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1、实验九实验九 动物细胞培养动物细胞培养 一、实验目的掌握无菌操作；掌握原代和传代细胞培养；了解培养成纤维细胞的形态。原原代代培培养养：培养直接来自动物机体的细胞群，将细胞从一个培养瓶转移到另外一个培养瓶称为传代或传代培养。细细胞胞株株：从原代培养细胞群中筛选出的具有特定性质或标志的细胞群。细细胞胞系系：从肿瘤组织培养建立的细胞群或培养过程中发生突变或转化的细胞，可无限繁殖。二、实验原理三、实验器材与试剂1.器具显微镜、电热恒温水浴锅、天平、CO2培养箱、蒸汽灭菌器、超净工作台、解剖刀、眼科剪、眼科镊、培养皿 、锥形瓶、容量瓶、纱布、培养瓶、移液枪。2.材料9-12 日龄发育良好的鸭胚。3.主要
2、试剂双蒸水、Hanks液、0.25%胰蛋白酶、EDTA、NaHCO3、台盼蓝、洋红。营养液：DMEM培养基（含8%小牛血清、1万单位/ml青、链霉素）。维持液：DMEM培养基（含5%小牛血清、1万单位/ml青、链霉素）。四、原代培养1.酒精棉球消毒鸭蛋，剥出鸭胚，去头、翅、爪和内脏，加Hanks 液，剪碎为0.5-1mm3 的小块，Hanks 液洗涤2-3 次。2.组织块移入培养瓶，间距0.5cm摆放后倒置培养瓶，加少量营养液，保持湿润，37 培养，2hr后翻转培养瓶，添营养液继续培养。3.定期观察细胞贴壁生长状况，如颜色变黄，说明细胞生长，3-5天后更换培养液。4.倒置显微镜下观察拍照。5.单层细胞用Hanks 液洗涤后，加入维持液，用于原代细胞维持。五、传代培养当培养细胞接近汇合成片时，倾去培养液。加入0.25%（含0.02%EDTA）消化2-3分钟，倾去大部分消化液，留少量消化液浸润细胞。发现细胞层出现裂痕或空洞后，加入Hanks 液洗去残留消化液，终止消化。加适量营养液吹打分散，补加营养液后，1：2分装培养。汇合后挑取少许细胞，染色，观察拍照。原代培养的绍鸭成纤维细胞，相差显微镜照片正常细胞凋亡细胞分裂中期细胞传代培养的绍鸭成纤维细胞形态（DAPI染色）六、作业1.细胞培养过程中应该注意哪些事项？2.描绘培养成纤维细胞的形态（或提供照片）。