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1、羊膜穿刺术和基于下一代测序 (NGS) 的无创产前 DNA 检测 (NIPT) 用于胎儿染色体疾病的产前诊断中国是出生缺陷高发国家，数据显示1染色体异常作为重要的遗传缺陷，可能会影响 1/200 到 1/150 的新生儿。了解如何进行适当的产前筛查和染色体疾病诊断对于降低出生缺陷的发生率很重要。目前，羊膜穿刺术进行染色体核型分析是产前诊断的主要方法。然而，作为一种侵入性方法，不可避免地增加了宫内感染和流产的风险，导致临床接受度低。随着新一代测序技术（NGS）的不断完善和全面发展，通过孕妇外周血NGS进行无创产前DNA检测（NIPT）正成为高危人群产前筛查的新方向。2,3由于NGS技术在产前诊断
2、领域的发展时间较短，NIPT对传统产前诊断的影响有待进一步证实。本研究旨在检测2267名有产前诊断指征的高危孕妇外周血中胎儿游离DNA，并对羊膜穿刺染色体核型金标准进行比较分析，为新方法的应用提供参考。胎儿染色体疾病产前筛查模型。材料和方法一般材料本研究共纳入 2015 年 1 月至 2019 年 5 月内蒙古医科大学附属医院就诊的孕妇 2267 例。年龄范围为 22-47 岁，平均年龄为 31.7 4.6 岁。胎龄为 12-26+6周，怀孕次数为1-5。初产女性1309例，产后女性958例。纳入标准如下：（1）自然受孕女性；（2）有产前诊断指征者（包括唐氏综合征血清学筛查中高危及临界危险者、
3、超声软指标异常者、高龄者、不良出生史者）；（三）自愿参加NIPT，阳性者经羊膜穿刺术确诊；（四）签署知情同意书者。排除标准如下：（1）胎龄40 kg/m2;（3）其中一对夫妇有明确的染色体异常，近期有异基因输血、免疫治疗、移植或干细胞治疗史；（四）有其他特殊致畸剂接触史者。本研究经内蒙古医科大学附属医院伦理委员会批准（批准文号：NO.CS2019003），所有患者均签署知情同意书。这项研究是根据赫尔辛基宣言进行的。方法NIPT方法严格执行产前筛查程序，在遗传咨询和知情同意的原则下进行NIPT。样品采集首先，使用乙二胺四乙酸采血管从怀孕女性身上抽取 5-10 mL 外周血。样品在2 h内离心分离
4、血浆（参数如下：第一次转速1600 r/min，持续10 min；第二次转速1600 r/min，持续10 min）。使用根据制造商说明操作的血浆游离 DNA 提取试剂盒（BerryGenomics，北京，中国）从母体血液中提取游离胎儿 DNA。成功提取DNA后，样品保存于-20C，待进一步检测（DNA定量分析后，浓度0.050.7 ng/L，体积35 L为合格样品） ）。基因文库的构建和测序在游离DNA中进行片段修复，在3端添加碱基“A”，并通过连接酶添加用于测序和分析的标签和剪接，构成可供测序的标准文库。标准库的浓度通过聚合酶链式反应扩增和使用标准曲线来量化。判断标准曲线的标准如下： R2
5、99%，斜率 -3.6，效率 90%。纯化通过质量控制的文库后，将样品加载到 NextSeqCN500 基因测序仪（BerryGenomics，北京，中国）上进行测序。测序中的每个读数都与人类参考基因组图谱进行比对，以获得每个染色体的原始值，并将测序结果提交分析。数据分析观察染色体Z值（根据染色体代表值和最小GC含量计算公式计算）：13号染色体三体的正常参考范围为-3.0-3.0；18 号染色体三体的正常参考范围为 -3.03.0；21 号染色体三体的正常参考范围为 -3.0-3.0。大于或等于 3.0 或小于或等于 -3.0 的结果表示阳性结果。3羊膜穿刺术诊断核型分析及随访对于外周血中胎儿
6、游离 DNA 阳性结果的孕妇，建议在细胞培养后进行羊膜穿刺术和 G 带核型分析。羊膜穿刺术是在超声引导下进行的。首先，提取 15-20 mL 羊水并放入离心管中。在以 2000 rpm 离心 7 分钟后，将细胞悬液接种在三种培养物中，按照标准程序进行孵育和液体交换。当更多的细胞生长并附着在细胞壁上并在显微镜下形成8-10个细胞克隆时，将细胞转移到离心管中以制备细胞悬液。配合 G 波段演示，根据美国病理学家协会的标准，核型分析应至少计入20个核裂变阶段，分析5个核型，核型分析的分辨率应至少为320个波段。核命名法是根据 ISCN 2009 系统进行的。羊膜穿刺的核型分析结果被认为是金标准。对染色
7、体核型异常者进行引产，对低风险者进行强化随访，直至引产完成或胎儿出生。统计分析构建了 Excel 数据库（Microsoft，Redmond，DC，USA）。数据分析采用SPSS 19.0软件（SPSS Version 19.0，SPSS）。可数资料以病例或比率表示，比较采用2检验。P 0.05 被认为具有统计学意义。结果参会人员基本情况如表1所示，NIPT+组与NIPT-组在年龄、初潮年龄、妊娠次数等方面均无显着差异，但NIPT+组BMI明显高于NIPT-组。表格1参会人员基本情况物品NIPT+ (N = 29)NIPT- (N = 2238)吨磷年龄25.58 2.1526.21 2.26
8、1.370.08体重指数（公斤/米2）25.60 3.5422.63 3.5010.160.001初潮年龄13.70 1.5613.81 1.520.600.28怀孕次数1.60 1.251.59 1.230.560.27奇偶校验0.77 0.620.73 0.630.740.23缩写：BMI，体重指数。NIPT 阳性结果本研究纳入的2267例病例中，血清学高危或临界风险1185例，占52.27%。此外，高龄635例，占28.01%。超声异常386例，占17.03%。61例有不良出生史，占2.69%。采用NIPT筛查，2267份标本中检出29份阳性标本，阳性检出率为1.28%（29/2267）
9、。其中，13三体3例，21三体12例，18三体2例，45，XO 4例，47，XXX/XXY 6例，47，XYY 2例。高危筛查因素对不同人群的NIPT阳性结果及检出率见表2。表 2产前NIPT结果（例）高风险群体nT13T21T18XO是+X+积极性血清学高风险，临界风险11851511311.01%高龄63515211.42%超声异常3861211212.07%不良出生史61000000全部的31224621.28%羊膜穿刺术和 NIPT 核型分析的比较29 名 NIPT 阳性孕妇自愿接受羊膜穿刺术，细胞培养染色体核型分析发现 23 例染色体异常。其中18三体2例，47三体2例，NIPT检测
10、XYY与细胞核型结果一致。12例21三体中，1例核型检查正常。3例13三体中，1例核型显示为47，XXY。45，XO 4例，核型结果显示正常3例，47，XXX 1例。47、XXX/XXY 6例核型结果显示正常1例。在本研究中，对羊膜穿刺术和 NIPT 均出现染色体异常的患者进行引产。详细信息在表 3。表3NIPT 结果与羊膜穿刺术核型分析的比较NIPT的类型NIPT 阳性 (n)染色体核型分析核型分析结果 (n)怀孕结果21三体1247,XN,+2111虚拟机46,XY1活产13三体347,XY,+132虚拟机47,XXY1虚拟机18三体247,XN,+182虚拟机45,XO446,XX3活产
11、47,XXX1虚拟机47,XXX/XXY647,XXY3虚拟机47,XXX2虚拟机46,XY1活产47,XYY247,XYY2虚拟机缩写：vtp，终止妊娠。NIPT产前诊断性能分析在本研究中，分析了 2267 个样本中 NIPT 对 21 三体、13 三体和 18 三体的诊断性能。结果表明，NIPT诊断21三体、13三体和18三体的敏感性和特异性分别为100%、99.96%和100%，以及99.96%、100%和100%，具有阳性预测性。值分别为 91.67%、66.67% 和 100%。结果列于表4。表 42267例NIPT结果诊断阳性结果积极案例灵敏度 （）特异性 (%)假阳性 (%)阳性
12、预测值 (%)21三体12100(11/11)99.96(2256/2257)0.0491.6713三体3100(2/2)99.96(2265/2266)0.0466.6718三体2100(2/2)100(2265/2265)0100全部的17100(15/15)99.91(2252/2254)0.0988.24讨论根据传统的细胞遗传学检测分析，基因突变中的染色体数目异常包括多倍体和非整倍体。染色体非整倍体是最常见的染色体疾病，占所有染色体疾病的 80-90%，4是导致出生缺陷的主要原因。不同类型的胎儿染色体非整倍体有不同的预后。预后差、器官异常、智力低下和生长迟缓是共同特征。35产前诊断是在
13、为高危妊娠女性提供遗传咨询的基础上，进一步应用现代生物学、生物化学、免疫遗传学、细胞遗传学、分子遗传学等技术进行母体或胚胎/胎儿检测，以实现对染色体异常的诊断。传统的产前诊断程序中，对中期妊娠胎儿最常用和最有效的产前诊断方法是羊膜穿刺术和羊水细胞核型分析。羊水细胞基因检查可以检测出整个染色体异常或大范围的染色体变异，诊断准确率高，有利于及时发现胎儿染色体异常。然而，羊膜穿刺术有严格的适应症和禁忌症。6,7这种方法可能会带来胎儿宫内感染和羊水漏出的风险，同时增加孕妇的心理压力，因此在高危孕妇中接受率不高。其他传统的筛查程序，如绒毛膜活检和脐带血穿刺，也具有侵入性和检测局限性，在一定程度上限制了临
14、床应用。因此，寻求一种合理实用的产前筛查诊断方法，实现胎儿染色体疾病的准确检测，对于降低出生缺陷的发生率具有重要意义。随着现代分子生物学的发展，高通量测序技术（又称NGS）正在深刻影响着遗传学的发展现状。目前，NGS正在应用于临床基因检测领域。以NIPT为代表的NGS，通过无创的方法，对母体血浆中游离的胎儿DNA片段进行扩增计数，用于遗传物质核苷酸的检测，实现对DNA片段的生物信息学解读。2,3,6NIPT目前被认为是检测胎儿染色体非整倍体的突破性方法。一系列临床验证证实，NIPT对21三体和18三体具有较高的敏感性和特异性。有学者认为NIPT对21三体的检出率大于98%，对18三体和13三体
15、的检出率更大。超过 90%。8,9 Greene 等人10进行的一项回顾性研究证实，NIPT 的实施大大减少了放弃进一步产前诊断的高危孕妇的数量，并显着提高了胎儿染色体非整倍体产前诊断的效率。沃拉等人11报道称，与核型分析相比，NIPT的特异性和敏感性与染色体核型分析结果具有更高的一致性，可以更好地判断胎儿染色体。Lori 等人12对妊娠中期染色体疾病高风险孕妇进行的一项研究表明，NIPT 对 21 三体、18 三体和 13 三体的敏感性分别为 99.8%、97.7% 和 97.5% .对 21 三体、18 三体和 13 三体的特异性大于 99.0%。国内研究也越来越多2,6,13,14表明基
16、于NGS的NIPT具有无创性、非整倍性诊断灵敏度高、结果重现性好等优点。它可以比羊膜穿刺术等侵入性诊断更早地判断染色体疾病。尽管存在一定程度的假阳性，但假阳性率非常低（0.1-0.5%）。基于NGS的NIPT特别适用于有侵入性产前诊断禁忌症的人群或35岁以上的孕妇。本研究结果显示29例（0.98%）NIPT检测染色体疾病阳性，阳性检出率为1.28%，其中13三体3例，21三体12例，18三体2例, 45, XO 4 例, 47, XXX/XXY 6 例, 47, XYY 2 例。上述结果与羊水染色体核型分析结果一致。将上述结果与羊水染色体核型分析结果进行比较，本研究中NIPT的敏感性和特异性分
17、别为100%、99.96%和100%，对21三体的敏感性和特异性分别为99.96%、100%和100%，分别为 13 三体和 18 三体，21 三体、13 三体和 18 三体的阳性预测值分别为 91.67%、66.67% 和 100%。在目前的研究中，NIPT对21三体的假阳性率为0.04%，其中1例NIPT结果提示21三体，核型分析确定为正常。另一例NIPT结果为13三体，核型结果为47，XXY，说明对于染色体异常，NIPT仍有一定程度的假阳性，与文献报道的结果一致。一项研究15已经表明，cffDNA 来源于胎盘滋养层，NGS 期间的测序深度可能导致测序偏差和随后的成对剪接，进而影响统计分析
18、。然而，影响 NIPT 检测假阳性结果的因素有待进一步研究。本研究中有4例染色体异常，基因检测为45，XO，而羊水细胞核型分析证实核型正常3例，47，XXX 1例。NIPT结果显示47例6例，XXX/XXY，核型分析后认为正常1例。这表明NIPT对性染色体非整倍性诊断的假阳性率略高。本研究的结果表明，NGS 在识别性染色体非整倍体异常风险方面可能不是最理想的，这可能与样本量小和 NIPT 的方法学局限性有关。一般认为，核型异常的多样性和性染色体临床表现的复杂性是造成NIPT高危性染色体假阳性或结果不确定的主要原因。此外，嵌合体、胎儿嵌合体和母体嵌合体的胎盘限制会影响胎儿性染色体分析的结果。因此
19、，部分临床专家仍对NIPT在检测性染色体异常、染色体平衡结构异常（易位、逆位）、嵌合染色体等方面的应用存在疑虑。一些专家这可能与小样本量和 NIPT 的方法学局限性有关。一般认为，核型异常的多样性和性染色体临床表现的复杂性是造成NIPT高危性染色体假阳性或结果不确定的主要原因。此外，嵌合体、胎儿嵌合体和母体嵌合体的胎盘限制会影响胎儿性染色体分析的结果。因此，部分临床专家仍对NIPT在检测性染色体异常、染色体平衡结构异常（易位、逆位）、嵌合染色体等方面的应用存在疑虑。一些专家这可能与小样本量和 NIPT 的方法学局限性有关。一般认为，核型异常的多样性和性染色体临床表现的复杂性是造成NIPT高危性
20、染色体假阳性或结果不确定的主要原因。此外，嵌合体、胎儿嵌合体和母体嵌合体的胎盘限制会影响胎儿性染色体分析的结果。因此，部分临床专家仍对NIPT在检测性染色体异常、染色体平衡结构异常（易位、逆位）、嵌合染色体等方面的应用存在疑虑。一些专家认为核型异常的多样性和性染色体临床表现的复杂性是造成NIPT高危性染色体假阳性或结果不确定的主要原因。此外，嵌合体、胎儿嵌合体和母体嵌合体的胎盘限制会影响胎儿性染色体分析的结果。因此，部分临床专家仍对NIPT在检测性染色体异常、染色体平衡结构异常（易位、逆位）、嵌合染色体等方面的应用存在疑虑。一些专家认为核型异常的多样性和性染色体临床表现的复杂性是造成NIPT高
21、危性染色体假阳性或结果不确定的主要原因。此外，嵌合体、胎儿嵌合体和母体嵌合体的胎盘限制会影响胎儿性染色体分析的结果。因此，部分临床专家仍对NIPT在检测性染色体异常、染色体平衡结构异常（易位、逆位）、嵌合染色体等方面的应用存在疑虑。一些专家而母体嵌合体会影响胎儿性染色体分析的结果。因此，部分临床专家仍对NIPT在检测性染色体异常、染色体平衡结构异常（易位、逆位）、嵌合染色体等方面的应用存在疑虑。一些专家而母体嵌合体会影响胎儿性染色体分析的结果。因此，部分临床专家仍对NIPT在检测性染色体异常、染色体平衡结构异常（易位、逆位）、嵌合染色体等方面的应用存在疑虑。一些专家16、17认为NIPT对性染
22、色体和其他染色体的特异性和准确性较低，应主要将 NIPT 用作 21 三体、18 三体和 13 三体染色体非整倍性的筛查方法。 NIPT 用于染色体疾病产前诊断的适应症需要进一步探索。然而，我们没有检测到胎儿分数和准确的测序深度，也没有检测到阴性和阳性样本的 Z 分数分布，这对于 Z 分数方法的敏感性和特异性都很重要。综上所述，本研究进一步证明，妊娠女性外周血胎儿游离DNA的NGS可用于高危妊娠女性胎儿染色体疾病的产前诊断，具有较高的敏感性和特异性。此外，它可能是一种很好的染色体非整倍体筛查方法，可以作为产前诊断的重要补充。但 NIPT 存在一定程度的假阳性，当 NIPT 结果异常时，仍需结合传统的羊水细胞核型分析，提高对胎儿染色体疾病的诊断效能。