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1、精选优质文档-倾情为你奉上生物化学综合实验黄豆芽总DNA的提取及亲缘关系的研究姓名：逯玉东学号: 班级：生物学院食品10-2班实验时间： 2012.7.22012.7.3实验目的：1、 学会和掌握核酸制备的一些基本操作和方法，并通过分光光度法和电泳等实验技术研究核酸的性质；2、 学习用紫外分光光度计和水平琼脂糖凝胶电泳检测DNA的纯度、浓度的原理与方法。3、 掌握利用限制性内切酶酶切DNA的原理和方法,培养学生利用限制性内切酶位点图谱进行实验设计的能力；4、 学会通过琼脂糖凝胶电泳法分析不同材料之间DNA的亲缘关系。关键词：核酸制备，CTAB法，限制性内切酶，分光光度法，电泳Abstract：
2、1. The extraction of plant DNA.2. Determination of plant DNA purity and concentration.3. Plant DNA restriction endonuclease enzymatic.4. DNA agarose gel electrophoresis to separate DNA fragments.5. Studies on the relationships of plant DNA.Key words:Nucleic acid preparation, CTAB, Restriction endonu
3、clease, Spectrophotometry, Electrophoesis.一 黄豆芽DNA的提取1. 材料：正在生长的黄豆芽2.主要仪器和用具：高速冷冻离心机（16 000 r/min）; 恒温水溶； 紫外可见光分光光度计； 电泳仪及微型电泳槽； 电冰箱； 凝胶成像系统或手提式紫外检测仪； 微波炉； 电子天平； 纯水系统； 1.5 mL离心管及离心架； 微量移液管10 uL、200uL、1 000uL各1支及各量程吸头； 常用玻璃仪器及滴管等； 一次性塑料手套。3. 试剂（1）0.1 mol/LTris-HCl (pH8.0)缓冲液（0.607gTris碱溶于40ml灭菌双蒸水。用浓
4、盐酸（2.1ml）调节至PH至8.0，定容至50ml，高压灭菌）；（2）CTAB提取缓冲液：100 mM Tris-HCl(pH8.0) （0.607gTris碱溶于40ml灭菌双蒸水。用浓盐酸（2.1ml）调节至PH至8.0，定容至50ml，高压灭菌），20 mmol/L EDTA（0.3722gEDTA溶于40ml灭菌双蒸水。用NaOH调节至PH至8.0，定容至50ml，高压灭菌）,1.4 M/L NaCl(称取4.095gNacl于烧杯中，加10ml水溶解，再定容至50ml)，2%CTAB(使用前加入0.2%2%体积的-巯基乙醇（2gCTAB，8.18gNaCl,0.74gEDTA,加入
5、10ml1mol/L的Tris-Hcl（PH=8），0.2ml巯基乙醇，加水定容到100ml）；（3）Tris-HCl溶液饱和酚/氯仿/异戊醇（25:24:1，V/V/V）；（4）RNA酶A（DNase-free RNase A）；（5）70%乙醇；（6）预冷无水乙醇；（7）pH8.0 TE缓冲液或ddH2O：10 mmol/L Tris-HCl（0.607gTris碱溶于400ml灭菌双蒸水。用浓盐酸（21ml）调节至PH至8.0，定容至500ml，高压灭菌）,1 mmol/L EDTA,PH8.0（0.1816gEDTA溶于400ml灭菌双蒸水。用NaOH调节至PH至8.0，定容至500m
6、l，高压灭菌）;（8）琼脂糖；（9）5X TBE缓冲液(称取540gTris，275g硼酸，加入20ml 500mmol/l的EDTA，先加800ml重蒸水，加热溶解后，再加重蒸水定容至1000ml。)；（10）6X 上样缓冲液（在 50ml水中溶解0.25g溴酚蓝，加甘油30ml，加水定容至100ml。）；（11）1%溴化乙锭（EB）染色液（将100mg溴乙锭溶于蒸馏水或者电极缓冲液100ml，棕色瓶内封好，避光保存）。4、实验步骤 （1）准备干净研钵（中、小号）、研杵、药匙、无水乙醇、异丙醇，预先放进冰箱预冷，以减少液氮用量。 （2）取用黄豆芽两片子叶之间生长旺盛的芽尖，先后用自来水、蒸馏
7、水冲洗，用滤纸吸干水分，放进冰箱4摄氏度保存备用。（3）称取0.10.5g 芽尖，在液氮中研磨，目的是破碎植物细胞，释放其中内含物，低温可抑制核酸酶的活性。待液氮蒸发完后，迅速转入装有700 uL 预热过的（6065摄氏度）的CTBA 提取液的1.5mL 离心管中，轻轻混匀。（4）6065摄氏度水浴3060min ，每10min轻轻摇动混匀。（5）加等体积的氯仿/异戊醇（24:1， V/V），温和摇动，使成乳状液。（6）室温下（温度不低于15摄氏度），8000/min 离心15min，取上清液。根据需要，上清液可用氯仿/异戊醇反复抽提多次。（7）用大孔吸头小心抽提上清液逐滴加入预冷的2/3体积
8、的无水乙醇（或等体积的异丙醇），20摄氏度条件下放置30min 以上，5 000 r/min 低速离心 10 min(4摄氏度)，收集沉淀。如果不见沉淀，将溶液放入20摄氏度 30min 至过夜，再离心，或用更高速度10 00012 000 r/min 离心10min (4摄氏度),收集沉淀。（9）将收集到的沉淀移入另一新离心管中，加入12mL 70% 乙醇冲洗液，轻摇几分钟，4摄氏度下10 000r/min 离心 5min ,收集沉淀。重复12次。（10）打打开管盖，放洁净场所晾干。5、注意事项:（1）使用的研钵最好预先冷处理，勿使研钵的植物样品融化。（2）抽提过程温度不宜低于15摄氏度，以
9、免CTAB沉淀而损失DNA。（3）用氯仿/异戊醇抽提时，摇晃一定要轻，否则容易使DNA 断裂，使用的吸头最好要口径大的或剪掉吸头尖。此外，应避免重复冻融步骤。（4）提取的DNA不宜过分干燥，当乳白色的DNA沉淀变成透明胶状即可。二、 植物DNA纯度、浓度的测定1、 材料：提取的DNA溶液2、主要仪器及用具紫外分光光度计； 微波炉或电炉； 稳压电泳仪及水平式电泳槽； 凝胶成像系统或手提式紫外检测仪； 电冰箱； 电子天平； 微量移液器 10uL、200uL、1 000uL各1支吸头； 三角瓶； 离心管； 常用玻璃仪器及滴管等； 石蜡膜； 一次性塑料手套。3.实验步骤（一） 紫外分光光度计测定DNA
10、纯度和浓度（1） 预热紫外分光光度计1020min。（2） 取1支石英比色杯，装入TE溶液，作为空白，用于校正分光光度计。（DNA纯度及浓度测定）（3） 取5uL DNA待测样品加入另1支比色皿中，加TE溶液定容至3mL,用无菌石蜡膜堵住杯口，倒转混匀。（4） 将2只比色杯置分光光度计中，先调入射波长，然后分别用空白溶液调整零点（T为100，OD为0），测定260nm、280nm、230nm待测样品液的OD值。4.结果与分析计算浓度：对于双链DNA来说，OD260=1.0时，其浓度为50ug/mL，故DNA样品浓度（ug/uL）=OD260 x N(样品稀释倍数) x 50/1 000。 测定
11、纯度：据经验值其OD260/OD280=1.82.0, OD260/OD2802.0,以判断DNA纯度。OD260/OD2802.0，表明有RNA污染；OD260/OD2801.8时，表明由蛋白质或酚污染；OD260/OD2302.0时表明溶液中有残存的盐和小分子杂质。在电泳过程中可随时用手提式紫外检测仪直接观察DNA的电泳情况。电泳时间视实验的具体要求而定。待DNA各条区带分开后，停止电泳，一般需2h。取电泳凝胶直接拍照或绘图。DNA样品浓度估测：比较被测DNA样品条带与标准DNA样品条带的荧光强度，DNA量相同时所产生荧光强度相同。5.注意事项（1） 设计标准DNA含量梯度时要合理，便于肉
12、眼分辨。（2） 琼脂糖电泳注意事项（参见用DNA琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段）。三DNA的限制性内切酶酶解1.主要仪器：微量移液器，离心机，水浴锅2试剂1）限制性内切酶EcoR I，HindIII2） 限制酶缓冲液：1 x M（0.1mol/LTris-Hcl（pH7.5）3.实验步骤：按限制性内切酶试剂盒用量说明，加入DNA、酶等试剂，充分混匀并在37消化36小时。加入上样缓冲液，用1%琼脂糖凝胶电泳，检测酶切结果，以未酶切DNA作为参照。进行多个酶切反应，仅DNA样品不同，建议配制反应混合液后分装。4、结果与分析将得到的DNA片段进行电泳。5.注意事项w 内切酶不应混有其它杂蛋白特别是其它
13、内切酶或外切酶的污染；w 注意内切酶的识别位点及形成的粘性末端；w 内切酶体积不能超过反应体系10，因内切酶中含50甘油，体系中甘油超过5会抑制内切酶活力；w 内切酶操作应在低温下进行（冰上）；使用时防止操作中对内切酶的污染。四DNA琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段1.实验材料：植物基因组DNA分子。2主要仪器及用具:（1）Eppendorf离心管（1.5ml，预先高温高压灭毒，3个）及其离心管架，（2）电泳槽（1个），电泳仪（1个），凝胶塑料托盘（1个），样品槽模板（1个）（3），一次性塑料手套(64只)（4）微量注射器（2L3，15L或20L1）（5）锥形瓶（100ml1，烘干）（6）胶头滴管
14、（3）（7）小烧杯（50，100，250ml）（8）洗瓶2个（分别盛重蒸水和蒸馏水）（9）大烧杯1个（10）量筒（50ml1）（11）紫外反射投射仪3.试剂:（1）电泳缓冲液: 5TBE pH8.0使用前用蒸馏水稀释10倍(浓度为05TBE) 配制:称取540gTris，275g硼酸，加入20ml 500mmol/l的EDTA，先加800ml重蒸水，加热溶解后，再加重蒸水定容至1000ml。（2）1mg/ml溴化乙锭溶液 (EB) 配制:带手套谨慎称取1mg溴化乙锭，溶于1ml重蒸水中，置4冰箱备用。(EB是DNA的诱变剂，亦是强致癌屋，操作时应小心!)（3）琼脂糖:视实验要求制不同浓度的胶，
15、用05TBE作溶剂配制。（4）酶终止反应液（100.1mol/L EDTA, 20% Ficoll, 0.25% 溴酚蓝）（5）溴酚蓝指示剂溶液4.实验步骤：（一） 1.0%琼脂糖凝胶板的制备1） 用配套挡板将凝胶塑料托盘短边缺口封住，置水平玻板或水平工作台面上，将样品槽模板（梳子）插进托盘长边上的凹槽内（距一端约1.5cm），梳齿底边与托盘表面保持0.51mm的间隙，安置好后保持静置状态。2） 称取0.3克琼脂糖置于小锥形瓶中，加入30mlTBE稀释缓冲液，在电炉上（或微波炉中）加热融化，轻轻摇匀，避免产生泡沫。3） 待琼脂糖冷却至放在手背不觉太烫手（约60）后，滴一滴EB，然后将琼脂糖溶液
16、在靠近挡板一侧连续地倒入托盘内（注意中间不要间断），使凝胶缓慢而连续地展开直至在托盘表面形成一层约3mm厚均匀胶层（7.19.0cm）。胶内不要存有气泡，室温下静置约20分钟。4) 待凝固完全后，用小滴管在梳齿附近加入少量TBE稀释液润湿凝胶，双手均匀用力轻轻拔出样品槽模板（注意勿使样品槽破裂），则在胶板上形成相互隔开的样品槽。5) 取下封边的挡板，将凝胶连同托盘放入电泳槽平台上，倒入大量TBE稀释缓冲液直至浸没过凝胶面23mm，要防止样品槽内窝存气泡，可以用微量注射器挑除。 （二）、加样用微量注射器或移液枪将经酶切的样品液和未经酶切的样品（要加2L的酶反应终止液）分别加入到胶板的不同加样槽内
17、，每个槽（522.5mm）容积约为25L，因此加样量不要超过20L，避免因样品过多而溢出，污染邻近样品。加样时，注射器针头穿过缓冲液小心靠近加样槽底部，但不要损坏凝胶槽，然后缓慢地将样品推进槽内，让其集中沉于槽底部。加完一个样品后的微量注射器应反复洗净后才能用以加下一个样品。（三）、电泳加样完毕，将靠近样品槽一端连接负极，另一端连接正极（千万不要搞错），接通电源，开始电泳。在样品进胶前可用略高电压，防止样品扩散，样品进胶后，应控制电压降不高于80V。当染料带移动到距离凝胶前沿约1cm时，停止电泳。（四）、观察小心地取出凝胶置托盘上，将胶板推至预先浸湿并铺在紫外灯观察台上的玻璃纸内，在波长245
18、nm紫外灯下进行观察，DNA存在的位置呈现橘红色荧光。5.结果与分析根据图谱分析不同材料的亲缘关系。6.注意事项(1)要根据被分离的样品的大小范围选择不同浓度的琼脂糖凝胶。（2）溴乙锭（EB）是诱变剂，配制和使用时应带乳胶手套，并且不要将该溶液洒在桌面或地面上。凡是沾污过EB的器皿或物品，必须经过专门处理后，才能进行清洗或弃去。(3)加样量的多少取决于加样槽最大容积。可以采用大小不同的样品槽模板以形成容积不同的加样槽，加入样品的体积应略小于加样槽容积，为此，对于较稀的样品液应设法调整其浓度或加以浓缩。五实验数据及处理在DNA纯度与浓度的测定结果：OD230=0.137，OD260=0.180，
19、OD280=0.102，进而可以算出，OD260OD280=1.7651.8，OD260OD230=1.3142.0。DNA含量(uguL)OD2600.02稀释倍数= 0.1800.02100=900 uguL= 0.9ugml。六实验总结与分析1、讨论（1）、制备的DNA在具备哪些条件的溶液中比较稳定？制备的DNA 在：（1）含有螯和剂如EDTA 中较稳定，因为EDTA 能螯和Mg2+或Mn2+离子，抑制脱氧核糖核酸酶，因此在配制提取缓冲液和TE缓冲液的时候加入了EDTA的钠盐以维持DNA的稳定；（2）在pH59 之间较稳定，否则过酸过碱会破坏DNA 的结构，所以无论是提取缓冲液还是TE溶
20、液，都最终调PH至PH约等于8；（3）有一定离子强度（强度越高, DNA 越稳定）的溶液中较稳定，TE 满足以上要求, 但如需对所得DNA 进行酶切, EDTA 浓度不可过高, 一般用0.1TE 或0.2TE，在实验时我们用的是稀释十倍的TE溶液来增强DNA结构的稳定性。 (2)、为了防止DNA降解，提取过程中应注意什么？在提取的过程中应注意以下几点：（1）整个提取过程应在较低温度下进行（一般利用液氮或冰浴）；这样可防止和抑制内源脱氧核糖核酸酶对DNA 的降解；（2）当DNA 处于溶解状态时，要尽量减弱溶液的涡旋，动作要轻柔；（3）在进行DNA 溶液转移时用大口（或剪口）吸管，尽量减少对溶液中
21、DNA 的机械剪切破坏。（3）、为什么选择波长为260nm、280nm、230nm的OD值来确定待测样品纯度？除了DNA浓度，分光光度计同时显示几个非常重要的比值表示样品的纯度，如 A 260 / A 280的比值，用于评估样品的纯度，因为蛋白的吸收峰是 280 nm。纯净的样品，比值大于 1.8。如果比值低于 1.8 或者2.0，表示存在蛋白质或者酚类物质的影响。A 230表示样品中存在一些污染物，如碳水化合物，多肽，苯酚等，较纯净的核酸 A 260 / A 230 的比值大于 2.0。（4）、干扰核酸纯度的物质有哪些？ 干扰核酸纯度的主要物质有杂蛋白质、多糖、多酚、色素以及极少量的RNA等
22、。（5）、在整个酶切反应过程中应注意哪些问题？在酶切反应过程中应注意：（1）不应混有其它杂蛋白特别是其它内切酶或外切酶的污染；（2）注意内切酶的识别位点及形成的粘性末端；（3）内切酶的用量 根据内切酶单位和用量而定，通常 1u指在适当条件下，1小时内完全酶解ug特定底物所需要的限制性内切酶量，使用中一般以ug DNA对u酶短时间为宜;(4)同时内切酶体积不能超过反应体系，因内切酶中含甘油，体系中甘油超过会抑制内切酶活力；(5)使用时防止操作中对内切酶的污染.（6）如何选择和限制性内切酶的用量？我们实验的时候用的是DNA提取液 1ul，水16ul，buffer 2ul，buffer EcoR1
23、1ul。但实验的效果不理想，在后来的电泳中，未能发现被切割的DNA短链，所以在第二次切割的时候我们用DNA提取液代替了水,酶切效果有一定的改善。 2、实验过程出现的问题以及原因和解决方法（1） 在首次提取DNA的时候，絮状物或者沉淀提取量特别少； 主要原因：第一，可能是取材料是我们取的只有芽尖部位，子叶大部分都被除去了，所以提取物中所含的蛋白质和杂质本来就少；第二，在用液氮进行研磨的时候，研磨的不够充分，以至于在用提取液提取DNA的时候，无法把原料中的DNA充分提取出来；第三，是在离心获得DNA的时候用的清液较少，从而直接导致后面分离的DNA的量较少。提取出的DNA量少的原因还可能是叶子量太大
24、，而CTAB量少导致得到的液体粘稠无法混匀细胞破裂不完全，DNA少。 解决方法：保留第一次提取的少量沉淀继续后面的实验，同时，再重新提取一次，在第二次提取DNA的时候我们进行了更充分的研磨，并且将得到的清液全部用于DNA的提取，而且适当增加了CTAB的量，最后发现，第一次提取少量的沉淀和后面第二次重新提取做出来的效果都比较明显，相比较后一组稍微好一点，说明以上三点都是导致絮状物少的原因。（2） 在DNA纯度与浓度的测定中，OD230=0.137，OD260=0.180，OD280=0.102，进而可以算出，OD260OD280=1.7651.8，OD260OD230=1.3142.0。 原因是
25、提取的DNA不纯，OD260OD280的值小于1.8表明DNA由蛋白质或酚污染；OD260OD230小于远远小于2.0，表明溶液里含有较多残留的盐和小分子杂质。如果不进行纯化，将对后面的实验结果产生严重影响。 解决方法：在提取的DNA中加入少量的蛋白酶K保温，进一步抽取纯化，然后接着用70乙醇洗两次，这样得到的DNA将是比较纯的。（3） 在最后的电泳中，未得到条带而出现拖尾是因为DNA降解了，那些拖尾实际上就是断裂的DNA碎片，而未出现条带主要是因为DNA的酶切没有成功。（如下图） （4） 一方面原因纯度差或残留酶切抑制物最为常见，杂蛋白存在会影响酶切，表现为A260/A280低于1.8；抑制
26、物常见多糖、酚、盐、乙醇等。另一方面可能是因为由于只取得DNA的量较少，再加上实验过程中DNA的裂解，到电泳的时候，溶液中已基本上没有DNA了，以至于最后无法得到预期的实验结果。 解决方法是重新提取DNA，尽量增加DNA的含量，并且在实验过程中避免剧烈摇晃DNA溶液，减少DNA的裂解，另一个重要的步骤是要对提取的DNA进行纯化，降低杂蛋白质、多糖、酚等对酶切结果的影响。3、 个人心得（1） 做过这么多的实验，我们应该都清楚实验前的预习非常重要，实验前我们应该认真分析每一个实验步骤，了解每一个用到的仪器和试剂的作用，一个实验的进度的快慢很大一部分取决于实验前的准备工作的是否充分，好多人实验前不预
27、习，到开始做实验时不知道从何下手，不知道试剂和仪器的作用，大大延迟了实验进程，或者只能看着其他同学的作法，按部就班，做完整个实验，没有任何收获。（2） 实验时必须注重每一个实验步骤的操作要求，以及每一种实验仪器的操作要领，严格按照要求操作；一方面，生化试验室里面的试剂比较危险，好多含有剧毒，还有对实验仪器的操作比较高，例如离心机的使用严格要求对角重量相同，离心之前必须用天平使之达标，否则可能会发生爆炸之类的实验时事故。另一方面，每一个步骤都有可能影响实验的各项数据和最终结果，决定着实验的成功与否。实验时要时刻观察和记录实验现象和数据，仔细思考产生各种实验现象的原因，分析其中的原因。有些同学实验
28、自始至终都不记录现象和数据，也不进行各项操作，只是看着其他同学做，走马观花看一遍，自认为自己懂了，会操作了，但实际上一无所知。这样的实验方式是完全不可取的，失去了掌握实验技巧的机会，浪费了时间和金钱。（3） 试验后的数据处理也很关键，通过数据的分析，你就会知道自己这次试验是否成功，成功在那个地方；如果失败，从数据的分析中也能够找到失败的原因，进而改进自己的实验方案，为以后的实验积累了经验。试验后数据的分析还是对实验过程以及操作要领和实验原理的巩固与加强，能帮助我们很好的理解实验，掌握实验，进而达到做实验应有的效果，这种通过自己动手学到的东西会使我们记得更加牢固。（4）我们还应该整理一下我们从实
29、验的过程中学到了什么，比如：我们为什么研磨植物组织的时候要用液氮？在CTAB提取缓冲液使用时加1ml的巯基乙醇有什么作用？我们在提取的DNA青叶中加入氯仿等有机溶剂有什么作用？通过询问老师以及查资料我们就会知道：在液氮中研磨，材料易于破碎，并减少研磨过程中各种酶类的作用。在抽提缓冲液中需加入抗氧化剂或强还原剂(如巯基乙醇)以降低这些酶类的活性。十六烷基三甲基溴化铵(hexadyltrimethyl ammomum bromide，简称为CTAB)、十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate，简称SDS)等离子型表面活性剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使DNA得以
30、游离出来。再加入苯酚和氯仿等有机溶剂，能使蛋白质变性，并使抽提液分相，因核酸(DNA、RNA)水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。上清液中加入无水乙醇使DNA沉淀，沉淀DNA溶于TE溶液中，即得植物总DNA溶液。 以上就是我对本次试验的讨论与分析，生化综合实验是对生物化学书本知识的巩固，也是对动手能力和实验技能的锻炼，而且还可以增添我们对此学科的兴趣，所以我们应该认真对待这次珍贵的机会，认真总结，从而获得更大的收获。七参考文献生物化学实验，中国科学技术大学出版社生物实验技术指导钟鸿 马慧著 中国农业大学出版社高级生物化学实验教程王重庆 李云兰 李德昌著 北京大学出版社植物生物技术和作物改良孙敬兰 陈维伦著 中国科学技术出版社现代分子生物学实验技术卢圣栋著 高等教育出版社生物化学与分子生物学实验技术，杨安钢等编，高等教育出版社生物化学实验原理和方法，李建武等编，北京大学出版社 专心-专注-专业