浙大考研生物化学课件基因工程.pdf

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1、实验要求 I 上课时间与纪律：8:40-16:40 实验室内禁止饮食、勿高声谈话、随意走动 课前预习、课中认真操作、课后的实验报告 妥善保管好每组的实验器具。实验操作要求人人动手。值日制度每一组实验器具 微量移液器（1ml、200微升、20微升）枪 盒（三类）装有小离心管的饭盒、镣子 离心管架 冰盒 浮漂 旋涡振荡器使用对应的吸头（枪头）、确认样品的加入。公用仪器 离心机 旋涡振荡器 恒温水浴 培养箱 冰箱 电 泳装置低温高速离心机微波炉紫外透射仪超净台 基 因 工 程 实 验 课 程 建 设1.编写一本实用性较强的实验讲义。2.建立一个切实可行的基因克隆的实验体系。3.精心制作了 PPT实验

2、教学多媒体。1、讲义内容 基因文库的构建 靶基因的获得 载体质粒的制备 扩增质粒的构建 表达质粒的构建与诱导表达 工程菌的培养与目标产物分离2、实验体系细菌染，体的提取获取目的基因(引物设计、PCR扩增)构建扩增质粒(酶切、连接、转化、筛选)构建表达质粒(酶切、接、转化、筛选、鉴定)目的基因的诱导表达I基因产物分离、纯化以几丁质酶的基因克隆为主线的连续系列实验，每一个实验紧密衔接.基因工程(Genetic engineering)综合采用了生物化学、遗传学和微生物学等的现代技术，在体外试管内对大分子DNA进行剪切加工，再与不同亲本DNA分子重新组合(recombination),并把它引入受体

3、细胞 中 去，通 过 复 制(replication)、转录(transcription)翻 译(translation)以及表达(expression),使生物获得新的遗传性状。3、实验教学多媒体 在丁鸣老师、邵爱萍老师、周红军老师等共同协作下，跟踪拍摄了实验全过程，精心制作完成 了 基因工程实验多媒体，为老师的上课以及学生对课程的理解提供了方便。在此对给予我们大力支持的各位老师表示深深的谢意！实验计划表培养细菌第一日-口-实验说明 培养转化子：细菌奥色体DNA提取疑股电泳确认 pBSKST)H5 a pET28c(+)/DH5 a核酸含量与纯度测定|pBSKS-ChiVDIlSa第二日_

4、_L_ _ _PCR扩增反应 质粒提取pBSKS、质粒提取：pET28c(+)凝胶电泳确认 质粒的电泳 及pBSKSAGE）SDS*PAGE电泳、臾色、脱色第十日_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _1 _洗膜!显色总 结、实验报告上交、考试预期的实验结果1）染色体DNA提取2）PCR产物3）质粒提取4）质粒的酶切5）割胶、提纯6）感受态细胞、转 化（效率）7）蓝白斑筛选8）扩增、表达质粒提取及酶切情况9）southern blotting10）基因的表达实验考核 平时的实验操作 40分 公共实验参与 10分 实 验结果 10

5、分,实验报告*25分 考试 15分1、基因组DNA的制备 本实验系列多媒体是在丁鸣老师、邵爱萍老师、周红军老师的大力协作下完成的，对他们的辛勤付出表示深深的谢意！实 验 目 的：制备高质量的基因组DNA作为PCR扩增的模板以及用做southern blotting分析。实 验 原 理：（P15）提DNA：细胞裂解、RNA与蛋白质的降解与去除、酒精沉淀DNA.防止DNA降解：机械、蛋白酶、化 学（酸）实验操作1.取1.5ml的培养液，12000rpm离心2分钟。2.沉淀添加560川的T E,充分悬浮。3.加入30m的10%SDS和6川的10mg/ml的蛋白酶K,混匀，于3 7 c保温1小时。4.

6、加入100可的5m oi/LN aC L充分混匀。5.加80|UCTAB/NaCl液，混匀，在65条件下保温10 min。6.加入750可氯仿/异戊醇，混匀，12000rpin离心5min。7.取上清加入7503苯酚/氯仿/异戊醇,混匀，室温12000rpm离心5 min。8.取上清加入450 u l异丙醇，轻轻混匀直到DNA沉淀下 来（室温lOmin）,4*C 8000 rpm离心 10 m in,弃取上清。9.用 1ml 70%酒精洗涤，4 c、12000rpm离心5 min。10.弃去上清液，沉淀在室温条件下倒置干燥10-15min用100 M的TE缓冲液溶解DNA。11.力 口2 u

7、l 的10mg/mlRNascA酶，3 7 c水浴20 min除去RNA.12.取5 g样品进行电泳，样品贮存在4 c冰箱中。2、DNA的电泳1、实验目的：(p41)学习与掌握进行DNA电泳的方法，利用电泳检测DNA纯度、含量以及分子量，还可以分离不同大小DNA片段。2、实验原理*:电泳概念及种类影响电泳迁移的因素影响电泳迁移的主要因素 DNA的大小 DNA的构象*琼脂糖浓度*缓冲液分离不同大小DNAJI段的合适琼脂糖凝胶浓度琼脂糖含(%)DNA片段的有效分离范围(kb)0.35-600.51-300.61-200.70.8-12_1.00.5-101.20.4-61.50.2-42.00.1

8、-3 1缓冲液 TAE：乙酸盐缓冲液 TBE：硼酸盐缓冲液 TPE：磷酸盐缓冲液实验操作1 .称取0.7 克的a g a rose 琼脂桩，加入1 0 0 m l 0.5 X T BE,在微波炉上加热，使琼脂糖熔化。2 .等凝胶温度降至大约5 5 c 以下时，加入5m的0.5m g/L 澳化乙锭（E B）。3 .将移胶板放入胶室中，并将梳子垂直安插在移胶板上方，将凝胶倒入胶室中.4 .等凝胶完全凝固后（约3 0 分钟），将梳子轻轻拔出。5 .将凝胶体放入加有0.5 X T B E 电泳缓冲液的电泳槽中，并且使电泳缓冲液高出凝胶。6.取2/16X上样缓冲液与5 m PCR产物混匀后，加到凝 胶孔

9、中，7.加入如3 u.1 的m arker。8.盖好电泳槽盖子，选择适当的电泳电压(100V)以及 电 泳 方 向，开始电泳。9.前面色素接近胶的先端，切断电流，停止电泳，打开槽盖。10.取出样品，在紫外灯下观察，摄像。DNA标准分子量-入 DNA/H/wdlll Marker3、PCR扩增目的基因1、实验目的：（p39）利用PCR扩增的方法获取用于表达的目的基因以及Southern杂交的探针2、实验原理*:模板、引物、底物在体外进行DNA的扩增预变性(92-95,2-5)PCR的般过程:变性(92-95七 触)复性延伸-总延伸(40-0,30)(7 2,30-60$)(72,70)经过30次

10、的循环，扩增的DNA片段可达100万倍以上.样品DNA预变性双链DNA解 链,94 5minI I引物与单链模板DNA结合30-60#C,30 秒-1 min/双链DNA解链 _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ 聚合酶合成新链94、0.5-1 min j 65-75,2-5min延伸反应完成 引物设计FP.RP(forward primer,reverse primer)SP.AP(sense primer,antisense primer)循环参数：变性(denaturation)退火(annealing)延伸(extension)循环次数(cycle)引物几丁质酶基因的两端序列为：5C

11、A GTTATGCGC AAA TTT AAT AAA.AGCGCC GGC GTT CAA TAA TCG-3上游引物：5,-GC(KJATCCCAGTTATGCGCAAATT-3,(BamHI)24 base GC=50%下游引物：5,-GCGAAGCTTGATTATTGAACGCCGG-3,(加dill)25 base GC=50.5%反应体系ddlI2O模版DNA上游引物(lOjimol/L)下游弓卜物(lORmol/L)dNTP mixture。Ommol/L)10倍 X 缓冲液+MgC%Taq的72.5 ul5 ul(100-200ng)*15 W5 pl31(各 20nmoD10

12、 pl0.5jil(2.5 U)总 体 积loom实验操作1.取一个0.2ml eppendorf管,ddH2O模板DNA上游引物(109mol/L)下游引物(lONmoLL)dNTP mixture(1 OmmoLL)10倍x缓冲液+MgC12Taq赣添加以下各种成分反应液72.5 Ml5 ul(100-200ng)*15 ul5僦)3ul(各20ninol)10 pl0.5川(2.5 U)总 体 积100m2.稍作褥心,将反应管放入PCR仪中。3.设定反应程序：9吐 条件下使模板DNA预变挂5min。变性 9 4 c Imin退火 55X?1 min 130 cycles延伸 7 2 c

13、2.5 miff最后在7 2 c条件进行延伸740m in。4 c保温4.取5 N反应液用0.796琼脂糖凝胶进行电泳，鉴定PCR产物是否存在以及大小。4、PCR产物的纯化实验操作（P 4 3）1.电泳确认后将PCR产物移至1.5 ml新的cppcndor僧中。2.加入2Q0W T*缓冲液，加入300山酚/氯仿/异戊醇，混匀，室温，12000 rpm离心5分钟。*3.取上层水液添加1/10体 积（约30可）的3moi/L的NaAc（pH5.2）和2.5倍体积（约0.75m D的冰冷无水乙醇。4.-20C冰箱中放置30 min以上。5.4 C、12000 rpm离心5 min。6.弃上清，添加1

14、 ml的冰冷70%乙醇。4 C、120（）0 rpm鹿心5 min。7.弃去上清，室温干燥，30WTE液溶解沉淀。5、质粒的提取1、实验目的：（p61）学习与掌握最常用的质粒DNA的提取方法2、实验原理*:碱变性抽提质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DNA的变形与复性的差异而达到分离的目的。科普塞型版斗、q I Z；SR CW J*M d xwwwyijoi 湖】m；”vwmM IW R M IU leouncO、Z Y*T6XY-11 c 1X1JM-U3A JM1K1，“j”8 Mj#/TM17ipiU j 中JQ 1 2 JC”6 jTpn”I丁)w3 J w w m w m 加 vom

15、 加 jm r w m n，*a 3 A H 加 m w R m u E 力而PV m X，i H I w Tr331333J3Wiirrjn3ia3n1f93innj5inM31BAAMejpxTC.XjOJdJBj/jcie,VZMjvAlJtARtAiBjRjvZViiAuNijjjfiTJtJvAtAW,OWR 削”皿 切 溺”1电:1 1“亦 呼”：,R电;叫3川 扫 5干3削”；力啰加词外加32典 千 国 -igM BW?7i E i MM9-u iX lX i iS J Y H,N in *W*$ASWJVO“2，VI3SJ$w x，WFW$J 母u-amiwr 7 5 s s-

16、w-v9n22nrnimu：3imrrivm*x3i)wjiirfjonwroi9mrWMiw-wjjrsjviwnm rowojnnjninfK*W-*JC J|MUAXl MQOWQjd M(+)8cl3dII机9，ClIVUII sIg“川lSI棚 阐ll$dI眄?A即打I I-(ie/9)i90Sl“y 川叫Ml/4IW110)160100HHMfq灼6Zrat/实验操作1.取1.5ml培养液在4 C、12000rpm离心2 m in,弃去上清液，收集前体。2.加入100贝的溶液I,使菌体充分悬浮，室温条件下静置 5min。3.加入200可新配置的溶液I I.温和上下颠倒2-3回，冰浴

17、条件下静置5min。4.加入150m的溶液I I I,上下颠倒混匀数次，冰浴条件下酵置5min.5.4 c条件下 12000 rpm离心lOmin。6.取上清，加入等体积（400ul）的酚/氯仿/异戊醇，充分混匀，室温条件下12000rpm离心5min。7.吸取上层水相，加入1/10体积量（约40贝）3moi/L的pH5.2 Na A c,再加入2.5倍体积（约1ml）的预冷的无水乙醇.8.放入-20C冰箱中静止30 m in,然后在4 C条件下12000rpm 离心 15 m in。9.弃去上清液，加入1 m l预冷的70%乙醵，在4 c条件下12000rpm离心5 m in,洗涤沉淀。10

18、.弃上清液，沉淀物自然干燥后，加入40WTE缓冲液溶解沉 淀（pET质粒用25TE溶解）。11.加入2皿的lOmgmlW RNaseA,3 7 c保温20-30 min。12.取5山的质粒电泳。6、酶切反应I、实验目的：（p70）将目的基因与载体DN A用适当的限制性内切醐进行处理，用于DNA的体外重组。2、实验原理*:限制性内切酶：命名与写法 缓冲液限制性内切酶EnzymeRecognitionSequence*1MicroorganismAlulA G J U TArthmbafter luieusBamHIG J G A T b CBacillus amytaliquefeuirns H

19、G C C N N N N N|N G G CBacillm x Xn8刈A|G ATCTBacillus 4 M X”EcoRIG|A A-T T CEtchcruhta cW i RY 13EcoRI II C U“)GGEtheric hid edi R245btoRVGA-TpKTCEschertchta coii J62P4G74HoellRGCGC|YHacmophtlui argypfiusMar 111G G|C*CHitnwphtlu%aeyptiui/flndlllA*jA G C T THarnutphilus tnftucnzac&IfpdllC|C-G GHattnc

20、philui parainflucnzacMsplU C G GMoraxrlfi speciesPulC TG C Ae|GPruvuirncla uuartU IMPvullC A G JU T GProieui vulgarisSallG|TC G A CStreptomycci atbu%GTdqlTJC G A Thcnnui aquaticuXholC|TCG AGXanthonwnat htftciccla*Thc recognition cquenc is abbrrwited o that only one trnd.rr*din 5,lo y,i given.The clo

21、vac*le i rrprcMntcd by an arrow(J)and the modified ba&e,where ti H known,is indioited by an Ascensk(A*M N-nKthyhdmiitc and Ca%methylcyine).R.Y.and Nrepreicni a punnc nuckotide,a pyrimidine nucleotide.nd any nuckcMKk.respectix*lyt$Mnrr Robert%.R J and Macclls.D.REBASE-th e retinction enzyme database,

22、http/Mwwncb conVrrhaw*I3 0 0Hpa 3,IX D 5,W/ndlllCUTEcoRI,i p s 博 5,CUT3，（I而画面闻回$CUTCUTPsttA)(T-y一种限制前只能识别种特定的核甘酸序列，并在特定的切割点上将DNA分子切断.H前已发现的限制的有200多种.酶 切 反 应（甲）1.在0.5 m l c p p c n d o r f管中加入下列成分，（定容4 0 j d ）2.混匀，少许离心一下。3.在3 7 c条件下反应2 T小时以上，或酶切过夜。4.取5回醯切厂,进行凝胶电泳，预检。A：P C R产物d d I I2O 2 山P C R 3 0 g

23、l(5 p g)i o x缓 冲 液4mHind I I I 2 贝BamH 1 2 g lB：质粒DNA：d d H2O 2 R ip B S S K(0.5 g g/g l)3 0|i l1 0 x通用缓冲液 4,U 1Hind I I I (1 0 U/|i l)2|i lBa m U I (l O U/p l)2 m（乙）1.在e p p e n d o r僧中加入下列成分（定容4 0口）L A T p B S S K C h i A：B:质粒冰A：d d U2O2md d l L O2 W质粒(5 j i g)3 0 mp E T 2 8 c(+)(0.5 u gzu l)3 0 u

24、 I1 0 X缓冲液4 g li o x通用缓冲液4 g lHind I I I2 HIHind I I I (l O U/g l)2 g lBaniW I_ _2_u _l_ _ 1BaniW 1 (l O U/g l)2W2.混匀，少许离心一下。3.在3 7 C条件下反应2-4小时以上，或酣切过夜。4.取53旃 切H进行凝胶电泳，预检.7、电泳、割胶、纯化DNA1、实验目的：（p 7 5）将所需要的D N A片段进行回收，纯化。2、实验原理：II.一 Z TMarker PCR 醒切 Marker pBSKSChiA 酶切实验操作21.长波长u v照射下，判定DNA位置,用手术刀割下含有要

25、回收D N A,放入1.5ml的离心管中*2.按每lOOmg胶加400可 Solution SN,6 5 c 水浴5 m in,中途混匀，直至胶完全融化。按每100mg胶，Solution B 1 0 0 g l,混匀。3.将3s柱放入2ml收集管中，融化的胶溶液转移到3s柱中，开盖，室温放置2min。室温lOOOOrpm离心Imin.4.取下3s柱，倒掉废液，将3s柱放入同一收集管中，加60091 Wash Solut沁n 室温lOOOOrpm鹿心Im in o5.重复46.取出3s柱，倒掉收集管中的废液，将3s柱放入同一个收集管中，室温lOOQOrpm离心2分钟。7.将3s柱放入新离心管中

26、，在柱的膜中央加3 0 w预热的T E,室温放置2min8.lOOOOrpm离心I m in,离心管中液体为回收D N A片段。-2 0 C保存8、DNA片段的体外连接1、实验目的：（p78）将来自不同生物的DNA片段在体外迸行连接，以构建新的重组DNA。2、实验原理：连接缓冲液的量实验操作（甲）1.在离心管中加入以下样品：PCR产物 6ulpBSSK酶切 2川10 X连接缓冲液T4D N A连接酶 lu l2.混匀后，离心将液体全部甩到管底。3.1 6 e条件下保温过夜。4.-20C备用（乙）1.在离心管中加入以下样品：Chi A基因片段 3glpET28c（+）/酶切 5ul10X连接缓冲

27、液T4D N A连接物 lu l2.混匀后，离心将液体全部甩到管底。3.1 6 c条件下保温过夜。4.-20C备用9、重组DNA的转化1、实验目的：(p 8 1)C a C L制备感受态细胞，用于重组质粒的转2、实验原理：亲缘关系、菌体的年龄、环境因子(C a C l2、cA M P)感受态细胞的制备1.接种DH10B于LB培养基中37振荡培养过夜。2.接100可培养液于5ml的LB液体培养基中，3 7 c条件下振W培养2-2.5小时左右，OD600达0.4。3.将1.5ml培养液移至cppcndorf管中、冰浴20min。4.4 c条件下，4000rpm离心5 m in,弃去上清液。5.添加

28、0.75 ml预冷的CaC12溶液，用枪轻轻吹打。6.冰浴30分钟后，4 c条件下，4000甲1 离心501m，弃去上清液。7.细胞沉淀用100川预冷的CaC12溶液悬浮。8.冰浴放置,备用。转化1.取一管100W的感受态细胞，加入质粒与目的基因的连接产物5W，轻轻用枪吹打均匀，冰浴20 min2.42C、保温90秒钟，迅速放入冰中，冰浴5 min。3.添加1 ml的LB培养基。4.37C振荡培养1小时。5.3000 rpm离心5分钟，弃去1ml上清，余下0.1ml用枪吹匀，吸至含有抗生素的LB培养基平板上，另添加20皿20mg/ml X-gal和40m的 100 mmol/L IP T G,

29、均匀涂布。6.37七倒置培养8-12小时。10、阳性克隆的筛选1、实验目的：（p87）学习与掌握阳性克隆的筛选方法，了解抗药性筛选和a-互补筛选的原理。学习电泳法筛选鉴定重组质粒的方法。2、实验原理*:抗 生 素 兰白筛选 提质粒的切电泳核酸杂交或PCR转 化 子（不含质粒）非 重 组 子（含空载载体）转 化 子J f载体受损一重组子.期望重组子（含目的基因）重 组 子 I非期望重组子a互补筛选法（显色模型筛选法）pBSSKpUC(/acZ)DH10BJM109(/acZM15)蓝白筛选实验操作1.选取白色单接入5 ml含抗生素的LB培养基中，37C振荡培养过夜。2.取1.5菌液抽提质粒，部分

30、菌液4 c保存3.质粒抽提后，最后溶解于40 a的TE中。4.质粒电泳构建的扩增质粒（甲）1#2#3#4#5#6#M pBSKS1、2、3、5、6质粒可能是目标的扩增质粒抽提质粒的酶切鉴定5.对初步确定有外源基因迸入的质粒用限制性内切酶进行切割、鉴定。重组质粒DNA 10glddII2O 6ul10 X 通用缓冲液 2川BamHI 0.5 3Hindlll 0.5回6.37保温0.5-1小时7.电泳扩增质粒的酶切（甲）MarkerM 1 2 3 5 6 PCRpBSKS、要增24需扩粒1.5是的质2#扩增质粒的确定（甲）PCR法M 1 2 chiA构建的表达质粒（乙）表达质粒的酶切（乙）M：I

31、）N A 标准分子量 1#表达质粒/龌切 2#表达质粒/防切 梅切p E T 2 8 c（+）福切P C R 产物12 3 4重组质粒 一、J -!-Hpi;.r 2重组pET/酶切PEl PAPER FROM DISH TOPRtXXJCE REPLICA O FCaOHIESLYSE BACTERIA AND0NATUR DMAWITH ALKALIposition of desiredcolonies detected bymjtorsdicrophy、外源基因的诱导表达1、实验目的：（pl08）学习和掌握外源基因的诱导表达方法，为SDS-PAGE分析做准备。2、实验原理:实验操作1.将

32、含有pET28 c重组子的BL21菌落接种于2ml含卡那霉素(S O m l)的LB培养基中,37,C振荡培养过夜。2.分别取150口培养液于5ml含卡那霉素(50附加1)的LB培养基中，培养2小时左右，至OD600达0.5左右。3.取出LOml样品作为IPTG诱导前的样品。4.其余样品中添加12山的lOOmM IPTG继续培养。5.分别在1、2、3、4、5小时后取出1.0 ml样品作为IPTG诱导后的样品。6.IPTG诱导前与诱导后的样品12000rpm离心2min。7.回收菌体沉淀。8.菌体沉淀样品中加入30川pH7.4的PBS缓冲液和10皿的4XSDS loading b u ffer,

33、在旋涡混合器上剧烈震荡Im in,使菌体完全溶菌。9.将样品在100C沸水浴中保温5 m in,立即放入冰浴中冷却。10.12000rpm离心Im in,回收上清11.样品直接进行SDS-PAGE分析或在-20C冰箱中保藏。12、SDS-PAGE1、实验目的：（p ili）利用SDS-PAGE电泳检测表达蛋白，确定蛋白质的分子量。并掌握其原理与方法。2、实验原理:（-）电泳胶的准备与电泳1.制胶板的安装,要求密封,以免胶液泄漏.2.配置适量（如7.5ml）的10%浓度的分离胶HhO 4.0ml30%胶母液 2.5ml分离胶缓冲液（pH8.8）0.9nil10%SDS 75plIO%APS 60

34、plTEMED 5pl3.将分离胶加入制胶槽中，注意应随着边缘缓慢加入，千万别进气泡。凝胶液加至约距前玻璃板顶端15cm或距梳子齿约05cm处.4.在分离胶溶液上覆盖一层重蒸水封胶，使凝枝表面变得平整，酢放大约30min使凝胶聚合.5.除去上面的水层，用纸巾吸尽残留的液体.配置5%浓缩股30羯胶母液 05 ml浓缩股缓冲液（pH6.7）0.37mlHzO 2.1ml10%SDS 25pl10%APS 25plTEMED 5pl6.迅速将配置好的浓缩胶添加到分离胶上面，并将梳子插入凝胶内,11至梳子齿的底部与前玻璃板的顶端平齐（小心避免混入气泡卜7.凝胶聚合后轻轻拔出梳子。在上下电泳槽中添加IX

35、电极缓冲液。8.在电泳槽的泳道中分别添加标准蛋白质与样品.9.接通电源，起始电流20m A,起始电压80V.10.电泳大致需要2 7小时.待澳酚黄前沿到达电泳槽底部时，切断电源，从电极上拔掉电极插头，取出玻璃板.（二）染色与脱色1.电泳先后，带上手套，小心从制胶板上将凝胶朝下，弃去浓缩胶.在右下角切去小片作为定位标记.2.用清水洗股，将分离胶放入染色液中慢摇动，染色2030分钟.3.取出用水潦洗后，将胶放入脱色液中进行扩散脱色，11到背景蓝色槌淡，见到条带，大约换3 4次脱色液即可.4.确定外源基因表达的蛋白是在上清液中，还是在菌体胞内.5.电泳迁移率的计算：6.计算样品蛋白质的分子量。13、

36、Southern blotting实验目的(p95)1.通过Southern杂交，检测重组DNA分子中插入的外源DNA片段是否是原供体菌株中的一个基因片段，同时可以检测基因片段在基因组的不同酶切条件下的分子量大小。2.学习与掌握Southern印迹杂交技术。实验原理1 2 31.DNA samples cut withrestriction enzymes are loaded onagarose gel for electrophoresislane 1:Radioactive size markersLane 2:DNA cut with restriction enzyme ALane

37、3:DNA with restriction enzyme B,Gel electrophoresis1 2 3DNA is denaturedGel is placedon sponge wkk2.DNA is separated byelectrophoresis but invisibleto the naked eyesponge by capillary actkxitranUerring DNA fragments to filter-Radioactive，：probe4.Filter is placed in heat-sealed bag withsolution conta

38、ining labeled probePlace X-ray filmover filterAutoradiogram;all size markers showbecause they are radioactive;in lanes 2and 3,only those bands that hybridizewith probe show up（一）滤膜的准备1.2.提取基因组（染色体）DNA用适当限制性内切筋（如Bamlll、EcoRi、山d ill或Ps，I）消化DNA,重蒸水基因组DNA10 X缓冲液限制性内切酣1 1 1 1151(3-5iig)2ul2jil3.4.5.3 7 c

39、条件下保温10-24小时。取2m样品在0.7-1%凝胶上在TBE溶液中进行电泳检查。确定后，样品与DNA分子量标准一起胶电泳。6.电泳结束后，在凝胶的侧沿放一把直尺进行拍照，并做标号。7.将电泳凝胶用蒸馅水冲洗后，放入100ml depurinationsolution中，室温条件下缓慢振动浸泡15min。（显黄色）8.凝胶蒸储水冲洗后，转移到100ml变性溶液中缓慢振动浸泡20分钟，换新的变性溶液，再振动浸泡20分钟。（显兰色）9.水洗凝胶后，转移到中和溶液缓慢振动浸泡1 5,然后换溶液后，再浸泡15min。DNA转移装置10.毛细管作用，将DNA从琼脂糖凝胶转移到稍酸纤维素滤膜或尼龙膜上。

40、11.取出杂交尼龙膜，在其上面做上记号，在6XSSC溶液中非常缓慢转动条件下清洗5 m in.（含有DNA面朝上）12.将其从溶液中取出，放在Whatman 3M M滤纸上，让其自然风干。13.夹在两张滤纸中，放在80C条件下烘烤2小时。14、探针标记、杂交（一）探针的标记（p97）1.10ng-3 ugD N A,用双蒸水定容至15叽2.在沸水浴中变性DNA 10 m in,迅速放入冰浴中。3.进行标记反应，变性DNA 15 gl10 X缓冲液（六聚寡核甘酸引物）2 贝dNTP标记混合物 2 WKlenow enzyme 1 gl总体积20 u I4.混 匀、少许离心后，在3 7 c条件下培

41、养1-20小时。5.65C加热10分钟终止反应。随机UI物标记(Alpurified DNA restriction fragmentdenature and anneal withI mixture of hexanucleotidesadd DNA polymerase andlabeled nucleotidesDNA polymerase incorporates labelednucleotides,resulting in a population of DNAmolecules that contain labeled examples of allsequences on bo

42、th strandsDIG-ll-dUTP!r!r&modified nucleosidetriphosphateOH H(二)杂交1.预热 10ml 的DIG Easy I lyb(20ml/l()0cm2膜)。2.在合适的容器中，柔和摇动，预杂交膜3()min。3.在沸水浴中5 m in,变性大约25mg/ml的DIG标记DNA探针，然后迅速在冰浴中冷却。4.将变性后的探针添加到3ml的DIG Easy Ilyb混匀。5.奔去杂交管中的预杂交液，添加探针/杂交液到膜，在缓慢振动情况下保温杂交6h或者过夜。6.用洗液I(2X SSC,0.1%SD S)在室温条件下洗2次,每次15min。7.用预热的洗液 II(0.5XSSC,0.1%SDS),在6 5 c的条件下，摇动洗2次，每次15min。(三)免疫检测1.杂交后，washing buffer中漂洗膜l-5min2.在 100ml封闭液(blocking solution)中，保温30min3.在20ml抗体溶液(/Antibody solution)中保温30min4.用 100ml washing buffer洗2次，每次 15min05.用20ml检测液平衡25min06.在黑暗中，加10ml colorsubstrate溶液于适当容器中，保温。在显色的过程中不要摇动。7.膜短时间内谶光检测显色。