能分析所处的流体剪切率环境，传统的平板流动腔广泛用于在流动条件下研究血小板的黏附聚集13，14。然而，由于流动腔尺寸较大，每次实验需要 5 10 ml 样品，限制了其在血液样品来源受限条件下的应用。另一方面，随着微纳米加工技术的广泛应用，越来越多的研究显示微流控芯片在研究血小板黏附聚集中呈现独特优势15 17，包括流体剪切力环境的精确控制、血液及血管壁相互作用的体内局部结构特征模拟、与血小板聚集和血栓形成中相关联因素(血管内皮细胞、
15、细胞外基质、血小板抑制剂)的引入和控制、降低血液样品用量等。如 Jain 等18 利用微流控芯片技术模拟体内狭窄的小动脉网络，在体外和离体条件下实现了病理、生理性流动环境下对患者血液凝固和血小板功能的评价。Li 等19 发展了一种能同时在4 个独立狭窄微通道内产生跨生理和病理状态的流动剪切力(500 13 000 s1)微流控芯片，结合由650 nm 激光二极管和线性 CCD 构成的光学系统实现了血小板聚集通量分析。相比上述复杂结构的微流控分析芯片，Kent 和 Lucitt 等20，21 构建了由玻璃基底、激光切割的双面胶和聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)叠加而成的直线型微通道微流控芯片，并在可
16、控的剪切率条件下分别研究了血小板在胶原蛋白表面的聚集和阿司匹林片与氯吡格雷的抗血小板治疗效果。然而，上述装置不但不能很好地控制微通道的几何结构，双面胶释放的化学物质还存在一定的血液细胞毒性。此外，尽管当前研究均揭示出微流控芯片技术在血小板黏附聚集分析中的灵活性及应用潜力，但血液在微通道内流动的基本流体动力学行为还未充分揭示。为推广微流控芯片在血小板黏附聚集分析中的应用，本研究发展并验证了一种在流体剪切力环境下分析血小板黏附聚集的简易微流控芯片技术。为提高技术的易实施性，微流控芯片由简单的直微通道主结构构成，并采用本课题组前期发展的感光干膜软光刻工艺加工而成。为精确控制流动剪切率环境，本研究首先
17、通过理论计算和有限元数值分析软件对血液在微通道内的流体动力学进行分析;随后建立了血小板黏附聚集的分析方法和量化参数;最后，基于上述方法分析了剪切率大小对血小板黏附聚集的影响及抗凝药替罗非班抑制血小板黏附聚集效应。1材料与方法1 1主要试剂、设备可溶性型胶原蛋白(北京索莱宝科技);注射用盐酸替罗非班(国药准字 H20090227，山东新时代药业);Sylgard 184 聚二甲基硅氧烷(美国 Dow Cor-ning 公司);HQ-6100 感光干膜(长兴化工);CalceinAM 荧光染料(Invitrogen 公司);3 2%柠檬酸钠静脉血液真空采集管(山东威高);其他常规试剂(长江化工);
18、紫外曝光灯(实验室自制);FM-360 覆膜机(杭州新彩);PDG-32G-2 等离子清洗机(Harrick，NY);1390 喷墨打印机(爱普生);SP01-CS 双向推拉型精密注射泵(嘉善瑞创);71 倒置荧光显微镜(日本奥林巴斯);单色制冷相机(加拿大 Qicam 公司);Streampix 视频录制软件(加拿大 Norpix 公司)。1 2方法1 2 1微流控芯片设计加工血小板黏附聚集分析微流控芯片由直微通道和两侧的样品池及出口组成(图 1)，运行原理为:血液样品加载到样品池中，通过出口产生的负压控制血液样品以设定的剪切率流过微通道并观察血小板在微通道内的黏附聚集行785军事医学201
19、7 年 7 月 第 41 卷 第 7 期Mil Med Sci，Vol 41，No 7，Jul，2017图 1血小板黏附聚集分析 PDMS-玻璃微流控芯片A 微流控芯片结构示意图;B 微流控芯片实物图，橘黄色溶液指示出芯片上的样品池、微通道和出口;C 微流控芯片微通道感光干膜阳模的三维激光显微镜测试;D PDMS 微通道光学显微镜测试为。微流控芯片采用课题组前期报道的感光干膜软光刻工艺加工而成22。加工简易流程为:芯片掩膜图案由 Coreldraw 12 0 软件设计，通过喷墨打印机打印在透明胶片上制成掩膜;将二层感光干膜(单层厚度35 m)通过覆膜机层压在玻璃板上，紫外线透过掩膜对感光干膜照
20、射 50 s，1%碳酸钠显影制成芯片阳模;将 PDMS 基质和固化剂按重量 10 1混合而成的预聚物浇铸在芯片阳模上，抽真空除气泡，60下固化 3 h。将固化后的 PDMS 基片从感光干膜阳模上剥离，利用平头打孔器(直径 7 和1 5 mm)打孔形成样品池和出口，氧等离子清洗机处理(30 W，1 min)后与清洗干净的载玻片进行不可逆键合，形成 PDMS-玻璃微流控芯片。1 2 2血液采集和处理实验血液样品从 6 名健康成年志愿者(男女各 3 名)抽取(本研究经重庆医科大学附属永川医院伦理委员会批准后实施)。志愿者 2 周内无服药史，采集前进行知情同意书告知。静脉血液样品以 1 9(v/v)的
21、 3 2%柠檬酸钠抗凝，室温保存，2 h 内使用。为进行血小板黏附聚集抑制实验，将 10 l 0 9%氯化钠溶液配制的不同浓度盐酸替罗非班药物加入到 1 ml 血液样品中作为药物处理组，只加入 10 l 0 9%氯化钠溶液的血液样品作为对照组。最后，将浓度为 1 mmol/L CalceinAM 荧光染料按 1 500(v/v)加入到血液样品中，轻轻摇匀，放入 37 孵育箱中孵育 15 min。CalceinAM 作为一种活细胞荧光染料，能穿透细胞膜进入细胞后被细胞内酯酶剪切形成 Calcein 发出强绿色荧光，故本研究采用 Calcein AM 对血液样品中血小板进行荧光标记。1 2 3微流
22、控芯片血小板黏附聚集分析在使用微流控芯片进行分析前，微通道进行胶原蛋白修饰。流程如下:微流控芯片用等离子体清洗机(30 W)处理 2 min 增加微流控芯片亲水性;将浓度为 200 g/ml 型胶原蛋白溶液注入微通道，室温(25)静置孵育 4 h，PBS(+Ca2+)溶液轻轻清洗微通道 2 次以移除未黏附的胶原蛋白;在微通道内注入 1%BSA溶液，室温孵育 1 h 封闭活性位点;吸除微通道内的封闭液，用 PBS(+Ca2+)溶液清洗微通道 1 次，4保存待用。将修饰后的微流控芯片放置在倒置荧光显微镜载物台上，用聚四氟乙烯管(内径 1 0，外径 1 5 mm)将芯片出口与注射泵相连，采用回拉模式
23、控制血液样本在微通道内的流动剪切率。微通道内流体剪切率和注射泵流量间的关系可根据泊肃叶(Poiseuille)定律计算，即 v=6Qa2b。其中，v(s1)表示剪切率，Q(l/s)代表流量，a(mm)代表微通道深度，b(mm)代表微通道宽度。当血液在微通道内开始流动时，采用 Streampix 5 0 软件控制相机以帧速为 1 帧/s记录荧光标记血小板在胶原蛋白表面黏附和聚集的885军事医学2017 年 7 月 第 41 卷 第 7 期Mil Med Sci，Vol 41，No 7，Jul，2017影像(物镜，20)，记录 5 min 获得共 300 张序列荧光图像。实验装置示意图和照片见图
24、2。图 2血小板黏附聚集微流控芯片分析装置A 装置示意图;B 装置实物照片血小板黏附聚集行为利用 ImageJ 软件对采集的序列图像进行分析，计算出每张图像中的荧光标记血小板聚集体的表面覆盖率。表面覆盖率量化基于图像分割和二值化处理的图像算法，即将图像中荧光强度高于设定阈值的像素设为 1，低于设定阈值的像素设为 0。血小板表面覆盖率定义为像素值为 1 的像素数量与图像所有像素数量之比。1 3统计分析所有数据用 珋x s 表示，统计分析采用 SPSS13 0软件，两组间比较采用配对 t 检验。P 0 05 表示差异有统计学意义。2结果与讨论2 1微通道内流体动力学行为分析矩形微通道内流体动力学行
25、为与微通道几何尺寸和流体黏度有关。当微通道尺寸 50 m 和流动壁剪切率 100 s1时，流体黏度恒定，不依赖于剪切率大小23。由于本研究中血液在深度70 m的微通道内流动，且壁剪切率为 1000 s1，因此可将流动行为等效为经典的不可压缩牛顿流体在矩形微通道内的流动，流体流动受 Navier-Stokes 动量守恒定律控制。Navier-Stokes 方程的求解过程如下15:V(y，z)=12PL(z2 b2)0Ancos(2n+1)z2bcosh(2n+1)y2b(1)式中，An=16b2(PL)(1)n(2n+1)3cosh(2n+1)a2b，aya，bzb。上述方程中，V(y，z)代表
26、微通道横截面沿深度方向 y 点和宽度方向 z 点的流体速度，a 和 b 代表微通道深度和宽度的 1/2，代表流体黏度(血液正常值为 0 004 Pas)，P/L 代表沿微通道长度方向的压力差。为研究微通道结构对流体动力学的影响并优化微通道结构，设计了宽深比为 5 1和 10 1两种微通道。将式(1)两端进行微分得到两种不同微通道横截面不同位点的剪切率，计算得到的剪切率轮廓图见图 3A。结果显示，宽深比为 5 1的微通道沿宽度方向约 74%区域处于微通道中心处最大剪切率95%范围内，而宽深比为 10 1的微通道沿宽度方向85%区域处于最大剪切率 95%范围内，结果提示微通道宽深比越大，流动剪切率
27、越均匀。微通道内流体剪切率进一步通过 ANSYS 有限元软件进行分析，微通道横截面壁剪切率云图见图 3B。结果显示，相比宽深比为 5 1的微通道，宽深比为 10 1微通道的侧壁对整个微通道内剪切率分布影响减少，流动的粒子(血小板)受到的流体剪切力更加均匀，从而有利于流体剪切率参数的控制并简化分析。因此，后续血小板黏附聚集微流控芯片的微通道宽深比设计为 10 1。图 3宽深比分别为 51和 101的矩形微通道剪切率分布A 沿微通道宽度方向剪切率轮廓图的理论计算;B 微通道横截面壁剪切率的有限元分析结果云图985军事医学2017 年 7 月 第 41 卷 第 7 期Mil Med Sci，Vol
28、41，No 7，Jul，20172 2微流控芯片设计与加工血小板黏附聚集分析微流控芯片加工采用本课题组前期报道的感光干膜软光刻工艺。与传统软光刻工艺采用的液态光刻胶不同，感光干膜具有低成本、无需昂贵洁净空间和专业光刻设备，更易为普通生物学/医学实验室采用。更为重要的是，由于商品化的感光干膜具有固定的厚度，因此相比液态光刻胶(注:厚度通过旋涂速度大小控制)，采用感光干膜更能精确控制微通道结构的深度。采用课题组发展的工艺，加工的微通道深度最低为 35 m(单层)，最深可达到 350 m(10 层)。研究显示，当血液流过尺寸 50 m 的微通道时，血液的非牛顿流体特征将变得十分明显，Fahr-aeu
29、s-Lindquist(F-L)效应对血液流变学特征影响也将增大，使血液在微通道内黏度分布不均24。因此，感光干膜加工的微通道深度最少为 70 m(两层感光干膜)。同时，考虑到微通道宽深比对剪切率均匀性的影响，本研究设计了两种不同尺寸的微通道(宽深比均为 10 1)，不同尺寸微通道和传统平板流动腔内不同剪切率对应的血液样品流量通过泊肃叶定律进行计算(表 1)。当微通道深度为 70 m，宽度为 700 m，微通道内流体剪切率为 1000 s1时，在微通道内流动 5 min 仅需要 172 l 血液。在相同条件下，1050 m 105 m 的微通道单次流动分析则需要 579 l 血液样品，传统平板
30、流动腔需要的血液样品量 2 ml。因此，采用 700 m 70 m微通道的微流控芯片对血液样品有限的应用分析极具优势，如贫血早产儿、静脉血管发育不良患者以及小鼠血栓实验模型(血量 1 ml)。综上因素，后期血小板黏附聚集微流控芯片的微通道尺度选定为700 m 70 m。表 1宽深比为 101的微通道和传统平板流动腔的平均剪切率与流量间的关系微通道尺度(m)流量(l/min)平均剪切率(s1)700 703 41006 820034 3100051 515001050 10511 510023200115 81000173 615002500 12740100800200403 21000604
31、1500100 s1为保证血液为牛顿流体的最低剪切率;200 s1为典型人体静脉内剪切率;1000 s1为典型人体动脉内剪切率;1500 s1为典型人体动脉狭窄处剪切率感光干膜软光刻工艺加工的微通道几何尺寸采用两种不同的方式测量。首先，微通道的感光干膜阳模通过三维激光显微镜进行检测(图 1C)。结果显示微通道阳模高度为 70 6 m，与理论参数值 70m 接近;同时感光干膜表面粗糙度为(0 112 0 04)m(n=4)，提示复制出的 PDMS 微通道具有光滑的上表面。其次，加工的 PDMS 微通道显微图像通过显微镜拍摄，用 ImageJ 软件(NIH)进行尺寸测量(图 1D)。测试结果显示，
32、微通道横截面的高度为(70 3 0 05)m(n=6)，宽度为(702 8 2 5)m(n=6)，与设计的 700 m 宽度接近。上述结果进一步说明了本课题组前期发展的感光干膜软光刻工艺在加工、控制微通道结构和尺度上的可靠性和灵活性。2 3血小板黏附聚集分析为建立在生理相关剪切力环境下对血小板黏附聚集进行分析的微流控芯片技术，本实验以健康志愿者外周全血作为样品，分别在 200 s1静脉生理性相关剪切率和 1000 s1动脉生理性相关剪切率条件下让荧光标记的血液样品流过胶原蛋白修饰的微通道，同时通过相机连续记录血小板在微通道内黏附聚集的荧光影像。在 1000 s1剪切率下流动不同时间时微通道内血
33、小板黏附聚集典型的荧光图(图4A)显示，流动初期(0 25 s)，少量血小板开始黏附，随着流动时间进一步延长(25 300 s)，在初始血小板黏附位置，血小板开始聚集，且聚集面积迅速增大。该实验结果符合预期的体内正常凝血过程，即在流动初期，暴露的胶原蛋白需要从血液中募集足够的血管性假血友病因子(vWF)，从而实现血小板的初始黏附，随后血小板激活自分泌 ADP、TXA2等凝血因子，从血液中募集更多血小板，在初期黏附血小板区域的表面聚集，凝血块体积快速增大。同时，研究发现在 700 m 70 m 尺寸的微通道内，血小板聚集分布均匀，且流动 300 s 未发现明显的血小板聚集体脱落。该结果说明微流控
34、芯片血小板黏附聚集分析的相关实验参数合理，且与体内环境更加相符。血小板黏附聚集行为进一步通过图像分析进行量化，图像处理流程图见图 4B。图像分析主要包括图像分割和二值化处理，并最终计算出血小板表面覆盖率。将流动不同时间拍摄的荧光图像序列导入建立的程序方法，获得血小板黏附聚集与流动时间的关系曲线，同时实验以未修饰胶原蛋白的微通道作为对照(图 4C)。结果显示，血小板流过胶原蛋白发生黏附聚集并随流动时间延长聚集面积逐渐增大，而在未修饰胶原蛋白的微通道内，血小板未发生095军事医学2017 年 7 月 第 41 卷 第 7 期Mil Med Sci，Vol 41，No 7，Jul，2017图 4血小
35、板黏附聚集的微流控芯片分析A 流动不同时间血小板在胶原蛋白表面黏附聚集典型的荧光图像;B 基于图像分割和二值化处理分析流动 300 s 后血小板表面覆盖率;C 血小板在微通道内表面覆盖率与流动时间的关系曲线(n=6);D 不同流动剪切率对血小板黏附聚集行为影响(n=6);*P 005明显的黏附聚集行为，说明血小板未被激活，提示进行血液标记的荧光染料及玻璃 PDMS 微流控芯片均具有良好的血液相容性。通过对血小板黏附聚集动力学曲线进一步分析，发现流动条件下血小板黏附聚集曲线可分为两个阶段。第一阶段为血小板初始黏附期，随后血小板聚集面积快速增加为血小板聚集期。该结果符合体内血小板生理性行为预期，同
36、时与前期文献21 报道相符，说明本文发展的方法具有较高的可行性。为量化血小板黏附聚集行为，血小板初始黏附期由血小板初始覆盖面积率达到 2 5%所需的流动时间(t2 5)量化，血小板聚集期通过聚集速率和流动300 s 时血小板面积覆盖率(A300)量化。其中，血小板聚集速度计算公式为(A300 2 5)/(300 t2 5)。根据上法，在 200 s1静脉生理性剪切率和 1000 s1动脉生理性剪切率环境下血小板黏附聚集量化结果见图 4D。结果显示，在 1000 s1流动剪切率下，血小板黏附聚集的 t2 5值、聚集速率和 A300值分别为(22 5 8)s、(0 07 0 006)%/s 和(2
37、4 8 1 4)%，200 s1剪切率下血小板黏附聚集的 t2 5值、聚集速率和 A300值分别为(56 2 8 5)s、(0 11 0 007)%/s 和(31 6 2 3)%，两个剪切率水平下3 个参数相比差异均具有统计学意义(P 0 05)，提示流动剪切率环境对血小板黏附聚集行为具有显著影响。相比 200 s1低剪切率，1000 s1流动剪切率下 t2 5值降低，推测与 vWF 活性增强，促进血小板初始黏附有关25，而聚集速率 A300值的降低，推测与血小板自分泌凝血因子对流扩散速率加大及血小板聚集所需的结合力增大有关18。2 4血小板黏附聚集抑制实验作为上述建立技术的初步应用，本研究分
38、析了抗凝药物盐酸替罗非班对血小板黏附聚集的影响。该药是一种常见的可逆性非肽类血小板表面 GPb-a 受体拮抗剂，具有强有力的抗血小板聚集作用，延迟或抑制血栓形成，缩小血栓大小的药效，临床上广泛用于急性冠脉综合征患者26。此外，由于血小板黏附聚集的 A300值能综合反映出血小板聚集稳定性、血小板表面 GPb-a 受体与纤维蛋白原相交联的程度，因此选择 A300值用于量化盐酸替罗非班对血小板黏附聚集抑制效应。不同终浓度盐酸替罗非班处理组在1000 s1剪切率条件下流动 300 s后，其典型的血小板黏附聚集荧光图像见图5。结195军事医学2017 年 7 月 第 41 卷 第 7 期Mil Med
39、Sci，Vol 41，No 7，Jul，2017图 5不同浓度盐酸替罗非班处理后血小板黏附聚集典型的荧光图像及对应的血小板表面覆盖率分析果显示，盐酸替罗非班处理明显降低血小板表面覆盖率，且呈浓度依赖性。用 10 mol/L 盐酸替罗非班处理后血小板几乎不发生黏附聚集。同时，流动实验过程中观察发现经该药处理明显减低了血小板在胶原蛋白表面的初始黏附，形成的血小板血栓在流动剪切率环境下变得不稳定和易脱落。盐酸替罗非班抑制血小板黏附聚集的量 效关系见图 6。对照组和不同浓度盐酸替罗非班处理后血小板表面覆盖率柱状图显示，当盐酸替罗非班浓度10 nmol/L 时能显著降低血小板表面覆盖率(图 6A，P 0
40、 05)。进一步分析显示，盐酸替罗非班浓度与血小板表面覆盖率间能用 Boltzmann 函数进行良好拟合(20 99)，拟合的量效关系曲线见图 6B，据此计算出盐酸替罗非班对血小板黏附聚集的半抑制率(IC50)为 23 8 nmol/L。该结果也是首次报道在动脉生理性剪切率环境下得到盐酸替罗非班抑制血小板黏附聚集的量 效关系曲线。3讨论相比在现有静态条件下的血小板聚集分析技术，本文建立并验证了在生理流动条件下分析血小板黏附聚集的一种简易微流控芯片技术。此外，相比已发表的微流控芯片血小板黏附聚集分析方法，本文具有以下几个亮点:首先微流控芯片加工采用了感光干膜软光刻工艺，代替了传统基于液体光刻胶的
41、软光刻工艺，不但降低了加工难度和成本，更易于精确控制微通道深度;其次分析不同宽深比矩形微通道内流体动力学行为，优化并选择了最适合的微通道结构尺寸;证实了 200 s1和 1000 s1两种生理相关剪切率条件下血小板黏附聚集行为存在显著差异;最后在动脉生理剪切率条件下得到了盐酸替罗非班药物抑制血小板黏附聚集的量 效关系。为进一步完善和验证本文发展的方法，未来将在以下方面开展研究:流动剪切率环境对血小板黏附聚集行为的调控机制;从方法学上与现有静态条件下血小板聚集分析方法(如光度比浊法、血栓弹力图仪等)分析结果间的相关性;总之，本文建立的血小板黏附聚集微流控芯片技术方法简单，耗血样低，能在生理相关剪
42、切率条件下实时动态分析血小板黏附聚集行为，可用于血小板功能的临床分析、抗凝药物个性化/精准用药及小型血栓动物模型凝血分析。图 6盐酸替罗非班抑制血小板聚集的量 效关系(n=6)A 对照组和不同浓度盐酸替罗非班抑制后血小板表面覆盖率，与对照组相比，*P 005;B 拟合的量 效关系曲线295军事医学2017 年 7 月 第 41 卷 第 7 期Mil Med Sci，Vol 41，No 7，Jul，2017【参考文献】1Gurney D Platelet function testing:from routine to specialist tes-tingJ Br J Biomed Sci，2
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