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1、第第 3131 讲讲基因工程基因工程最新考纲1.基因工程的诞生()2.基因工程的原理及技术(含 PCR 技术)()3.基因工程的应用()4.蛋白质工程()5.实验：DNA 的粗提取与鉴定全国卷考情2018全国卷(38)、2018全国卷(38)、2017全国卷(37)、2017全国卷(37)、2017全国卷(37)、2016全国卷(40)、2016全国卷(40)考点一基因工程的基本工具及操作过程1.基因工程的基本工具(1)限制性核酸内切酶(限制酶)来源：主要从原核生物中分离纯化而来。作用：识别特定的核苷酸序列并切开特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。作用结果(2)DNA 连接酶作用：将限制酶切
2、割下来的 DNA 片段拼接成 DNA 分子。类型常用类型来源功能Ecoli DNA 连接酶大肠杆菌只“缝合”黏性末端T4 DNA 连接酶T4噬菌体“缝合”黏性末端和平末端结果(3)载体条件：能在受体细胞中复制并稳定保存；具有一至多个限制酶切点；具有标记基因。最常用：质粒种类其他：噬菌体的衍生物、动植物病毒等作用：携带外源 DNA 片段进入受体细胞。2.基因工程的基本操作程序(1)目的基因的获取目的基因：主要指编码蛋白质的基因，也可以是一些具调控作用的因子。恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键人工利用mRNA反转录合成获取方法合成 通过DNA合成仪用化学方法人工合成利用PCR技术扩增(2
3、)基因表达载体的构建基因工程的核心目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。基因表达载体的组成从基因文库中获取构建过程(3)将目的基因导入受体细胞的“三种类型”导入植物细胞农杆菌转化法(花粉管通道法、基因枪法)。其受体细胞为体细胞或受精卵。农杆菌在自然条件下易感染双子叶植物和裸子植物，并将其 Ti 质粒上的 TDNA转移并整合到受体细胞染色体 DNA 上。导入动物细胞显微注射法其受体细胞为受精卵。导入微生物细胞感受态细胞法，需用 Ca2处理获得感受态细胞使其能吸收DNA 分子。3.目的基因检测与鉴定的“两个水平”1.限制性核酸内切酶 Mun
4、和限制性核酸内切酶 EcoR 的识别序列及切割位点分别是CAATTG和GAATTC。如图表示四种质粒和目的基因，其中箭头所指部位为限制性核酸内切酶的识别位点，质粒的阴影部分表示标记基因。适于作为图示目的基因载体的质粒是哪一种？并指明理由。提示适合的质粒是。由图可知，质粒上无标记基因，不适合作为载体；质粒和的标记基因上都有限制性核酸内切酶的识别位点，使用该酶后将会导致标记基因遭破坏，故均不宜选作载体。2.下图中的图1和图2分别表示的是EcoR限制酶和Sma限制酶的作用示意图。请思考：(1)EcoR限制酶和 Sma限制酶的化学本质是什么？其单体是什么？两类酶识别的碱基序列及切割的位点分别是什么？提
5、示蛋白质氨基酸EcoR限制酶识别的碱基序列是 GAATTC，切割位点在G 和 A 之间；Sma限制酶识别的碱基序列是 CCCGGG，切割位点在 G 和 C 之间。(2)以上实例说明限制酶具有何种特性？提示专一性。(3)要将图 1 中的末端再连接起来，需要用哪类连接酶，若连接图 2 的末端呢？提示连接图 1 中的黏性末端既可用 Ecoli DNA 连接酶，也可用 T4 DNA 连接酶，连接图 2 中平末端只能用 T4 DNA 连接酶。3.已知限制性核酸内切酶的识别序列和切点是GGATCC，限制性核酸内切酶的识别序列和切点是GATC，根据图示思考下列问题：(1)切割目的基因应选用哪类限制酶？切割质
6、粒呢？请说明理由。(2)限制性核酸内切酶和限制性核酸内切酶切割后获得的黏性末端是否相同？(3)将基因表达载体导入受体细胞后，进行筛选时，培养基中应添加填“青霉素”还是“四环素”)？为什么？提示(1)由于限制酶识别位点GGATCC，限制酶识别位点为GATC，由此可见限制酶也可切割限制酶的位点，图中显示目的基因两端分别有限制酶、限制酶识别位点，故使用限制酶时，可在目的基因两端同时作切割，从而切出“目的基因”，然而，倘若使用限制酶切割质粒，则会同时破坏质粒中的两个“标记基因”，故只能使用限制酶切割质粒。(2)相同(均具 GATC)。(3)青霉素因使用限制酶后，四环素抗性基因已被破坏。重点串讲整合1.
7、诠释基因表达载体(1)分段解读(2)载体上标记基因的标记原理辨析载体上的标记基因一般是一些抗生素的抗性基因。目的基因要转入的受体细胞没有抵抗相关抗生素的能力当含有抗生素抗性基因的载体进入受体细胞后，抗性基因在受体细胞内表达，使受体细胞能够抵抗相应抗生素，所以在受体细胞的培养体系中加入该种抗生素就可以只保留转入载体的受体细胞，倘若在选择培养基中不能存活，则表明无质粒转入，当然不会有“目的基因”转入，能存活时必含该载体，原理如下图所示：2.四类受体细胞的筛选与判定当用相应的限制酶切割了目的基因与载体后，可将二者混合，加入 DNA 连接酶进行连接反应，用得到的混合物直接转化受体细胞，其结果有如下四种
8、：上述四类受体细胞中通过“标记基因”(制备的培养基)可区分出与，而通过 DNA 分子杂交技术，可进一步区分与。点悟：“标记基因”筛选后为何还需应用“DNA 分子杂交技术”确认目的基因是否转入？经上述步骤筛选得到的受体细胞，只是含特定(具有标记基因)的载体，然而，该载体上是否成功嵌入了目的基因，还不能确定，故仍需使用“目的基因”作探针，利用 DNA 分子杂交技术，检测受体细胞的质粒上是否含目的基因。3.诠释基因组文库与部分基因文库基因文库类型基因组文库部分基因文库(cDNA 文库)构建基因文库的过程含某种生物全部基因其他区别有启动子、有内含子部分可与其他生物基因交流1.(2018全国卷，38)生
9、物选修 3：现代生物科技专题含该种生物“部分”基因无启动子，无内含子均可与其他生物基因交流某种荧光蛋白(GFP)在紫外光或蓝光激发下会发出绿色荧光，这一特性可用于检测细胞中目的基因的表达。某科研团队将某种病毒的外壳蛋白(L1)基因连接在GFP 基因的 5末端，获得了 L1GFP 融合基因(简称为甲)，并将其插入质粒 P0，构建了真核表达载体 P1，其部分结构和酶切位点的示意图如下，图中 E1E4 四种限制酶产生的黏性末端各不相同。回答下列问题：(1)据图推断，该团队在将甲插入质粒P0 时，使用了两种限制酶，这两种酶是。使用这两种酶进行酶切是为了保证，也是为了保证。(2)将 P1 转入体外培养的
10、牛皮肤细胞后，若在该细胞中观察到了绿色荧光，则说明 L1 基因在牛的皮肤细胞中完成了和过程。(3)为了获得含有甲的牛，该团队需要做的工作包括：将能够产生绿色荧光细胞的移入牛的中、体外培养、胚胎移植等。(4)为了检测甲是否存在于克隆牛的不同组织细胞中，某同学用 PCR 方法进行鉴定，在鉴定时应分别以该牛不同组织细胞中的(填“mRNA”“总RNA”或“核 DNA”)作为 PCR 模板。解析(1)据图示信息分析：将 L1GFP 融合基因(甲)插入质粒时使用酶 E1 和 E4进行酶切，既能保证 L1GFP 融合基因的完整，又能保证 L1GFP 融合基因与载体的正确连接。(2)目的基因在受体细胞中的表达
11、包括转录和翻译两个过程。(3)将体外培养的含有目的基因的动物体细胞核移入该动物的去核卵母细胞中，经过体外胚胎培养、胚胎移植等技术可获得转基因动物。(4)检测目的基因是否存在于克隆牛的不同组织细胞中，采用 PCR 技术鉴定时，应以该牛不同组织细胞中的核DNA 作为 PCR 模板。答案(1)E1 和 E4甲的完整甲与载体正确连接(2)转录翻译(3)细胞核去核卵母细胞(4)核 DNA2.(2016全国卷，40)某一质粒载体如图所示，外源 DNA 插入到 Ampr或 Tetr中会导致相应的基因失活(Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，Tetr表示四环素抗性基因)。有人将此质粒载体用 BamH酶切后，与用
12、BamH酶切获得的目的基因混合，加入 DNA 连接酶进行连接反应，用得到的混合物直接转化大肠杆菌，结果大肠杆菌有的未被转化，有的被转化。被转化的大肠杆菌有三种，分别是含有环状目的基因、含有质粒载体、含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。回答下列问题：(1)质粒载体作为基因工程的工具，应具备的基本条件有(答出两点即可)，而作为基因表达载体，除满足上述基本条件外，还需具有启动子和终止子。(2)如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选，在上述四种大肠杆菌细胞中，未被转化的和仅含环状目的基因的细胞是不能区分的，其原因是_；并且和的细胞也是不能区分的，其原因是_。在上述筛选的基础上，若要筛选含有插入了目的
13、基因的重组质粒的大肠杆菌的单菌落，还需使用含有的固体培养基。(3)基因工程中，某些噬菌体经改造后可以作为载体，其 DNA 复制所需的原料来自于_。解析(1)作为运载体必须具备如下特点：能自主复制，从而在受体细胞中稳定维持和表达；含标记基因，以供重组 DNA 的鉴定和选择；具 1多个限制酶切割位点以便外源 DNA 插入。(2)在含有氨苄青霉素的培养基上，只有具有Ampr的大肠杆菌才能够生长。而 Ampr位于质粒上，故未被转化的和仅含环状目的基因的大肠杆菌细胞中无 Ampr，故不能在培养基中生长，而仅含有质粒载体的和含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌均具有 Ampr因而能在培养基中生长。目的基
14、因的插入破坏了质粒载体的 Tetr，故含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌不能在含有四环素的平板上生长，从而与仅含有质粒载体的大肠杆菌得以区分。(3)噬菌体是病毒，无细胞结构，无法自主合成 DNA，需借助宿主细胞完成 DNA复制。答案(1)能自我复制、具有标记基因(2)二者均不含有氨芐青霉素抗性基因，在该培养基上均不生长含有质粒载体含有插入了目的基因的重组质粒(或答含有重组质粒)二者均含有氨芐青霉素抗性基因，在该培养基上均能生长四环素(3)受体细胞考点二基因工程的应用及蛋白质工程1.基因工程的应用(1)动物基因工程：用于提高动物生长速度从而提高产品产量；用于改善畜产品品质；用转基因动物生产药
15、物；用转基因动物作器官移植的供体等。(2)植物基因工程：培育抗虫转基因植物(如抗虫棉)、抗病转基因植物(如转基因烟草)和抗逆转基因植物(如抗寒番茄)；利用转基因改良植物的品质(如新花色矮牵牛)。(3)比较基因治疗与基因诊断：基因治疗原理基因表达碱基互补配对操作过程利用正常基因导入有基因缺陷的细胞中，以表达出正常性状来治疗(疾病)制作特定 DNA 探针与病人样品 DNA 混合，分析杂交带情况进展临床实验基因诊断临床应用2.蛋白质工程(1)流程图A.转录，B.翻译，C.分子设计，D.多肽链，E.预期功能。(2)手段：基因修饰或基因合成。(3)结果：改造了现有蛋白质或制造出新的蛋白质。(4)应用：主
16、要集中应用于对现有蛋白质进行改造，改良生物性状。1.既然存在基因工程，为什么还要改造蛋白质？提示基因工程只能产生自然界已存在的蛋白质。2.(教材 P26 旁栏思考题解答)对天然蛋白质进行改造，你认为应该直接对蛋白质分子进行操作，还是通过对基因的操作来实现？提示毫无疑问应该从对基因的操作来实现对天然蛋白质改造，主要原因如下：(1)任何一种天然蛋白质都是由基因编码的，改造了基因即对蛋白质进行了改造，而且改造过的蛋白质可以遗传下去。如果对蛋白质直接改造，即使改造成功，被改造过的蛋白质分子还是无法遗传的；(2)蛋白质具有十分复杂的空间结构，基因的结构相对简单，容易改造。1.(2018海南卷，31)选修
17、 3：现代生物科技专题甜蛋白是一种高甜度的特殊蛋白质。为了改善黄瓜的品质，科学家采用农杆菌转化法将一种甜蛋白基因成功导入黄瓜细胞，得到了转基因植株。回答下列问题：(1)用农杆菌感染时，应优先选用黄瓜(填“受伤的”或“完好的”)叶片与含重组质粒的农杆菌共培养，选用这种叶片的理由是_。(2)若在转基因黄瓜中检测到这种甜蛋白，则表明该重组质粒中已转移到植物细胞中且能够表达；用该转基因黄瓜的某一植株与一株非转基因植株杂交，发现子代中含甜蛋白个体数与不含甜蛋白个体数之比为 11，则说明甜蛋白基因已经整合到(填“核基因组”“线粒体基因组”或“叶绿体基因组”)中。(3)假设某种转基因作物因为受到病毒感染而减
18、产，若要以该转基因作物为材料获得脱毒苗，应选用作为外植体进行组织培养。(4)通常，基因工程操作主要有 4 个步骤，即目的基因获取、重组表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。因此，基因工程的含义可概括为_。解析(1)当植物体受到损伤时，伤口处的细胞会分泌大量的酚类化合物，吸引农杆菌移向这些细胞，因此用农杆菌感染时，优先选用黄瓜受伤的叶片。(2)若在转基因黄瓜中检测到这种甜蛋白，说明目的基因甜蛋白基因在受体细胞中已经完成表达；若甜蛋白基因整合到线粒体基因组或叶绿体基因组中，在遗传时遵循母系遗传，不会出现固定的分离比，所以子代中含甜蛋白个体数与不含甜蛋白个体数之比为 11，则
19、说明甜蛋白基因已经整合到核基因组。(4)基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，并通过体外 DNA 重组和转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，从而创造出符合人们需要的新生物类型和生物产品。答案(1)受伤的叶片伤口处的细胞释放出大量酚类物质，可吸引农杆菌移向这些细胞(2)甜蛋白基因核基因组(3)茎尖(4)按照人们的愿望进行设计，并通过体外DNA 重组和转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出符合人们需要的新生物类型2.(2015全国卷，40)已知生物体内有一种蛋白质(P)，该蛋白质是一种转运蛋白，由 305 个氨基酸组成。如果将 P 分子中 158 位的丝氨酸变成亮氨酸，240 位的谷氨酰
20、胺变成苯丙氨酸，改变后的蛋白质(P1)不但保留 P 的功能，而且具有了酶的催化活性。回答下列问题：(1)从 上 述 资 料 可 知，若 要 改 变 蛋 白 质的 功 能，可 以 考 虑对 蛋 白 质 的进行改造。(2)以 P 基因序列为基础，获得P1基因的途径有修饰基因或合成基因，所获得的基因表达时是遵循中心法则的，中心法则的全部内容包括_的复制；以及遗传信息在不同分子之间的流动，即：_。(3)蛋白质工程也被称为第二代基因工程，其基本途径是从预期蛋白质功能出发，通过_和，进而确定相对应的脱氧核苷酸序列，据此获得基因，再经表达、纯化获得蛋白质，之后还需要对合成蛋白质的生物进行鉴定。答案(1)氨基
21、酸序列(或结构)(2)PP1DNA 和 RNA(或遗传物质)DNARNA、RNADNA、RNA蛋白质(或转录、逆转录、翻译)(3)设计蛋白质的结构推测氨基酸序列功能蛋白质工程与基因工程的比较项目蛋白质工程基因工程定向改造生物的遗传特性，以获实质定向改造或生产人类所需蛋白质得人类所需的生物类型或生物产品(基因的异体表达)结果联系生产自然界中没有的蛋白质生产自然界中已有的蛋白质蛋白质工程是在基因工程的基础上延伸出来的第二代基因工程，因为对现有蛋白质的改造或制造新的蛋白质，必须通过基因修饰或基因合成实现考点三PCR 技术与 DNA 的粗提取与鉴定1.PCR 技术(1)PCR 含义：即多聚酶链式反应，
22、是一项在生物体外复制特定 DNA 片段的核酸合成技术。(2)原理：DNA 双链复制。(3)前提：有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便据其合成引物。(4)条件：除需引物及控制温度外，还必须有耐高温的 DNA 聚合酶(Taq酶)(5)PCR 反应过程过程变性复性说明加热至 9095，DNA 解链为单链冷却至 5560，两种引物结合到互补DNA 链加热至 7075，热稳定 DNA 聚合酶(Taq酶)从引物起始进行互补链的合成图解延伸(6)结果：上述三步反应完成后，一个 DNA 分子就变成了两个 DNA 分子，随着重复次数的增多，DNA 分子就以 2n的形式增加PCR 的反应过程都是在 PCR扩增仪中
23、完成的。2.DNA 的粗提取与鉴定(1)实验原理(2)操作流程(3)DNA 与蛋白质在 NaCl 溶液中的溶解度比较物质的量浓度为 2mol/L NaCl 溶液溶解物质的量浓度为0.14mol/L NaCl 溶液析出NaCl 溶液浓度从 2蛋白质部分发生盐析沉淀溶解mol/L降低过程中溶解度逐渐增大仔细观察图示过程，请思考：溶解规律DNA(1)图中方法可以获得大量目的基因，这是一种什么技术方法？其原理是什么？(2)图中 A、B 分别是什么？其单体是否相同？(3)过程的名称是什么？过程首先要将反应体系的温度升高到9095，其目的是什么？如果是在体内，该过程如何完成？提示(1)图中方法为 PCR
24、技术，该技术是生物体外复制特定 DNA 片段的核酸合成技术，其原理是 DNA 双链复制。(2)图中 A 为引物，B 为热稳定 DNA 聚合酶(Taq 酶)，二者单体不同，前者单体为核苷酸，后者单体为氨基酸。(3)为变性，为复性，为延伸，过程升温到 9095，目的是使目的基因受热变性后解链为单链，该过程若发生于体内，需在解旋酶作用下解旋为两条单链(且为边解旋边复制)。1.(PCR 技术)(2017经典高考)金属硫蛋白(MT)是一类广泛存在的金属结合蛋白，某研究小组计划通过多聚酶链式反应(PCR)扩增获得目的基因，构建转基因工程菌，用于重金属废水的净化处理。PCR 扩增过程示意图如下，请回答下列问
25、题：(1)从高表达 MT 蛋白的生物组织中提取 mRNA，通过获得用于PCR 扩增。(2)设计一对与 MT 基因两端序列互补配对的引物(引物 1 和引物 2)，为方便构建重组质粒，在引物中需要增加适当的位点。设计引物时需要避免引物之间形成，而造成引物自连。(3)图中步骤 1 代表，步骤2 代表退火，步骤 3 代表延伸，这三个步骤组成一轮循环。(4)PCR 扩增时，退火温度的设定是成败的关键。退火温度过高会破坏的碱基配对。退火温度的设定与引物长度、碱基组成有关，长度相同但的引物需要设定更高的退火温度。(5)如果 PCR 反应得不到任何扩增产物，则可以采取的改进措施有。(填序号：升高退火温度降低退
26、火温度重新设计引物)。解析(1)由 mRNA 获得目的基因片段需通过逆转录获得的片段为 cDNA。(2)为方便构建重组质粒，宜在引物中增加适当的限制酶位点以便使复制出的目的基因两端含限制酶切点；设计引物时，需避免引物之间碱基互补配对，以防引物间自连。(3)图中步骤 1 为高温下实现 DNA 变性解链。(4)PCR 扩增时，若退火温度过高会破坏引物与模板间的碱基互补配对，DNA 片段中 G 与 C 间可形成三个氢键，GC 比例越高时 DNA 分子越稳定，其退火温度应越高。(5)若 PCR 反应得不到任何扩增产物，则可通过降低退火温度及重新设计引物等措施，以便使引物与模板结合，从而进行后序扩增过程
27、。答案(1)逆转录cDNA(2)限制性核酸内切酶碱基互补配对(3)变性(4)引物与模板GC 含量高(5)2.(DNA 的粗提取与鉴定)DNA 的粗提取与鉴定的实验(如图)：(1)本实验材料选用鸡血细胞液，而不用鸡的全血，主要原因是鸡血细胞液中含量较高，另外本实验不适合用哺乳动物的血细胞液，原因是_。(2)图中 A 所示加入蒸馏水的目的是_。(3)通过图中 B 所示步骤取得滤液后，再向滤液中加入 2 mol/L 的 NaCl 溶液的目的是_。(4)图中 C 所示加入蒸馏水的目的是_。(5)为鉴定实验所得丝状物的主要成分是 DNA，可用试剂进行检验，在沸水浴条件下，冷却后可以看到颜色反应为色。答案
28、(1)DNA哺乳动物成熟的红细胞中没有细胞核(2)使血细胞吸水涨破，释放出核物质 DNA(3)使 DNA 溶解于 NaCl 溶液中(4)使 DNA 的溶解度下降而析出(5)二苯胺蓝(1)DNA 的粗提取与鉴定实验中的“2、4、4”加蒸馏水加到鸡血细胞液中，使血细胞吸水涨破；加到含 DNA 的 2 mol/L2 次的 NaCl 溶液中，使 NaCl 溶液的物质的量浓度稀释到 0.14 mol/L，使DNA 析出过滤血细胞破裂流，得到含细胞核物质的滤液；过滤用 2 mol/L用纱布过滤 4 次的 NaCl 充分溶解的 DNA，滤去溶液中的杂质；滤取0.14 mol/L 的NaCl溶液中析出的DNA
29、(黏稠物)；过滤溶有DNA的2 mol/L的NaCl溶液加 2 mol/L 的 NaCl 溶液，溶解提取的细胞核物质；用0.14 mol/L用 NaCl的 NaCl 溶液使 DNA 析出；用 2 mol/L 的 NaCl 溶液，溶解滤取的DNA 黏稠物；用 2 mol/L 的 NaCl 溶液，溶解丝状物用于鉴定 DNA(2)细胞内 DNA 复制和体外扩增 DNA(PCR)解旋酶引物温度能量循环次数相同点细胞内 DNA 复制边解旋边复制解旋酶、DNA 聚合酶RNA体内温和条件ATP生物体自身控制体外 DNA 扩增(PCR)高温解旋，双链完全分开热稳定 DNA 聚合酶DNA、RNA高温不加30 多
30、次提供 DNA 模板；4 种脱氧核苷酸为原料；子链延伸的方向都是从 5到 3端澄清易混易错强化科学思维易错易混易错点 1目的基因插入载体的部位是随机的吗？点拨目的基因的插入位点不是随意的：基因表达需要启动子与终止子的调控，所以目的基因应插入到启动子与终止子之间的部位，若目的基因插入到启动子内部，启动子将失去原功能。易错点 2混淆常考的 8 种酶点拨归纳如下易错点 3混淆启动子与起始密码，终止子与终止密码点拨启动子起始密码子，终止子终止密码子(1)启动子：一段有特殊结构的 DNA 片段，其位于基因的首端它是 RNA 聚合酶识别、结合的部位。(2)终止子：一段有特殊结构的 DNA 短片段，其位于基
31、因的尾端其作用是使转录过程停止。(3)起始密码子和终止密码子位于 mRNA 上，二者分别控制翻译过程的启动和终止。易错点 4切割目的基因与切割载体时是否“只能”使用“同一种酶”？点拨(1)在获取目的基因和切割载体时通常用同种限制酶，以获得相同的黏性末端。但如果用两种不同限制酶切割后形成的黏性末端相同时，在 DNA 连接酶的作用下目的基因与载体也可以连接起来。(2)为了防止载体或目的基因的黏性末端自己连接即所谓“环化”可用不同的限制酶分别处理目的基因和载体，使目的基因两侧及载体上切口两侧均具有两个不同的黏性末端，但又能彼此嵌入。规范答题下表中列出了几种限制性核酸内切酶识别序列及其切割位点，图 1
32、、图 2 中箭头表示相关限制性核酸内切酶的酶切位点。请回答下列问题：(1)一个图 1 所示的质粒分子经Sma切割前后，分别含有几个游离的磷酸基团？。(2)组建理想的载体需要对天然的质粒进行改造，人工改造质粒时，要使目的基因能成功表达，还应插入。若对图中质粒进行改造，插入的 Sma酶切位点越多，质粒的热稳定性越低还是越高？_。(3)用图中的质粒和外源 DNA 构建重组质粒，能否使用 Sma 切割？为什么？_。(4)构建重组质粒时能否使用 BamH和 Hind 两种限制酶同时处理质粒、外源DNA？，如果能同时使用 BamH和 Hind两种限制酶，与只使用EcoR相比较，其优点在于_。(5)为了获取
33、重组质粒，将切割后的质粒与目的基因片段混合，并加入酶。(6)重组质粒中抗生素抗性基因的作用是为了_。(7)为了从 cDNA 文库中分离获取蔗糖转运蛋白基因，将重组质粒导入丧失吸收蔗糖能力的大肠杆菌突变体，然后在的培养基中培养，以完成目的基因表达的初步检测。答卷采样错因分析考虑问题不全面，没有认真分析题中的图示质粒。种限制酶切割。正确答案是：能，可以防止止质粒和含目的基因的外源 DNA片段自身环化混淆 DNA 聚合酶与 DNA 连接酶正确答案：DNA 连接酶答题不严密，必须强调蔗糖为唯一碳源正确答案：蔗糖为唯一含碳营养物质正确答案：启动子和终止子思维定热势，理解错误，误认为构建重组质粒时只能使用
34、同一探索高考命题的奥秘探索高考命题的奥秘(九九)教材原型1.(人教版选修三 P3“内文”)博耶(H.Boyer)和科恩(S.Cohen)将非洲爪蟾核糖体蛋白基因与质粒重组后导入大肠杆菌细胞中进行了表达。该研究除证明了质粒可以作为载体外，还证明了体外重组的质粒可以进入受体细胞；真核生物基因可在原核细胞中表达。转换视角 12018全国卷，38(1)回答下列问题：(1)博耶(H.Boyer)和科恩(S.Cohen)将非洲爪蟾核糖体蛋白基因与质粒重组后导入大肠杆菌细胞中进行了表达。该研究除证明了质粒可以作为载体外，还证明了_(答出两点即可)。答案体外重组的质粒可以进入受体细胞；真核生物基因可在原核细胞
35、中表达教材原型2.(人教版选修三P2“内文”)艾弗里等人的肺炎双球菌转化实验为证明DNA是遗传物质做出了重要贡献，也可以说是基因工程的先导，如果说他们的工作为基因工程理论的建立提供了启示，那么，这一启示是 DNA 可以从一种生物个体转移到另一种生物个体。转换视角 22017全国卷，38(5)艾弗里等人的肺炎双球菌转化实验为证明 DNA 是遗传物质做出了重要贡献，也可以说是基因工程的先导，如果说他们的工作为基因工程理论的建立提供了启示，那么，这一启示是_。答案DNA 可以从一种生物个体转移到另一种生物个体教材原型3.(人教版选修三 P6“内文”)质粒载体作为基因工程的工具，应具备的基本条件有：能
36、自主复制；具有标记基因；具有一个或多个限制酶切位点。转换视角 32016全国卷，40(1)质粒载体作为基因工程的工具，应具备的基本条件有(答出两点即可)。答案能自我复制、具有标记基因教材原型4.(人教版选修三 P13“内文”)在基因工程中，常用 Ca2处理大肠杆菌，其目的是使之成为感受态细胞，容易吸收周围环境中的 DNA 分子，进而使重组质粒导入细菌细胞内(或提高受体细胞的转化率)。转换视角 42014海南卷，(4)下图是将某细菌的基因 A 导入大肠杆菌内，制备“工程菌”的示意图。据图回答：在基因工程中，常用 Ca2处理 D，其目的是_。答案使之成为感受态细胞，便于吸收周围环境中的重组 DNA
37、 分子教材原型5.(人教版选修三 P12“内文”)在培育有些转基因植物时，常用农杆菌转化法，农杆菌的作用是农杆菌可感染植物，将目的基因转移到受体细胞中。转换视角 52013全国卷，40(1)材料甲科学家将牛生长激素基因导入小鼠受精卵中，得到了体型巨大的“超级小鼠”；科学家采用农杆菌转化法培育出转基因烟草。回答下列问题：材料甲属于基因工程的范畴。将基因表达载体导入小鼠的受精卵中常用法。构建基因表达载体常用的工具酶有和。在培育转基因植物时，常用农杆菌转化法，农杆菌的作用是。答案显微注射限制酶DNA 连接酶农杆菌可感染植物，将目的基因转移到受体细胞中教材原型6.(人教版选修三 P13“内文第二自然段
38、”)由于原核生物具有一些其他生物没有的特点：繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少等，因此，早期的基因工程操作都用原核生物作为受体细胞，其中以大肠杆菌应用最为广泛。转换视角 62017全国卷，38(3)若要高效地获得蛋白 A，可选用大肠杆菌作为受体，因为与家蚕相比，大肠杆菌具有(答出两点即可)等优点。答案繁殖快、容易培养教材原型7.(人教版选修三 P5“内文第二自然段”)DNA 连接酶“分子缝合针”根据酶的来源不同，可以将 DNA 连接酶分为两类：一类是从大肠杆菌中分离得到的，称为 Ecoli DNA 连接酶；另一类是从 T4噬菌体中分离出来的，称为 T4DNA连接酶。这两类酶都是将双链 DNA
39、 片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键(图 14)，但这两种酶的作用有所差别：EcoliDNA连接酶只能将双链 DNA 片段互补的黏性末端之间连接起来，不能将双链 DNA 片段平末端之间进行连接。而 T4DNA 连接酶既可以“缝合”双链 DNA 片段互补的黏性末端，又可以“缝合”双链 DNA 片段的平末端，但连接平末端之间的效率比较低。转换视角 72016全国卷，40(3)DNA 连接酶是将两个 DNA 片段连接起来的酶，常见的有和，其 中 既 能 连 接 黏 性 末 端 又 能 连 接 平 末 端 的 是_。答案EcoliDNA 连接酶T4DNA 连接酶T4DNA
40、连接酶教材原型8.(人教版选修三 P26“内文第四自然段”)我们知道，天然蛋白质合成的过程是按照中心法则进行的：基因表达(转录和翻译)形成氨基酸序列的多肽链形成具有高级结构的蛋白质行使生物功能；而蛋白质工程却与之相反，它的基本途径是：从预期的蛋白质功能出发设计预期的蛋白质结构推测应有的氨基酸序列找到相对应的脱氧核苷酸序列(基因)(图 129)。转换视角 82015全国卷，40(3)蛋白质工程也被称为第二代基因工程，其基本途径是从预期蛋白质功能出发，通过_和，进而确定相对应的脱氧核苷酸序列，据此获得基因，再经表达、纯化获得蛋白质，之后还需要对合成蛋白质的生物进行鉴定。答案设计蛋白质的结构推测氨基
41、酸序列功能课后强化训练(时间：20 分钟)1.(2019四川绵阳一诊)基因工程的应用十分广泛，利用此项技术可创造出更加符合人类需求的优良品种或产品。如美洲拟鲽(是鲽科下的一种比目鱼)的体液中存在抗冻蛋白，能够降低鱼的血液冰点。科学家按cDNA 路线分离和克隆了抗冻蛋白基因，并将其导入番茄，获得了抗冻的番茄品种。根据有关知识，回答下列问题：(1)基因工程操作的核心步骤为，以 mRNA 为材料可获得 cDNA，其原理是_。(2)将目的基因导入植物的细胞最常用的方法是_。(3)构建重组质粒，需要限制性内切酶切取目的基因、切割质粒。限制性内切酶的识别序列和切点是CGATCC，限制性内切酶的识别序列和切
42、点是GATC。在质粒上有酶的一个切点，在目的基因的两侧各有1 个酶的切点。在 DNA 连接酶的作用下，上述两种不同限制酶切割后形成的黏性末端能否连接？理由是_。(4)质粒作为基因工程常用运载体必需具备的条件是_(至少答 2 点)。答案(1)基因表达载体的构建在逆转录酶的作用下，以 mRNA 为模板按照碱基互补配对的原则可以合成 cDNA(2)农杆菌转化法(3)可以因为由两种不同限制酶切割后形成的黏性末端相同(4)能在宿主细胞内复制并稳定保存；具有多个限制酶切位点，有利于剪切2.(2019四川广安眉山一诊)白僵菌可感染农业害虫，因而可用来防治农业害虫。由于白僵菌对草丁膦(一种除草剂)敏感，且杀死
43、害虫的能力较弱，科研人员将 Bar基因(抗除草剂基因)和毒蛋白基因导入白僵菌进行基因工程改造，流程如图所示：(1)从苏云金芽孢杆菌中获取的毒蛋白基因，通过 PCR 技术可以在体外大量扩增。该扩增过程需要提供种引物，所需添加的酶是。(2)图中形成重组质粒 1 时需要的限制酶是；形成重组质粒 2 除了需要限制酶 Xba外，还需要酶。(3)将重组质粒 2 导入经处理成为感受态的白僵菌，一段时间后用含有的平板培养基进行筛选，获得含有 Bar 基因的重组白僵菌。(4)为了判断重组白僵菌的杀虫效果，科研人员接下来应该。答案(1)两耐热的DNA聚合酶(2)Nco、BamHDNA连接(3)Ca2草丁膦(4)将
44、重组白僵菌喷涂在植物叶片上，再用此叶片饲喂害虫，记录单位时间内的害虫死亡的数3.(2019广东七校联考)真核生物基因中通常含有内含子，而原核生物基因中没有，原核生物没有真核生物所具有的切除内含子对应的 RNA 序列的机制。下图表示从基因文库提取胰岛素基因的过程。回答下列问题：(1)从基因结构分析，与基因组文库中的基因相比，cDNA 文库中获得的目的基因少了等结构(至少写两个)。(2)将获得的胰岛素基因导入受体菌内，并在受体菌内维持稳定和表达的过程，在基因工程中称为。(3)过程需将纤维素膜上的细菌裂解，释放出，再用32P 标记的作为探针进行杂交。依据杂交结果，应选取培养基上(填字母)菌落继续培养
45、，才能获得含有胰岛素基因的受体菌。(4)经过目的基因的检测和表达，从大肠杆菌中获得的“胰岛素”未能达到期待的生物活性，导致这种差异的原因可能是_。(5)与从基因组文库获取目的基因相比，图示方法获得的目的基因在受体菌中更容易表达，原因是_。答案(1)启动子、终止子、内含子(2)转化(3)DNA目的基因(或胰岛素基因)a(4)受体菌中没有内质网和高尔基体，不能对基因表达获得的蛋白质进行加工(5)cDNA 中不含有内含子，转录出的 RNA 不需要经过加工，可直接作为合成蛋白质的模板4.(2019山东聊城模拟)普通番茄细胞中含有 PG 基因，其能控制合成多聚半乳糖醛酸酶(简称 PG)，PG 能破坏细胞
46、壁，使番茄软化不耐贮藏。科学家将抗 PG 基因导入番茄细胞，培育出了抗软化、保鲜时间长的转基因番茄。下图表示抗 PG基因的作用原理，回答下列问题：(1)据图回答该转基因番茄具有抗软化、保鲜时间长的原理是_(2)为培育抗软化番茄，应采用技术将抗 PG 基因进行体外扩增。在该技术的反应体系中除模板、引物、原料外，还需要加入，这个基因的表达需要等不可缺少的调控组件。(3)将抗 PG 基因插入 Ti 质粒的上构建基因表达载体，通过农杆菌转化法将抗 PG 基因导入番茄细胞，为检验抗 PG 基因是否成功导入，在个体生物学水平上应检测_。(4)为避免抗 PG 基因通过花粉传播进入其他植物而导致“基因污染”，
47、应将抗 PG基因导入(填“细胞核”或“细胞质”)。答案(1)抗 PG 基因能阻止 PG 基因表达的翻译过程，使细胞不能合成 PG(2)PCR(多聚酶链式反应)热稳定 DNA 聚合酶(Taq酶)启动子、终止子(3)TDNA转基因番茄是否抗软化以及保鲜时间的长短(4)细胞质5.(2019四川遂宁一诊)我国一科研团队将小麦液泡膜 Na/K逆向转运蛋白基因(TaNHX2 基因)转移到水稻细胞内，获得了转基因耐盐水稻新品种。回答下列有关问题：(1)为保证目的基因在水稻细胞中能够表达，运载体上应含有特定的。A.复制原点B.启动子C.标记基因(2)水稻的转化过程为：将水稻幼胚接种到诱导培养基上，经过过程，培
48、养出愈伤组织，然后用法，将目的基因和相关功能片段整合到愈伤组织细胞的染色体 DNA 上，最后诱导愈伤组织形成水稻植株。(3)为验证外源基因整合到水稻基因组后是否转录，可从转基因植株的细胞中提取所有 mRNA 并反转录成，再以反转录产物为模板，利用 TaNHX2 基因特异引物，通过方法进行基因扩增。若以根细胞为材料扩增结果为阳性(有产物生成)，以叶细胞为材料扩增结果为阴性(无产物生成)，则说明_。(4)将生长至 4 叶期的转基因幼苗转入高浓度的 NaCl 溶液中培养，进行耐盐试验，用非转基因幼苗作为对照。培养 30 天后观察现象，若则说明转基因植株获得了耐盐特性。答案(1)B(2)脱分化农杆菌转
49、化法(3)cDNA(互补 DNA)PCR目的基因(TaNHX2 基因)仅在根细胞中转录，未在叶细胞中转录(4)转基因植株存活率高于非转基因植株(转基因植株叶片不变黄，非转基因植株叶片变黄，其他答案合理即可)6.(2019山东潍坊模拟)人参是珍贵的药用植物，研究人员运用转基因技术构建乙肝病毒表面抗原(HBsAg)的人参细胞表达系统，为珍贵药用植物与疫苗联合应用开辟了新思路，其构建过程如图所示，图中Sma、Sat、EcoR为限制酶。请回答相关问题：(1)的构建过程除限制酶外还需要酶；想要从中重新获得 HBsAg 基因，所用的限制酶不能是 EcoRV或 Sma，原因是_。(2)将重组质粒转入农杆菌常
50、用处理细胞；要使目的基因成功整合到人参细胞的染色体上，该过程所采用的质粒应含有。(3)分析图可知，中应含有的标记基因是_；过程的目的是_。(4)该疫苗进入机体后可刺激机体产生能与乙肝病毒特异性结合的，同时还能产生使机体长期对乙脏病毒具有免疫力。答案(1)DNA连接两平末端连接后的重组序列不能再被EcoR和Sma 识别(重组质粒无这种限制酶的识别序列)(2)钙离子TDNA(3)氨苄青霉素抗性基因筛选出含有 HBsAg 基因的人参细胞(4)抗体记忆细胞7.(2019广东模拟)烟草易受烟草花叶病毒(TMV)感染而大幅度减产。绞股蓝细胞中含有抗 TMV 基因，能抵抗 TMV 感染，研究人员利用转基因技