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1、 !#$%&()*+,-./01 A consensus recommendation for the interpretation and reporting of exome sequencing in prenatal genetic diagnosis T!GDPMAA#$%&# 3 4 5 6 7 8 9:8;6?ICS 11.100 C!T/GDPMAA T/GDPMAA 0003-2020 I 广东省精准医学应用学会（GDPMAA）是广东省组织开展精准医学学术交流、国际交流、人才培养、出版刊物、科技创新、产学研相结合等活动的省级社会团体。制定广东省精准医学应用学会标准（以下
2、简称：粤精准医标准），满足企业需要，推动企业标准化工作，是广东省精准医学应用学会的工作内容之一。中国境内的团体和个人，均可提出制、修订粤精准医标准的建议并参与有关工作。粤精准医标准按广东省精准医学应用学会团体标准管理办法(试行)进行制定和管理。粤精准医标准草案经向社会公开征求意见，并得到参加审定会议的 75%以上的专家、成员的投票赞同，方可作为粤精准医标准予以发布。考虑到本标准中的某些条款可能涉及专利权，广东省精准医学应用学会不负责对任何该类专利权的鉴别。在本标准实施过程中，如发现需要修改或补充之处，请将意见和有关资料寄给广东省精准医学应用学会，以便修订时参考。!该标准为广东省精准医学应用学会
3、制定，其版权为广东省精准医学应用学会所有。除了用于国家法律或事先得到广东省精准医学应用学会文字上的许可外，不许以任何形式再复制该标准。广东省精准医学应用学会地址：广东省广州市越秀区天河路 45-21 号 邮政编码：510075 电话：020-87001157 传真：020-87001157 网址： 电子信箱：T/GDPMAA 0003-2020-1-!#前 言.3 引 言.4 产前外显子组测序遗传咨询和报告规范.5 1 范围.5 2 规范性引用文件.5 3 术语和定义.5 4 缩略语.6 5 检测前咨询、知情同意书及产前诊断申请单要求.7 5.1 检测前咨询要求.7 5.2 知情同意书.7 5
4、.3 产前外显子组测序申请单.8 6 产前 ES 样本质量评估标准.8 6.1 样本选择.8 6.2 样本合格性判断.8 6.3 羊水样本的处理.9 6.4 不合格样本处理方式.9 7 产前 ES 的实验操作标准化要求.9 8 产前 ES 的室内质控和室间质评要求.9 9 产前外显子组测序的数据分析规范.9 9.1 产前外显子组测序数据的质量控制.10 9.2 变异分类原则.10 9.2.1 总则.10 9.2.2 变异分类.10 9.2.3 变异分类依据.11 9.3 数据分析流程.18 10 变异结果报告建议.19 10.1 概述.19 10.2 对“范围内”基因变异的报告建议.19 10
5、.2.1 对“致病”和“可能致病”变异的报告建议.19 10.2.2 对“临床意义不明确”变异的报告建议.20 T/GDPMAA 0003-2020 -2-10.2.3 对“良性”或“可能良性”变异的报告建议.20 10.3 对“范围外”基因变异的报告建议.20 10.3.1 对“致病”和“可能致病”变异的报告建议.20 10.3.2 对“临床意义不明确”变异的报告建议.20 10.3.3 对“良性”或“可能良性”变异的报告建议.20 10.4 几种特殊情况的报告建议.20 10.4.1 对嵌合体的报告建议.20 10.4.2 存在外显不全和表现度差异的变异的报告建议.21 10.4.3 涉及
6、胎儿性别的变异报告建议.21 10.4.4 对涉及不符合孟德尔遗传规律的变异报告建议.21 10.5 对数据再分析和报告更新的建议.21 11 产前外显子组测序的报告撰写.21 12 报告发放后的工作建议及检测后咨询.22 12.1 随访.22 12.2 检测后咨询的要求.22 12.2.1 报告解释.22 12.2.2 再生育风险评估.22 12.2.3 心理干预.22 13 疑难病例的多学科会诊.22 附 录 A.24 附 录 B.26 附 录 C.27 附 录 D.31 附 录 E.37 参 考 文 献.38 T/GDPMAA 0003-2020 3$%本标准按GB/T 1.1-2009
7、给出的规则起草。本标准由广东省妇幼保健院提出，由广东省精准医学应用学会归口。本标准起草单位：广东省妇幼保健院、广州医科大学附属第三医院、中山大学附属第三医院、中山大学附属第一医院、深圳华大基因股份有限公司、嘉检医学、北京贝瑞和康生物技术有限公司、贝勒医学院、深圳市人民医院、深圳市妇幼保健院、深圳市龙岗区妇幼保健院、深圳南山区妇幼保健院、东莞市妇幼保健院、惠州市第一妇幼保健院、中山市博爱医院、江门市妇幼保健院、广东省人民医院、粤北人民医院、清远市人民医院、广州医科大学附属第一医院、暨南大学附属第一医院、南方医科大学珠江医院。本标准主要起草人：尹爱华、张彦、刘维强、章钧、林少宾、黄辉、张巍、任志林
8、、王游声、杨亚平；参与修改人：黎青、陈敏、郭辉、谢建生、魏凤香、张静、刘彦慧、何怡、陈剑虹、王德刚、唐佳、李萍、范舒舒、谭卫荷、何志晖、查庆兵、闫瑞玲、江凌晓、杨芳、丁红珂、刘畅、刘玲、齐一鸣、黄演林、张琪、曾玉坤、刘渊、余丽华、王兴旺、李发科。本标准首次制定，将根据国内外行业最新发展陆续完善更新。T/GDPMAA 0003-2020#4&%随着基因包（panel）测序、临床/医学外显子组测序（clinical/medical exome sequencing）、全外显子组测序（whole exome sequencing）甚至全基因组测序（whole genome sequencing）等下
9、一代测序（Next Generation Sequencing,NGS）技术在临床的广泛应用，疾病诊断、治疗和预后都得到了更丰富、更精准的提示和建议。在产前诊断领域，近年来也有逐渐增多的基于外显子组测序（exome sequencing,ES）技术的应用尝试。虽然国外针对这些技术的临床应用出台了相关指南、共识以及联合声明1-4，但目前国际上对这些技术在胎儿产前诊断应用中的很多方面，如检测方案、数据解读、结果报告等还处于摸索和循证阶段5-8。在产前诊断领域，由于胎儿表型信息严重匮乏，针对临床意义不确定（variants of uncertain significant,VUS）的基因变异及与检测
10、指征不相符的意外发现等，一般建议依照检测前咨询沟通意见形成的协议进行报告2。目前国内对ES的产前诊断应用缺乏专家共识或指南，针对具体操作过程中诸如知情告知的主要覆盖内容、数据分析的流程、结果的解读、报告的撰写及遗传咨询等方面均亟需细化。鉴于此，国内多家已经开展产前外显子组测序检测的产前诊断机构或实验室在以国内外最新指南和专家共识为参考的前提下，针对ES在产前诊断中的临床应用细节展开讨论，重点对产前外显子组测序的检测前咨询要点、数据分析流程、报告标准及内容和检测后咨询等提供技术层面建议，以期达到ES在产前诊断中规范应用的目的。T/GDPMAA 0003-2020 5$()*+,-./012345
11、6$#%&#本标准旨在规定产前遗传学诊断中外显子组测序（ES）的检测前咨询、知情同意书、数据分析流程、报告内容与要求以及检测后咨询。本标准规定了产前遗传学诊断中，外显子组测序（ES）的应用前提、知情同意、检测前中后的质量控制、数据分析流程、报告内容及要求。本标准适用于具备产前诊断资质（分子遗传）的医院或与其合作建立的大学分子诊断实验室以及独立医学检验所等机构在开展 NGS 测序技术（含各种基因包测序、医学外显子组测序、全外显子组测序以及全基因组测序）对胎儿样本进行人类基因组变异检测时进行全流程规范管理（包括但不局限于数据分析、结果判读以及报告出具过程）。后文中涉及咨询和报告等对象主体除非特别说
12、明，否则均为胎儿。#(%)*+,-#下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 29859-2013 生物信息学术语。GB/T 34798-2017 核酸数据库序列格式规范。#./012#下列术语和定义适用于本文件。3$#456#789:#基因序列中能够编码产生蛋白质氨基酸序列的部分，在人类基因组中往往呈不连续的片段分布。3#456;7#?7A7:BC:DEFG#基于大规模并行测序的原理，在基因组范围内对某一部分编码序列或者全部编码序列进行相关检测，用于分析存在于基因组中的
13、某些变异的一种测序技术。3#T/GDPMAA 0003-2020#6 HIJKL456;7PCBON#7897#?7A7:BC:DEQFG#J#RFG#基于下一代测序技术，对目前已明确的与疾病相关的基因编码以及相关非编码序列进行打包检测，用于分析上述序列中与疾病相关的 DNA 序列变异或结构变异的一种检测技术。3S#T456;7#?7A7:BC:DEWFG#基于下一代测序技术，对所有已知的人类基因编码序列进行打包检测的一种检测技术。3X#TYZ;7#?7A7:BC:DEWG#基于下一代测序技术，对整个人类基因组序列进行全覆盖检测的一种技术。3!#BVC7_CB0a#9?OCB#嵌合是指源自于不
14、同受精卵的胚胎发生融合，产生了带有两种不同遗传物质的个体。镶嵌是指在胚胎发育的某个阶段的某一部分细胞发生了变异。由于英文翻译等历史原因，“嵌合”一词的使用更为广泛。本文沿用嵌合，但其内涵均为胚胎发育过程中产生的变异。S#bc/#以下缩略语适用于本文件。ES外显子组测序 (Exome Sequencing)WES全外显子组测序 (Whole Exome Sequencing)WGS全基因组测序(Whole Genome Sequencing)NT颈项透明层（Nuchal Translucency）DNA脱氧核糖核酸（Deoxyribonucleic Acid)PCR聚合酶链式反应（Polymer
15、ase Chain Reaction）chr染色体（Chromosome）STR短串联重复序列（Short Tandem Repeat）SNP单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphism）SOP标准操作流程（Standard Operation Procedure）DECIPHER人类基因组变异和表型数据库（Database of genomic variation and Phenotype in Humans using Ensembl Resources）OMIM在线人类孟德尔遗传数据库（Online Mendelian Inheritance in Ma
16、n）DGV人类基因组结构变异数据库（Database of Genomic Variants）ACMG美国医学遗传学与基因组学学会（American College of Medical Genetics and Genomics）ISCN人类细胞遗传学术语国际命名体制（International System for Human Cytogenomic Nomenclature）HGVS人类基因组变异协会（Human Genome Variation Society）T/GDPMAA 0003-2020 7 CHPO中文人类表型标准用语联盟（Chinese Human Phenotype O
17、ntology Consortium）LDT实验室自建方法检测（Laboratory Developed Test）LOF丧失功能（Loss of Function）X#defghijklmnoepqrstuv#X3$#d15cm 或羊水指数45cm）、羊水过少（羊水最大暗区2cm 或羊水指数5cm）、双侧脑室增宽（10-15mm）、脑积水等异常情况也建议进行胎儿 ES。对于超声软指标异常（包括鼻骨缺如或发育不良、肠管回声增强、肾盂分离及单脐动脉等）等情况，ES 不作为首选推荐，可根据临床具体沟通情况以及各实验室数据，交代残余风险后酌情建议8,10-14。强烈建议胎儿与其母亲和父亲同时进行 E
18、S 的家系检测，在检测前应当就报告范围进行告知和协商，对于成年期肿瘤以及与胎儿表型不相关的父母遗传病携带状态等意外发现情况是否需要报告进行约定。咨询医生应当明确告知本实验室 ES 检测方法、检测范围、阳性率、各种可能的检测结果及后续应对策略，同时要告知目前 ES 在胎儿遗传疾病查因上的产前诊断局限性及残余风险。对于外单位已有的检测结果应当有应对和评估机制以及相关处理流程和 SOP。X3#ijklm#开展产前 ES 检测的知情告知同意书应至少涵盖以下内容：a)遗传病、基因组及基因等基本概念简介；b)检测方法、检测目的和内容；c)技术优势和局限性；d)临床适应证；e)检测方案及报告周期（建议不超过
19、 4 周，见附录 A）；f)报告范围及可能出现的检测结果；T/GDPMAA 0003-2020#8 g)告知可能获得临床意义不明确的结果，可能需要进行家系验证，可能存在遗传/表型异质性、外显率和表现度的差异等特殊情况而导致对预后及表型预测的困难，以及可能存在检测失败退费情况；h)可能检测到肿瘤易感性变异、迟发性疾病相关的基因、基因组变异，选择是否书面报告此类结果；i)在不涉及病人隐私及利益的前提下，样本和数据有可能用于非盈利目的的医学研究及论著发表；j)知情告知及拟开检查申请单的临床咨询医生、孕妇分别签字（知情同意书模板请见附录A）。X3#oe456;=rst#申请单应涵盖但不限于以下内容：a
20、)基本信息：申请单抬头、受检者姓名、性别、年龄、民族、唯一识别号（如诊疗卡号）、联系电话、申请科室、申请医生、申请日期、样本类型、临床初步诊断（如有）等；b)病史信息：现病史、生育史、既往史、家族史及既往检测结果等；c)胎儿超声或磁共振等影像学信息：尽可能详细、建议复印或拍照胎儿影像学详细检查报告随申请单一起送到实验室。胎儿超声结构异常的具体情况（按组织系统进行结构分类，建议以中文人类表型标准用语联盟 CHPO 标准术语描述表型信息），如有测量数值应当写明测量值对应孕周以及与正常范围的偏离程度。d)样本信息：注明样本类型是绒毛、羊水、脐血、父母外周血等（流产组织属于产后样本，也可以用于畸形胎儿
21、引产后查因）；e)检测内容：特定基因包、医学外显子组全外显子组或者全基因组测序；f)样本的接收情况：实验室核对申请单及样本信息是否一致，判断样本采集是否合格，核查取样医生、取样时间及联系电话（申请单模板请见附录 B）。!#oe FG wxyz|#!3$#wx#应当根据胎儿异常情况和孕周尽早决定检测方案和取材方式，如早孕期检出的胎儿结构畸形或 NT 增厚尽量取绒毛样本、中晚孕期检出的胎儿结构畸形应取羊水或脐带血样本，强烈建议胎儿和父母样本同时送检。为避免细胞培养过程可能对不同类别细胞产生偏好性选择的影响10,11，原则上建议采用未培养原始样本（血性羊水可酌情采用培养后羊水细胞）检测。!3#wx)
22、q#判断产前样本是否合格的重要指标是提取后的 DNA 纯度和浓度以及有无母源 DNA 污染，同时可参考以下经验进行判断：a)产前羊水样本：清亮，离心后细胞沉淀足量且无肉眼可见的血污染，STR 分型实验证实样本为胎源性；b)产前绒毛样本：显微镜下可见绒毛分支，STR 分型实验证实样本为胎源性；T/GDPMAA 0003-2020 9 c)产前脐血样本：STR 分型实验或脐血血红蛋白电泳证实样本为胎源性；d)如果畸形胎儿已引产，需要用流产或死胎组织样本查因，建议尽早取材，对死胎或流产时间未知的样本以提取的 DNA 是否严重降解及 DNA 质量来判断是否进行下一步检测。e)虽然胎儿及父母 ES 可以
23、分辨有无样本交叉污染，但鉴于成本和检测周期考虑，所有行ES 的产前诊断样本均建议进行 STR 等检测方法以排除母源性 DNA 污染。!3#wx#产前羊水样本若有咖啡色样或肉眼可见血色，建议实验室与医生沟通，并由医生通知受检者，告知检测失败风险，必要时可采用培养后的羊水细胞提取 DNA 进行后续检测。!3S#wx#不合格的样本须退回或拒收，包括但不局限于以下情形：a)严重腐败的流产或死胎组织样本或使用福尔马林浸泡的样本，存在 DNA 严重降解或交联；b)绒毛、脐血样本经检测存在严重的母源污染且无法去除；c)非胎源性样本，如脐血中混有大量母血，绒毛中混有大量蜕膜；d)DNA 质量不合格，如总量不够
24、或者纯度不够；e)使用肝素钠抗凝等可能导致 PCR 扩增失败的样本（包含 PCR 步骤的实验）。#oe FG uv#在开展产前 ES 临床服务前，应对本实验室检测平台、检测方案和试剂盒进行方法学性能确认，以评估检测方案的精密度和准确度等指标，并制定现行有效的 SOP，如 SOP 有修改，应当重新进行方法学性能评估。不同的 ES 检测方案、试剂盒以及实验平台，在操作流程上会存在细节差异，但针对每种方案、试剂盒和实验平台均应当建立相应的实验室 SOP，技术人员应当严格遵照现行有效的 SOP 执行实验操作。产前样本原则上不建议培养后进行 ES 检测，因为细胞培养可能引起部分细胞优势生长且可能引入新的
25、变异类型，对 ES 检测结果和数据分析造成干扰。#oe FG y0yuv#在开展产前 ES 检测临床服务前，需对数据分析过程、实验方案、试剂盒、仪器平台以及数据分析流程进行性能确认12,13。当使用无国家药品监督管理局（National Medical Products Administration，NMPA）医疗器械注册证的仪器和试剂开展检测时，应当依照 LDT14进行项目管理。要求参加每年度国家卫健委临检中心组织的室间质评，以评估实验室的数据检测、分析和解读能力。#oe456;=(%#T/GDPMAA 0003-2020#10 产前ES下机数据应当进行两条独立的生信管线分析，采用两套不同开
26、源软件、商业软件或自建算法进行含数据质控、过滤和注释等全流程双人双线独立分析，各自生成结果后再汇总报告。所采用的生信分析软件及分析流程必须经过临床应用前的性能确认，包括但不限于对已经过其他可靠方法（如Sanger测序）验证的变异位点的检出敏感性和特异性等指标的评估。评估分析生信管线的精密度、准确度等指标。3$#oe456;85%，测序平台的相关测序错误率90Gb)，覆盖情况（WES 20以上95%）；覆盖均一度（500kb以上 CNV 分析）；变异位点测序深度（30）。对于在临床使用的数据分析流程和相关数据质量关键指标，需要有足够阳性和阴性样本进行校正和验证（阳性样本50 例）。需要对每个样本
27、制定包括但不限于以上描述的数据质量关键指标来定义其敏感度（sensitivity）和特异度（specificity）。每个报告的变异位点均需要经过遗传学（父母来源）或方法学（Sanger 测序或其他方法）的验证。对于有异常的数据质量关键指标，需要有明确的预警不合格通知，对于基因组内同源序列90%的区域或基因（附录 E）发现的变异仅能作为提示，报告前需要经过其他方法验证。3#33$#按 ACMG/AMP、ClinGen 等发布的国际标准对变异进行五分类（致病、可能致病、临床意义不明确、可能良性、良性）15-17。对变异分类判断的主要依据包括 SNV 和 CNV 是否影响蛋白编码基因或重要调控元件
28、功能，受累基因或区域的剂量敏感性、文献报道、ClinVar、ClinGen、DECIPHER、OMIM、GeneReviews、UniProt 等数据库报道情况、实验室内部数据库收录情况、普通人群频率（DGV/DGV-gold/gnomAD）数据库收录情况、家系共分离情况、变异来源（新发或遗传自父母）等。33#333$#一个或多个可信来源（公共数据库或文献）已明确其为致病变异，即使该基因的变异存在外显不全和表现度差异也应判定为致病。需要特别注意，致病变异（pathogenic）并非临床表型相关性变异（disease causing），系指发病可能性超过 99%的基因变异18。333#有较强证据
29、表明其致病的可能性非常大（发病可能性 90-99%的基因变异18），但目前的证据尚不足以完全确定其致病性。333#)#T/GDPMAA 0003-2020 11 多篇文献已证实或权威数据库报道为良性变异，特别是良性特性已经非常明确或是常见的多态性变异。333S#)#有较强证据表明该变异很可能与孟德尔遗传疾病不相关，但目前还没有达到“良性”分类的充分证据。333X#HIl2#不符合以上任何一类的变异，是一个范围广泛的分类（发病可能性 10-90%的基因变异18），其中一些可能在以后通过额外的证据将被证实为致病或良性的变异。33#对于各类变异的分类依据，建议遵循 ACMG/AMP 评分指南进行逐条
30、评判。SNV 和 Indel 的分类依据参照 2015 年 ACMG/AMP 变异位点判读指南及其中文版15,17，结合近年 ClinGen 等更新的补充建议和共识16,19,20；基因内 CNV 分类依据 2019 年 ACMG/AMP 建议不涉及转录本间差异和疾病-基因相关性等方面的建议21；涉及多个基因的 CNV 及 UPD 等结构变异的分类参见相关团体标准22。变异致病性证据链和良性证据链参见表 1，各级证据的强弱程度根据已有研究及文献报道可能进行升降级，本规范暂不引入证据的升降级体系，可自行参考文献进行实际操作。变异分类标准参见表 2。T/GDPMAA 0003-2020!12 表
31、1 变异致病性判定证据链 证据链 证据链使用更新建议 基因内 CNV 证据链使用修改建议21 1.致病 PVS1：当一个疾病的致病机制为丧失功能(LOF)时，无功能变异（无义突变、移码突变、经典1 或 2 的剪接突变、起始密码子变异、单个或多个外显子缺失）【注：1）该基因的 LOF 是否是导致该疾病的明确致病机制(如 GFAP,MYH7)；2）3端末端的功能缺失变异需谨慎解读；3）需注意外显子选择性缺失是否影响到蛋白质的完整性；4）考虑一个基因存在多种转录本的情况。】1.并非所有的移码均可以使用 PVS1，鉴于该证据链对变异位点的分类具有重要影响，需慎重使用。2.建议遵照变异对蛋白功能的影响程
32、度执行标准23，遵照基因与疾病的关系（必须至少是“中等”相关以上，否则不可使用 PVS1 证据）。3.当 PVS1 用于经典剪切位点变异分类证据时，不再同时使用 PM4 或 PP3；4.用软件预测 LOF 变异的不计入本证据链，归入 PP3。5.已使用任意强度的 PVS1 时不能再同时使用 PM4。1.对于丧失功能致病基因的缺失CNV 涉及所有编码外显子，使用PVS1_stand-alone 可以单独判为“致病”；2.对于丧失功能致病基因的缺失CNV 涉及蛋白重要功能域的多个(2个以上)外显子且导致严重的蛋白功能异常，建议使用 PVS1；3.移码或涉及起始密码的缺失 CNV（无可替代起始密码）
33、建议使用PVS1；4.对于小于 2 个外显子的缺失，如果涉及整码或 3端的缺失 CNV，在确定导致蛋白严重异常时建议使用PVS1，影响不确定时建议使用 PM4；5.对于重复型 CNV，如确定为串联重复，且已经明确导致蛋白严重异常，建议使用 PVS1，影响未知时建议使用 PM4，预测可能有严重影响的视具体情况使用 PVS1 或 PM4；6.不能明确是否为串联重复的 CNV视情况使用 PVS1 或 PM4。7.PS1 的使用可以扩展到有类似变异PS1：与先前已确定为致病的变异有相同的氨基酸改变。例如：同一密码子，GC 或 GT改变均可导致缬氨酸亮氨酸的改变。注意剪切影响的改变 PS2：患者的新发变
34、异，且无家族史(经双亲验证)。注：仅仅确认父母还不够，还需注意捐卵、代孕、胚胎移植的差错等情况 PS3：体内、体外功能实验已明确会导致基因功能受损的变异。【注：功能实验需要验证是有效的，且具有重复性与稳定性。】1.位于相同密码子的“先前已知致病变异”需根据本标准评级，经过评级确定其致病，且对其评级时不使用 PS1 和PM5 证据亦达到致病级别；2.PS2 与 PM6 互相排斥，只能取其一，该项与表型相关，表型越特异、越吻合，证据强度越高；3.新发变异的特殊情况：对新发的 X 连锁变异的未患病母亲，除了其儿子携带此变异且发病外，其家族内其他男性亲T/GDPMAA 0003-2020 13 证据链
35、 证据链使用更新建议 基因内 CNV 证据链使用修改建议21 PS4：变异出现在患病群体中的频率显著高于对照群体。【注：1）可选择使用相对风险值或者 OR 值来评估，建议位点 OR 大于 5.0 且置信区间不包括 1.0 的可列入此项；2）极罕见的变异在病例对照研究可能无统计学意义，原先在多个具有相同表型的患者中观察到该变异且在对照中未观察到可作为中等水平证据。】属不携带此变异且不患病，此时可用该证据；常染色体隐性遗传基因中一个新发变异，如果该基因中没有找到其他已知的致病或可能致病的变异时，新发变异证据强度应下调；明显的生殖腺嵌合（如连续生育多个携带相同变异的患儿，父母检测变异为阴性），可使用
36、此证据，但需确定变异的父系或母系来源；3.mRNA 分析证明变异影响剪接时使用PS3，不能同时使用 PP3，其他情况可同时使用 PS3 和 PP3。是否适合使用 PS3建议依照 ClinGen 规范24。4.PS4 极少用到病例对照数据，一般用先证者例数来计算20对于常染色体隐性遗传病的变异，该条证据链改用 PM3。，该条证据链改用 PM3。的 CNV，涉及最后一个外显子的缺失，如果有已知类似截短的致病变异时可以用；已有小的致病整码缺失，CNV 预测为整码缺失时可用。8.PM2/BA1/BS1 的使用，可以参照DGV、gnomAD31和内部数据库。需要明确的是数据库的频率需要确认，而且各类疾病
37、的阈值并不一致。9.当存在 DNA 转录本或蛋白水平上具有类似效应的致病变异时（如一个经典剪切预测相同外显子跳跃）使用PM5。PM1：位于热点突变区域，和/或位于已知无良性变异的关键功能域（如酶的活性位点）。PM2：ESP 数据库、千人基因组数据库、ExAC数据库中正常对照人群中未发现的变异（或隐性遗传病中极低频位点）。【注：高通量测序得到的插入/缺失人群数据质量较差】PM3：在隐性遗传病中，在反式位置上检测到致病变异。【注：这种情况必须通过患者父母或后代验证】PM4：非重复区框内插入/缺失或终止密码子1.PM1 仅用于错义突变及读码框内的Indel 变异，对于截断变异和同义变异不可使用。建议
38、引入本地统计数据，根据数据库给出“热点”的频率；得到公认的热点区域建议使用，如 KCNQ4 基因第 271-292 氨基酸16。2.人群基因型频率应当有特定阈值，不同类型遗传病不尽相同，如常染色体显性和隐性耳聋和的阈值分别设置为0.002%和 0.07%16，部分已经明确的高T/GDPMAA 0003-2020!14 证据链 证据链使用更新建议 基因内 CNV 证据链使用修改建议21 丧失导致的蛋白质长度变化。PM5：新的错义突变导致氨基酸变化，此变异之前未曾报道，但是在同一位点，导致另外一种氨基酸的变异已经确认是致病的，如：现在观察到的是 Arg156Cys，而 Arg156His是已知致病
39、的，注意剪切影响的改变。PM6：未经父母样本验证的新发变异。频致病位点应当列为实验室白名单；3.PM4 不适用于移码变异、无义变异和剪切位点变异，已使用 PVS1 时不能再同时使用 PM4；涉及翻译起始位点的应当用 PVS1 评估。PP1：突变与疾病在家系中共分离（在家系多个患者中检测到此变异）。【注：如有更多的证据，可作为更强的证据】PP2：对某个基因来说，如果这个基因的错义变异是造成某种疾病的原因，并且这个基因中良性变异所占的比例很小，在这样的基因中所发现的新的错义变异 PP3：多种统计方法预测出该变异会对基因或基因产物造成有害的影响，包括保守性预测、进化预测、剪接位点影响等。【注：由于做
40、预测时许多生物信息学算法使用相同或非常相似的输入，每个算法不应该算作一个独立的标准。PP3 在一个任何变异的评估中只能使用一次。】PP4：变异携带者的表型或家族史高度符合某种单基因遗传疾病 PP5：有可靠信誉来源的报告认为该变异为致病的，但证据尚不足以支持进行实验室独立1.符合 PM2 条件下使用 PP1，要求至少在一个家系中看到有共分离现象，不同的基因或疾病对于共分离的个体或家系要求不同。具体使用请请参见 ClinGen给出的部分基因对于该条证据链的使用示例25。2.PP2 可查询 gnomAD 数据库中的基因错义变异 Z-score（gene missense Z-score），当 Z-s
41、core3.09 时可认为适用 PP2 证据26。3.PP3 用于临床产前有需要格外小心，如确需用到建议使用综合多种算法的软件，目前建议参考对错义变异 REVEL 的评分，当评分0.75 时可使用 PP3 证据（Hearing loss 的 REVEL 值0.7）27。4.表型一般不用于判断位点致病性，除非是相关疾病表型很特异，且遗传方式与变异吻合，且该基因很少见良性变异，T/GDPMAA 0003-2020 15 证据链 证据链使用更新建议 基因内 CNV 证据链使用修改建议21 评估。可以用 PP4。5.PP5 已经弃用。2.良性 BA1：ESP 数据库、千人基因组数据库、ExAC数据库中
42、等位基因频率5%的变异。独立证据。需要扣除已经明确的高频致病位点（白名单）,至少观察 2000 个等位基因位点。对于少数变异虽然等位基因频率大于 5%仍可能为致病变异，需特别注意（涉及例外基因至少有ACAD9,GJB2,HFE,MEFV,PIBF1,ACAD5,BTD）28 BS1：等位基因频率大于疾病发病率。BS2：对于早期完全外显的疾病，在健康成年人中发现该变异(隐性遗传病发现纯合、显性遗传病发现杂合，或者 X 连锁半合子)。BS3：在体内外实验中确认对蛋白质功能和剪接没有影响的变异。BS4：在一个家系成员中缺乏共分离。【注：这部分需要考虑复杂疾病和外显率下降、性别依赖性外显、拟表型等问题
43、】1.ClinGen 变异解读工作组对不同疾病或基因的 BS1 应用频率有建议，如RASopathy，等位基因频率0.025%；CDH1，PTEN 等位基因频率0.1%；2.注意 BS2 的应用条件，对不完全外显疾病不能应用此证据；3.对于剪切位点，BS3 需要注意与软件结果的 PP3 冲突；4.BS1/BS2/BA1 都涉及人群频率数据，不同疾病应当有不同的阈值，部分疾病的参考阈值建议参照已有研究数据设定29-30 BP1：已知一个疾病的致病原因是由于某基因的截短变异，在此基因中所发现的错义变异 BP2：在显性遗传病中又发现了另一条染色体上同一基因的一个已知致病变异（反式位置)，或者是任意遗
44、传模式遗传病中又发现了1.当某基因的致病变异全部或绝大部分（90%）为截短变异时，该基因上发现的错义变异可用 BP1。2.应用 BP3 时可通过 UCSC 网站RepeatMasker 工具栏查询重复区域位T/GDPMAA 0003-2020!16 证据链 证据链使用更新建议 基因内 CNV 证据链使用修改建议21 同一条染色体上同一基因的一个已知致病变异（顺式位置）BP3：功能未知重复区域内的缺失/插入，同时没有导致基因编码框改变 BP4：多种统计方法预测出该变异会对基因或基因产物无影响，包括保守性预测、进化预测、剪接位点影响等。【注：由于做预测时许多生物信息算法使用相同或非常相似的输入，每
45、个算法不应该算作一个独立的标准。BP4 在任何一个变异的评估中只能使用一次。】BP5：在已经有另一分子致病原因的病例中发现的变异 BP6：有可靠信誉来源的报告认为该变异为良性的，但证据尚不足以支持进行实验室独立评估。BP7：同义变异且预测不影响剪接。置。3.BP5 需要排除以下情况：常染色体隐性遗传病携带者、导致表型更严重的第二个变异、导致合并第二种遗传病、双基因遗传病和修饰基因。4.BP6 已经弃用。5.BP7 的使用需要慎重排除影响剪切。T/GDPMAA 0003-2020 17 表 2 变异分类标准17 变异分类 证据条件 致病(i)1 个非常强(PVS1)和 (a)1 个强(PS1PS
46、4)或 (b)2 个中等(PM1PM6)或 (c)1 个中等(PM1PM6)和 1 个支持(PP1PP5)或 (d)2 个支持(PP1PP5)(ii)2 个强(PS1PS4)或(iii)1 个强(PS1)和 (a)3 个中等(PM1PM6)或 (b)2 个中等(PM1PM6)和2 个支持(PP1PP5)或 (c)1 个中等(PM1PM6)和4 个支持(PP1PP5)可能致病(i)1 个非常强(PVS1)和 1 个中等(PM1PM6)或(ii)1 个强(PS1PS4)和 12 个中等(PM1PM6)或(iii)1 个强(PS1PS4)和2 个支持(PP1PP5)或(iv)3 个中等(PM1PM6
47、)或(v)2 个中等(PM1PM6)和2 个支持(PP1PP5)或(vi)1 个中等(PM1PM6)和4 个支持(PP1PP5)良性(i)1 个独立(BA1)或(ii)2 个强(BS1BS4)可能良性(i)1 个强(BS1BS4)和 1 个支持(BP1BP7)或(ii)2 个支持(BP1BP7)临床意义不明确(i)不满足上述标准或(ii)良性和致病标准相互矛盾 T/GDPMAA 0003-2020!18#$!%&()*!ES 下机数据分析前应当检查完善运行环境和必备数据库，以 illumina 测序平台为例，应当在数据分析前具备完整的运行环境，如 linux 操作系统，数据转换、拆分软件，参考
48、基因组、基因组注释数据库、变异数据库等，各个软件和数据库应当备注版本号和日期。ES 数据分析 SNV 和 Indel 有较强优势，对于 CNV 的检测和分析能力会根据不同的检测方案有较大差异，小至数个基因的 panel 到全外显子组均是针对特定基因组区域的不连续检测，因此在CNV 检测时会面临信号不连续和断点不准确的问题，WGS 可以较为全面的检测 CNV。从下机数据到最后的变异列表的分析流程简图如下。T/GDPMAA 0003-2020 19 +,!-./01234!+,#+56!鉴于胎儿表型信息不足、胎儿的快速发育变化以及目前医学对于疾病的认知水平所限，产前ES 的报告范围（含基因范围和变
49、异范围）应该在检测前做好设定。原则上应当以保护胎儿为前提，将报告范围限定于表型基因型关系证据充分的基因范围，如 ClinGen 评级 Strong 和 Definitive的基因（查询网址：https:/search.clinicalgenome.org/kb/gene-validity），其余基因上的发现应该在检测前知情同意书限定的范围内进行报告，且仅在结果附表中作为意外发现报告（如需报告）。如发现表型部分相似但表型-基因型关系证据尚不够充分的基因、明确的迟发性疾病致病基因型或者其他有明确临床意义的变异或可能产生其他后果的，应在检测前明确商定是否报告。本规范依据 ClinGen 评级 Str
50、ong 和 Definitive 的基因清单（2020 年 8 月 3 日检索）为基础，结合国情，增加部分重要基因形成第一版产前 ES 报告范围（附录 D），在此范围内的基因变异如需报告则列入主要结果；此范围之外的基因变异如需报告则统一按照意外发现列入次要结果表。结果描述中需写明基因名（规范名称，避免使用旧称）、转录本号、变异位置（须规范）和类型（编码区变异需注明氨基酸改变）。所有对基因变异的描述均应当依照人类基因组变异协会（HGVS）规范（HGVS Recommendations for the Description of Sequence Variants:2016 Update）进行；