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1、动物细胞培养实验动物细胞培养实验理论讲授理论讲授(II)指导教师：费晓方指导教师：费晓方20142014年年6 6月月传代细胞培养实验传代细胞培养实验-贴壁细胞贴壁细胞HeLa细胞传代培养细胞传代培养实验目的和要求：实验目的和要求：掌握无菌操作技术。掌握无菌操作技术。掌握传代细胞的培养的一般方法与步骤。掌握传代细胞的培养的一般方法与步骤。掌握贴壁细胞传代过程中的消化分散技术。掌握贴壁细胞传代过程中的消化分散技术。熟练细胞计数方法。熟练细胞计数方法。了解培养液配制方法。了解培养液配制方法。熟练倒置显微镜的使用。熟练倒置显微镜的使用。本次试验应用本次试验应用HeLa细胞或细胞或A375-S2细胞进
2、行细胞进行传代培养。传代培养。HeLa 细胞：细胞：人子宫颈癌细胞株人子宫颈癌细胞株A375-S2细胞：细胞：人黑色素瘤细胞株人黑色素瘤细胞株实验材料：实验材料：每组的超净台中备有以下物品：每组的超净台中备有以下物品：1.材料材料 50ml RPMI1640培养液培养液1瓶；瓶；5ml小牛血清（小牛血清（FCS)1瓶；瓶；2ml胰蛋白酶胰蛋白酶 1瓶；瓶；1ml谷氨酰胺谷氨酰胺 1瓶；瓶；1ml Hepes 1瓶；瓶；PBS(-)1 瓶瓶实验材料：实验材料：每组的超净台中备有以下物品：每组的超净台中备有以下物品：2.器材器材灭菌灭菌1ml移液管移液管 1支；支；装有试管的灭菌小饭盒装有试管的灭
3、菌小饭盒 1个；个；试管架试管架1个；个；1ml，200l移液器各移液器各1支；枪头盒支；枪头盒2个；个；细胞计数板细胞计数板1块；块；镊子镊子1把，小烧杯把，小烧杯1个；个；酒精灯酒精灯1台；台；培养好细胞的细胞培养瓶培养好细胞的细胞培养瓶1个个实验操作步骤：实验操作步骤：1.1.超净台灭菌，打开风机，点燃酒精灯，消毒双手准超净台灭菌，打开风机，点燃酒精灯，消毒双手准备操作。备操作。2.2.从培养箱中取出细胞，在显微镜下观察细胞形态。从培养箱中取出细胞，在显微镜下观察细胞形态。3.3.配置应用培养液（含有配置应用培养液（含有10%10%小牛血清，小牛血清，1%1%谷氨酰胺，谷氨酰胺，PH7.
4、2-7.4PH7.2-7.4的的RPMI1640RPMI1640培养液）待用。培养液）待用。4.4.倒掉原有的细胞培养液，加入倒掉原有的细胞培养液，加入5mlPBS(-)5mlPBS(-)洗涤洗涤2 2次。次。（注意：每次操作要用酒精灯对培养瓶口进行灼烧，（注意：每次操作要用酒精灯对培养瓶口进行灼烧，两个容器瓶口不能接触）两个容器瓶口不能接触）5.5.加入胰蛋白酶加入胰蛋白酶100-200100-200ll，迅速前后旋转细胞培养，迅速前后旋转细胞培养瓶瓶4-54-5次，以便胰蛋白酶包被所有细胞，于次，以便胰蛋白酶包被所有细胞，于37C 37C 培养箱中孵育培养箱中孵育5 5分钟，消化细胞。分钟
5、，消化细胞。实验操作步骤：实验操作步骤：6.6.在显微镜下观察细胞变化，待细胞渐渐变为球在显微镜下观察细胞变化，待细胞渐渐变为球形，尚未从培养瓶壁上脱落下来时，用移液管吹形，尚未从培养瓶壁上脱落下来时，用移液管吹打，使细胞从培养瓶壁上脱落下来（或用手掌左打，使细胞从培养瓶壁上脱落下来（或用手掌左右来回轻敲培养瓶的侧壁，使细胞从瓶底面脱落右来回轻敲培养瓶的侧壁，使细胞从瓶底面脱落下来），再加入细胞培养液下来），再加入细胞培养液2-5ml2-5ml。7.7.如果细胞不能吹打下来，再放回培养中孵育几如果细胞不能吹打下来，再放回培养中孵育几分钟。分钟。8.8.倒入倒入50ml50ml离心筒中，在向细胞
6、培养瓶中加入离心筒中，在向细胞培养瓶中加入10ml10ml培养液洗涤，在一并倒入离心筒中，培养液洗涤，在一并倒入离心筒中，1000-1000-25002500转离心，转离心，1010分钟。分钟。9.9.取出离心管，倒掉上清液，在桌面上轻敲离心取出离心管，倒掉上清液，在桌面上轻敲离心筒，使沉降在离心筒底的细胞分散均匀。筒，使沉降在离心筒底的细胞分散均匀。实验操作步骤：实验操作步骤：10.10.倒入倒入5ml5ml细胞培养液，混匀。细胞计数。细胞培养液，混匀。细胞计数。11.11.取取1 1 10105 5个细胞放入细胞培养瓶内，加入个细胞放入细胞培养瓶内，加入5-8ml5-8ml培养液。培养液。
7、12.12.显微镜下观察。显微镜下观察。13.13.将传代细胞放入培养箱中培养。将传代细胞放入培养箱中培养。14.14.两天后显微镜下观察细胞生长情况。两天后显微镜下观察细胞生长情况。原代培养实验原代培养实验理论理论讲授讲授-小鼠胚胎成纤维细胞原代培养小鼠胚胎成纤维细胞原代培养 实验原理：实验原理：原代细胞培养原代细胞培养是将机体内的某组织取出，分散成单细胞，在是将机体内的某组织取出，分散成单细胞，在人工条件下培养使其生存并不断生长、繁殖的人工条件下培养使其生存并不断生长、繁殖的方法。借助这种方法可以观察细胞的分裂繁殖、方法。借助这种方法可以观察细胞的分裂繁殖、细胞的接触抑制、以及细胞的衰老，
8、死亡等生细胞的接触抑制、以及细胞的衰老，死亡等生命现象。命现象。成纤维细胞（成纤维细胞（fibroblastfibroblast）是疏松结是疏松结缔组织的主要细胞成分，由胚胎时期缔组织的主要细胞成分，由胚胎时期的间充质细胞的间充质细胞(mesenchymal cell)(mesenchymal cell)分分化而来。成纤维细胞较大，轮廓清楚，化而来。成纤维细胞较大，轮廓清楚，多为突起的纺锤形或星形的扁平状结多为突起的纺锤形或星形的扁平状结构，其细胞核呈规则的卵圆形，核仁构，其细胞核呈规则的卵圆形，核仁大而明显。大而明显。根据不同功能活动状态，可将细根据不同功能活动状态，可将细胞划分成成纤维细胞
9、和纤维细胞，成胞划分成成纤维细胞和纤维细胞，成纤维细胞功能活动旺盛，细胞质弱嗜纤维细胞功能活动旺盛，细胞质弱嗜碱性，具明显的蛋白质合成和分泌活碱性，具明显的蛋白质合成和分泌活动，在一定条件下，它可以实现跟纤动，在一定条件下，它可以实现跟纤维细胞的互相转化。成纤维细胞对不维细胞的互相转化。成纤维细胞对不同程度的细胞变性、坏死和组织缺损同程度的细胞变性、坏死和组织缺损以及骨创伤的修复有着十分重要的作以及骨创伤的修复有着十分重要的作用。用。成纤维细胞成纤维细胞：是从成年小鼠身上提取：是从成年小鼠身上提取 成纤维细胞。成纤维细胞。胚胎成纤维细胞胚胎成纤维细胞：是从小鼠胚胎中提是从小鼠胚胎中提 取的成纤
10、维细胞。取的成纤维细胞。胚胎成纤维细胞的活性和繁殖能力胚胎成纤维细胞的活性和繁殖能力 比成比成纤维细胞更好。纤维细胞更好。小鼠胚胎成纤维细胞小鼠胚胎成纤维细胞掌握掌握无菌操作技术。无菌操作技术。掌握掌握组织细胞的消化与分散。组织细胞的消化与分散。熟悉熟悉原代细胞培养的一般方法与步骤。原代细胞培养的一般方法与步骤。熟悉熟悉小鼠解剖操作技术。小鼠解剖操作技术。实验目的和要求：实验目的和要求：动物的选择：动物的选择：选择大约一半足孕时间的胚胎，选择大约一半足孕时间的胚胎，10101313天龄胚胎含有最大数量的未分化的间质细胞，天龄胚胎含有最大数量的未分化的间质细胞，胚胎成纤维细胞可从这些细胞衍生获得
11、。胚胎成纤维细胞可从这些细胞衍生获得。每组小鼠胚胎每组小鼠胚胎2-52-5个个实验材料：实验材料：每组的超净台中有以下物品：每组的超净台中有以下物品：1.50ml 1.50ml 配制好的配制好的RPMI1640RPMI1640（或（或DMEMDMEM）培养液）培养液1 1瓶；瓶；8ml8ml小牛血清（小牛血清（FCS)1FCS)1瓶；瓶；100ml 0.25%100ml 0.25%胰蛋胰蛋白酶白酶 1 1瓶；瓶；PBS(-)(PBS(-)(生理型磷酸盐缓冲液生理型磷酸盐缓冲液)1)1 瓶瓶2.100ml2.100ml灭菌烧杯灭菌烧杯2 2个；个；3 3、50ml50ml离心筒离心筒2 2个个4
12、 4、灭菌培养皿、灭菌培养皿1 1个，细胞培养瓶个，细胞培养瓶1 1个个4 4、1ml 1ml，200l200l移液器各移液器各1 1支；枪头盒支；枪头盒2 2个；无个；无菌玻璃搅拌棒菌玻璃搅拌棒1 1个个5 5、细胞计数板、细胞计数板1 1块；块；6 6、灭好菌的镊子、灭好菌的镊子1 1把，剪刀把，剪刀1 1把；把；7 7、酒精灯、酒精灯1 1台；台；试验操作步骤：试验操作步骤：1)1)胚胎的分离。适用哺乳动物胚胎的分离。适用哺乳动物(仓鼠、小鼠和大鼠仓鼠、小鼠和大鼠)a a采用认可的方案处死啮齿动物。采用认可的方案处死啮齿动物。b b立即在无菌超净台内用立即在无菌超净台内用7070乙醇擦洗
13、整个动物。乙醇擦洗整个动物。c c用无菌的镊子和剪子在前腿下作一腹部水平切口，用用无菌的镊子和剪子在前腿下作一腹部水平切口，用无菌镊子将皮肤扯向后腿。无菌镊子将皮肤扯向后腿。d d用另一无菌的剪刀和镊子切开腹部，取出含有胚胎的用另一无菌的剪刀和镊子切开腹部，取出含有胚胎的子宫，置于无菌的培养皿上。子宫，置于无菌的培养皿上。e e剔除胚胎周围的包膜，将胚胎放于无菌的含有无菌剔除胚胎周围的包膜，将胚胎放于无菌的含有无菌PBSPBS(-)(-)的的100ml100ml烧杯中。烧杯中。f f漂洗胚胎，去掉漂洗胚胎，去掉PBS(-)PBS(-)。继续用。继续用PBS(-)PBS(-)漂洗胚胎直至漂洗胚胎
14、直至清洗液清亮为止。清洗液清亮为止。2)2)将将2 25 5个胚胎转移至一个小的无菌培养皿中，用新的个胚胎转移至一个小的无菌培养皿中，用新的无菌剪刀小心地绞碎胚胎，无菌剪刀小心地绞碎胚胎，用用PBSPBS漂洗。漂洗。3)3)在无菌状态下，将绞碎的胚胎转移于一在无菌状态下，将绞碎的胚胎转移于一50ml 50ml 的无菌离的无菌离心筒中心筒中,加入加入40ml 0.2540ml 0.25的无菌胰蛋白酶的无菌胰蛋白酶,用搅拌棒轻用搅拌棒轻轻搅动轻搅动 。4)4)在温暖的环境中或置于在温暖的环境中或置于37 37 C C培养箱中轻轻摇动培养箱中轻轻摇动1515分分钟。钟。5)5)让存留的组织块在重力作
15、用下慢慢沉降，将含有悬浮让存留的组织块在重力作用下慢慢沉降，将含有悬浮细胞的液体转移至一无菌细胞的液体转移至一无菌50ml50ml的离心管中，该管内按照的离心管中，该管内按照每每10ml10ml上清加入上清加入l mll ml小牛血清的比例加入牛血清以灭活小牛血清的比例加入牛血清以灭活,胰蛋白酶。胰蛋白酶。6)6)加人新鲜胰蛋白酶溶液加人新鲜胰蛋白酶溶液(见前述步骤见前述步骤)于含有残留未消于含有残留未消化组织块的原来的化组织块的原来的50ml50ml离心筒中，重复步骤离心筒中，重复步骤4 4和和5 5。7)7)离心混合的细胞悬液，离心混合的细胞悬液，1200r1200rrainrain，5
16、5分钟，弃上清。分钟，弃上清。试验操作步骤：试验操作步骤：8)8)用新鲜的无菌用新鲜的无菌PBSPBS重悬沉淀的细胞，按步骤重悬沉淀的细胞，按步骤7 7再次离心。再次离心。9)9)用用PBSPBS反复洗涤细胞直至上清清亮为止。反复洗涤细胞直至上清清亮为止。10)10)用含有用含有1010牛血清和抗生素牛血清和抗生素(如青霉素、链霉素如青霉素、链霉素)的的DMEM(GIBCODMEM(GIBCOBRL)lOmlBRL)lOml再悬沉淀，并使终体积为再悬沉淀，并使终体积为20ml20ml。11)11)让残留的大块未破碎的组织或特殊颗粒物质沉降。可采让残留的大块未破碎的组织或特殊颗粒物质沉降。可采用
17、数层无菌纱布过滤细胞悬液以去除任何残留的细胞块。用数层无菌纱布过滤细胞悬液以去除任何残留的细胞块。12)12)为确定现有细胞浓度，加入为确定现有细胞浓度，加入0.2ml0.2ml细胞悬液于细胞悬液于1.8ml 11.8ml 1醋酸溶液中以裂解红细胞，用血细胞计数器进行细胞计数。醋酸溶液中以裂解红细胞，用血细胞计数器进行细胞计数。13)13)按每细胞瓶按每细胞瓶I x 10I x 106 6细胞的数量接种于细胞的数量接种于10ml10ml组织培养液中，组织培养液中，在饱和湿度的在饱和湿度的37C C037C C02 2培养箱中孵育直至细胞铺满。培养箱中孵育直至细胞铺满。14)14)隔天进行细胞观察。隔天进行细胞观察。试验操作步骤：试验操作步骤：实验报告要求 1 1、详细记录实验过程，不要照着、详细记录实验过程，不要照着PPTPPT抄写，具体抄写，具体做哪些步骤就写哪些步骤。做哪些步骤就写哪些步骤。2 2、仔细观察，将自己培养的细胞在显微镜下观察，、仔细观察，将自己培养的细胞在显微镜下观察，观察到的细胞状态如实的画在实验报告上，不要观察到的细胞状态如实的画在实验报告上，不要照片。照片。3 3、对实验结果进行细致的讨论，此部分是实验报、对实验结果进行细致的讨论，此部分是实验报告的重要部分，分成功的经验和需要注意改正的告的重要部分，分成功的经验和需要注意改正的方面两部分写。方面两部分写。