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1、 ：综述金黄色葡萄球菌肠毒素检测方法新进展【摘要】金黄色葡萄球菌肠毒素（，）引起的食物中毒是全球性的食品安全问题之一。快速、准确的 检测，对于诊断及有效控制金黄色葡萄球菌引起的食物中毒具有重要意义。本文针对近年 检测的分子生物学方法、免疫学方法、质谱分析技术和生物传感器检测等方面的最新进展进行简要介绍。【关键词】金黄色葡萄球菌肠毒素；检测；食物中毒；综述【中图分类号】【文献标识码】【文章编号】（）；（）：，（，；，）【】（），（），【】；金黄色葡萄球菌（）简称金葡菌，是一种重要的食源性致病菌。金黄色葡萄球菌肠毒素引起的食物中毒是全球性的食品安全问题。在美国，由金葡菌食物中毒引起的死亡人数每年估
2、计达 人。我国国家食品安全风险评估中心 年的监测数据显示，金葡菌引起的食物中毒暴发年累计共 起，个病例，在细菌性食源性疾病暴发中排名第三位。至今发现 种肠毒素（）和类肠毒素（，）。可以引起哺乳动物呕吐的毒素被命名为肠毒素，不能引起呕吐或未测定催吐活性的毒素则命名为 类 肠 毒 素。主 要 包 括 、和 和 。包括 、和 。肠毒素是一种小而易溶于水的金葡菌分泌蛋白，具有超抗原活性，通常较稳定，可耐高温，不易失活，人体摄入几微克便可导致食物中毒。临床症状主要表现为呕吐、腹泻，同时伴有中上腹部疼痛，一般可自愈，严重的导致脱水甚至休克。欧盟食品微生物标准规定在保质期内投放市场的干酪、牛奶、乳清粉等乳制
3、品中不允许有肠毒素的检出。因此，快速准确的肠毒素检测方法，对于诊断及有效控制金黄色葡萄球菌引起的食物中毒具有重要意义。本文针对近年金黄色葡萄球菌肠毒素检测的分子生物学方法、免疫学方法和质谱分析等方法进行简要的介绍。分子生物学方法 聚合酶链式反应（，）技术 技术已经成为金葡肠毒素分子生物学的基本检测技术。目前已经建立了单重和多重 反应体系 以及用于转录水平检测的逆转录 。为了快速估算样本中的带菌水平，等 建立了新鲜干酪中金葡 基因的最可能数 （，）定量方法，最低可检测到样品中 带菌量。定量技术，酶联免 疫 吸 附 试 验（，）法也被用于肠毒素的检测。等 应用 检测 和 ，灵敏度达 ，最低检出限分
4、别为 和 。等 建立了一种敏感、特异的 介导的免疫捕获 法，可检测出牛奶样品中 的 。由于 的交叉污染等问题，法并没有被广泛应用。陈彬等 还建立了多重 结合变性高效液相色谱法（，），对五种经典肠毒素进行检中 国 病 原 生 物 学 杂 志 年 月第 卷第 期 ，【基金项目】国 家 重 点 研 发 计 划 项 目（，）。【通讯作者】闫笑梅，：；王国庆，：【作者简介】王铜（），女，吉林白城人，在读硕士研究生，主要研究方向：病原微生物学。：测，灵敏度可达到 ，不同肠毒素的检出限范围为 。实 时 荧 光 定 量 （，）荧光 技术实现了 技术从定性到定量的飞跃，特异性更强，自动化程度更高，可直接观察结果
5、，反应时间小于。目前，该方法已经被广泛用于肠毒素检测。等 利用一套通用引物建立了肠毒素 的单重 检测方法。其中 和 的检出限为 个拷贝，和 的检出限为 个拷贝，和 最低可检出 个拷贝，和 的检出限超过 拷贝。等 建立了 的单重检测方法，并与反向乳胶凝集试验方法（，）进行比较，结果提示 技术灵敏度更高，大约可检出 ，而 且 更 经 济 实 惠，成 本 大 约美 元。等 用 标记荧光探针，检测牛奶中种肠毒素，具有较好的特异性和灵敏度，最低检出限为 。环介导等温扩增技术（，）是一种 等温扩增技术，扩增结果可通过直接观察判定。等 开发了对经典肠毒素基因的 检测技术，不需要昂贵的仪器设备，特异性强，灵敏
6、度高，成本低，尤其适合现场的肠毒素检测。该方法在牛奶，苹果汁，奶酪和大米中肠毒素检出限为 ，样本浓缩后，最低可检出 。该方法由于灵敏度高，极易受到污染产生假阳性，且不能进行长链 的扩增。数字 技术（，）数字 通常由两部分组成，包括 扩增和荧光信号分析。在 扩增阶段，数字 将样品稀释至单分子水平，然后将其平均分布至数万个单元中进行反应。与 的实时荧光测定方法不同，数字 是在扩增后采集每个反应单元的荧光信号，最后根据泊松分布原理和阴阳液滴的比例，利用分析软件计算待检测目标分子的浓度或拷贝，实现真正意义上的绝对定量。数字 与 相同，分为探针法和染料法，包括微孔式、微控流芯片式和微滴式数字 技术。微滴
7、数字 （，）和微流控芯片数字 （，）是目前的主流技术。微流控芯片技术使数字 能够快速准确的将样品液分成若干个独立的单元，每个反应单元的体积更小，通量更高，可以自动取样且加样更快。但其中的集成流路（）微流控芯片由于流路复杂，且微阀微泵结构制作困难，受到加工技术和成本的限制。目前应用较为广泛，其主要原理是利用微流控技术生成 个体积为 的油包水乳化微滴颗粒，以每个油包水小颗粒作为反应器，然后将液滴转到 孔板中进行 扩增，之后在微流控芯片中采用流式方法，每个液滴顺次经过双通道（）信号荧光检测器进行荧光检测。在结果判断时，认为至少超过 个微滴生成，结果才能够有效的进行绝对定量。数字 虽然只有两通道，但
8、是 可 以 根 据 不 同 组 合 来 实 现 多 重 反 应，等 建立了检测种不同种属细菌的 体系。此方法的缺点是操作复杂且成本相对高，对操作技术要求较高，每次操作生成的微滴数无法保证一致。目前数字 广泛应用于产前诊断，二代测序，肿瘤早期研究，微小 分析，拷贝数变异和病毒检测 ，在重要食源性致病微生物检测中也有很好的应用前景。赵丽青等 用叠氮溴化丙锭（）与 技术相结合，用于食品中金黄色葡萄球菌活菌的检测，在人工污染鸡肉样品中最低可检出 的金葡菌。也被用于耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（，）的检测 ，研究表明 法不太容易对样本中可能存在的抑制剂产生影响，从而可以检测到较低数量的细菌，灵敏度和特异性都
9、很高。等 检测单个菌细胞中同时存在 和 基因，利用 技术做到直接从鼻咽拭子样品中检出 ，检出限 达 。对于金 葡 菌 肠 毒 素 的 数 字 检测方法还未见文献报道，但其定量的精准性在金葡菌食物中毒的肠毒素检测中具有良好的应用前景。免疫学方法金黄色葡萄球菌肠毒素检测早期的免疫学方法包括免疫扩散法 、反向间接凝血试验（，）和反相被动乳胶凝集（）。其中 方法被开发为商品化的试剂盒，目前还在用于各种食品中肠毒素的检测，其它早期的方法由于无法满足目前的检测需求，基本不被使用了。标记免疫学方法是目前应用较多的免疫学技术，本文主要介绍此种方法。酶联免疫吸附法（，）是最经典的免疫学方法之一。包括直接法、间接
10、法、夹心法和竞争法 。该方法具有操作简便、成本低等优势，但线性范围较窄，批间差大，容易出现交叉反应。为了避免葡萄球菌蛋白在免疫检测中的交叉干扰，等 使用 作为捕获抗体，可检测三明治中 。研究人员开发了多种方法来最大限度地放大信号，将生物素亲和素系统引入 中从而提高检测灵敏度和检出限。在奶酪和牛奶食品样本中肠毒素检测范围约为 。李红云等 使用双单抗夹心 方法检测血浆及组织中的 ，利用生物素链霉亲合素信号放大系统，在 的 浓 度 范 围 内 呈 良 好 的 线 性。等 用末端缺失的 重组蛋白免疫兔制备抗血清，用纯化的 和抗体建立了检测 的夹心 系统，对细菌培养上清进行检测，检出限达 。目前基于 的
11、商品化检测试剂盒已被广泛应用。荧光免疫技术（，）该方法用荧光标记的特异性抗体结合样品中待测抗原，并通过检测荧光信号强度来确定待测样品的含量。标记抗体的材料包括荧光染料如羟基荧光素（，）、异硫氰酸荧光素（，）、水溶性吲哚菁型荧光素（，）等 和 荧 光 纳 米 粒 子 量 子 点（，）和镧系离子螯合物掺杂纳米粒子等。用 标记的小鼠抗 抗 体 吸 附 在 孔 板 膜 上，可 检 测 。荧光纳米粒子由于其具有高的光稳定性、量子产率和窄发射光谱的宽吸收等优点而被用于提高光学分析性能。该方法反应时间大大缩短，灵敏度高，可定量测定 在 之间 。基于功能化核壳纳米颗粒标记的方法检测 ，检出限为 。多个染料和荧
12、光纳米粒子中 国 病 原 生 物 学 杂 志 年 月第 卷第 期 ，作为标记，具有同时检测多个 的潜在优势，等 建立了同时测定葡萄球菌肠毒素、和的方法，检测范围为 。化学发光免疫技术（，）根据标记物可分为化学发光免疫化学发光酶免疫和电化学发光免疫 分析。目 前 应 用 较多的 是 化 学 发 光 酶 免 疫（，）。等 对多种环境基质、生物基质和体液基质中 进行分析，检测限为 。等 检测多种基质中的 ，检测下限为 。等 以戊二醛为交联剂，将辣根过氧化物酶（）和 抗 体 同 时 固 定 在 二 氧 化 硅 纳 米 颗 粒（）载体表面，使信号放大，提高了灵敏度，可以检出 的 。化学发光法具有高灵敏度
13、、特异性和稳定性，检测线性范围宽，分析方法简便快速、通量高等特点。表面增强拉曼散射（，）拉曼光谱是一种散射光谱，被用于定性和定量分析，该技术也被尝试用于肠毒素的检测。采用多克隆抗体功能化磁性金纳米颗粒作为 的捕获探针，可特异性捕获样品中的 ，金纳米颗粒上同时包被，二硫代双（硝基苯甲酸）作为拉曼的报告因子，最低检测限为 （即每 样品体积内检出 个 分子）。基于 的免疫检测方法具有线性范围广、灵敏度高、操作简单、检测时间短、高选择性等优点，具有良好的应用前景。表面等离子体共振（，）表面等离子体共振是利用金属薄膜光学耦合产生的物理光学现象检测物质的技术。抗体被包被在传感器芯片上，当抗原与抗体结合时引
14、起折射率的变化，导致共振角发生变化，通过检测 角度变化来进行分析。利用该技术检测热狗、马铃薯沙拉、牛 奶 和蘑菇 等食 品 中 的 ，检出 限 为 。法检测牛奶中葡萄球菌肠毒素，最低检出限为 。将 与基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（，）相结合，可检出新鲜液态奶中 的 。用免疫磁珠将肠毒素进行富集，可以提高 技术检测的灵敏度，在粪便标本中最低可以检出 的肠毒素。质谱色谱分析法近年来 被广泛用于临床的细菌鉴定，该方法也适用于食品中金葡肠毒素的检测，可以从巴氏乳和细菌培养上清中直接检测 和 毒素。利用液相色谱质谱联用（）技术可以检测牛奶样品中的 和 ，检出限分别约为 和 。使用液相色谱电喷雾串联质
15、谱法（）技术，在牛奶、果汁中可以检出 和 ，成功用于各类食品中，尤其适用于低蛋白食品的肠毒素检测。等 利用超高效液相色谱串联质谱技术（）定量检测牛奶和虾中的 和 ，检出限为 。生物传感器法（）生物传感器的原理是将生物活性物质（如酶、抗原、抗体、核酸、微生物、细胞、组织）作为识别元件，与待测物质发生生物学反应，与理化换能器结合，从而将生物反应信号转换为电信号，待测物质的含量与所产生的信号具有比例关系。目前，电化学传感器、磁弹性传感器、压电晶体传感器 、悬臂式传感器 等已经应用于肠毒素检测。其中电化学传感器检出限达约 。近年新发展起来的新型核酸适配体（）是通过指数富集的配体系统进化技术（）体外筛选
16、出来的可以与靶分子结合的寡核苷酸序列（或 ）。具有较高的亲和力和特异性，类似于抗体，又优于抗体的特点。适配体分子量小，稳定性好，可重复变性和复性，成为生物传感器的理想识别元件，并被用于肠毒素的检测 。除 适配体外，肽适配体，特别是利用噬菌体展示技术衍生出来的肽适配体，正成为生物检测和生物传感器应用中的新型识别剂 。综上所述，在广泛使用的分子生物学方法中，基于 技术的方法仍然是快速准确鉴定的首选方法，其中的数字 势必成为新一代分子诊断工具。基于蛋白水平的检测方法中，质谱法以及新发展起来的生物传感器法具有很好的应用前景。未来肠毒素检测方法应是以便携的商品化装备为主，以方便进行现场检测。【参考文献】
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