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1、生物检测技术（第二版）第四章电子课件【知识目标】掌握病原微生物检测的特点及其检测影响因素。熟悉病原微生物检测实验室的设施与设备要求。掌握检测标本的制作技术。熟悉显微镜检测技术。掌握病原体的染色技术。【能力目标】掌握常见的病原体分离培养与接种技术。掌握常见致病性细菌的培养和鉴定方法。掌握常见致病性真菌的培养和鉴定方法。第一节 病原学检测技术的应用与发展 病原学检测技术主要是微生物学检测技术，现在已经广泛应用于食品、饲料、环境、医药、化妆品等行业。病原学检测根据检测要求可以分为定性和定量病原学检测以及快速简单检测和全面系统的检测；根据检测地点和使用的仪器情况可以分为现场和实验室病原学检测。用于病原
2、学检测的方法较多，最常用的方法主要有病原学检测标本制作技术、病原体分离培养技术、培养物鉴定技术和显微镜检技术等。随着现在科学技术的不断进步，生物检测技术已经与工业和电子智能化科技很好地结合起来，很多种病原学生物检测纸片、卡片，甚至各种形式的微生物检测仪器都已经面市，很多仪器将采样、检测和结果显示实现了一体化和智能化。而且这些纸片、卡片以及各种形式的微生物检测仪器的特异性和灵敏度都已经达到了行业要求。第二节病原微生物学检测的特点和影响因素 一、病原微生物学检测对象的特点 不同检测对象测定结果会显著不同，其检查对象具有以下特点：活体易变性 分布不匀性 部分微生物处于受损坏状态 生态环境多样复杂 二
3、、病原微生物学检测的特点 检测对象的未知性 检测对象的不确定性 检测对象分布的不均匀性 特殊性 影响因素的多样性（）样品正式检验前必须保持原污染状态。防止第二次污染和防止污染微生物的繁殖或死亡。（）应有适当的供试液制备方法。供试液的正确制备是保证检验结果准确可靠的前提。（）检验方法准确可靠。（）检验结果判断无误。三、微生物学检测的影响因素 在样品微生物学检验中，不管是微生物限度检查、无菌检查还是其他方面检查，检测结果受多种因素影响，其中菌种制备、培养基、灭菌方法、抑菌的因素等备受关注。在检测实践中，以下几种因素均可对微生物学检测产生影响：（）样品本身有无抑菌性。（）培养基的促菌生长能力。（）培
4、养条件（温度、湿度及需氧或厌氧）。（）消毒或灭菌方法。（）过滤系统（滤器、滤膜性质、材质）性能。（）检验方法的正确与否。（）一些必要的标准菌种制备与传代、种类及生长状态是否符合规范。同时应注意影响结果的两个方面：一是培养基本身的性质；二是培养条件。通俗来说，培养基应具备广谱性，即有助于检品中所存活微生物的生长，因此要通过培养基灵敏度验证试验。另外，应注意采用最佳培养条件，以确保微生物充分生长并使计数结果呈良好的重现性。第三节病原微生物学检测实验室设施与设备要求 一、病原微生物学检测实验室设施要求 根据各种行业自身的法规规定，为保证、满足微生物检测和进行实验的要求，微生物检测实验室总体上要首先具
5、备有以下功能：能开展无菌检查，微生物限度检查和无菌采样各自严格分开的无菌室或者隔离系统；能开展菌种处理与微生物检测鉴别的无菌洁净室；能开展微生物检定或能进行细菌内毒素检查（凝胶法或定量法）、抗菌作用测定的各自分开的半无菌实验室；能进行微生物生长培养的培养室；可以进行配制试液及培养基的配制室；能进行高压灭菌的灭菌室；实验器皿洗涤、烘干室；人员办公休息室；大型实验室还可设有实验用品、易耗品储藏室；还要对这些设施与设备实施进行有效的监控与验证，以保证整个微生物检测实验室的布置要符合规范要求，并应有合理的通风设施，按照各房间的使用要求配置适当的空气净化系统，以提高实验室的总体质量。（一）洁净室（无菌室
6、）洁净室（无菌室）要符合规范要求 建立使用登记制度 建立使用标准操作规范（）并严格管理（）规定净化系统使运转前的时间要求（）物品进入洁净室（无菌室）基本要求（）人员进入洁净室（无菌室）要求（）温湿度观察要求（）沉降菌落计数与浮游菌测定要求（）消毒要求（）其他要求 洁净度检查的要求与方法（）沉降菌检测方法及标准（）浮游菌检测方法及标准 定期进行洁净度再检验 定期更换新的紫外灯管，更换净化系统的初效、中效、高效头 使用过程中应尽可能减少人员的走动或活动 洁净度不符合规定时立即停止使用 对进入的外来人员或维修人员进行指导和监督 洁净室（无菌室）的日常管理（二）培养室、试液及培养基的配制室或灭菌室、器
7、皿洗涤、烘干室、实验室、办公休息室 二、微生物学检测实验室设备要求 仪器设备的管理原则微生物检测实验室在购买新的设备仪器后，首先要对该设备或仪器进行安装确认，基本程序是：开箱验收、安装、运行性能确认程序。安装确认的主要内容如下：要登记仪器名称、型号，生产厂商名称、生产厂商的编号，生产日期，公司内部的固定资产设备登记及安装地点。收集汇编和翻译仪器使用说明书和维护保养手册。检查并记录所验收的仪器是否符合厂方规定的规格标准。检查并确保有该仪器的使用说明书、维修保养手册和备件清单。检查安装是否恰当，气、电及管路连接是否符合要求。制定使用规程和维修保养制度，建立使用日记和维修记录。制定清洗规程。明确仪器
8、设备技术资料（图、手册、备件清单、各种指南及该设备有关的其他文件）的专管人员及存放地点。一般来说，验证时，至少要有连续次的重复性试验结果支持说明该台设备通过验证，并且能被官方（如美国、中国等）认可。完成这些工作后，要按以上相关法规的规定，对仪器设备的管理应做到以下要求：（）备有仪器设备的清单（）仪器设备贴有明显标识（）建立仪器设备的标准操作规程（）建立使用登记、维修、保养记录 实验室设备的管理要求（）无需校验的设备（）需校验的设备种类 天平 计 分光光度计 层流净化工作台 无菌隔离系统 微孔滤膜孔径测定仪（）安装后性能确认并且需要连续监控的设备 在投入使用前，要对设备（或设施）的性能进行检验对
9、没有自动监控系统，进行小控制室内的温度状态观测 定期用中性的清洁剂或消毒剂清洗（）需要验证和持续监控的设备 所有的灭菌验证或除热原验证的工艺记录均应妥善保存。记录应能清楚地反映出主要的工艺参数，如温度、时间、压力等。由热敏纸打印的记录要及时复印并存档。每台灭菌或除热原设备均应配备使用日志，记录至少要包括：运行参数（温度和时间）、程序结束时间、运行状况及使用者的签名等。实验室有必要对被灭菌物品或除热原物品的有效期予以确认。三、超净工作台及生物安全柜的使用指南 监控规程 使用指南 级生物安全柜：至少装置一个高效空气过滤器对排气进行净化，工作时柜正面玻璃推拉窗打开一半，上部为观察窗，下部为操作窗口。
10、外部空气由操作窗吸进，而不可能由操作窗口逸出。工作状态时保证工作人员不受侵害，但不保证实验对象不受污染。级生物安全柜：至少装置一个高效空气过滤器对排气进行净化，工作空间为经高效过滤器净化的无涡流的单项流空气。工作时柜正面玻璃推拉窗打开一半，上部为观察窗，下部为操作窗。外部空气由操作窗吸进，而不可能由操作窗口逸出。工作状态下遵守操作规程时既保证工作人员不受侵害，又保证实验对象不受污染。级生物安全柜：至少装置一个高效空气过滤器对排气进行净化，工作空间为经高效过滤器净化的无涡流的单向流空气。正面上部为观察窗，下部为手套箱式操作口。箱内对外界保持负压，可确保人体与柜内物品完全隔绝。第四节病原体分离培养
11、与接种技术 一、消毒与灭菌技术（一）物理消毒与灭菌方法 热力灭菌 紫外线灭菌 电离辐射灭菌 过滤阻留灭菌 微波灭菌 强光脉冲波灭菌 等离子体灭菌（二）化学消毒与灭菌方法 液体消毒剂杀菌 气体消毒剂杀菌 玻璃器皿及金属器材的清洗和消毒 二、培养基的制备技术 肉膏汤培养基（）成分牛肉膏、蛋白胨10、氯化钠5、蒸馏水100。（）制法将上述各成分混入蒸馏水中，用玻璃棒搅拌使溶解，必要时可稍加热，促其溶解。调至，煮沸，补足失去水量，以滤纸过滤。分装后，高压蒸汽灭菌。也可购买市售营养血液增菌液培养基，按说明配制，高压灭菌后即成。（）用途供一般细菌增菌培养用，亦可作为无糖基础液。营养琼脂培养基（）材料液体培
12、养基、琼脂、洁净试管或无菌培养皿。（）制法于100 的液体培养基内加入琼脂粉，加热溶化，调至.4.6，分装后，高压蒸汽121 灭菌20。（）用途供一般细菌培养用，亦可作为无糖基础培养基。固体培养基（）成分液体培养基、琼脂。（）制法于液体培养基内加入琼脂，加热溶化，脱脂棉过滤。分装小试管（约高度），塞好棉塞，高压蒸汽灭菌，直立冷凝即成。（）用途保存一般菌种用，并可观察细菌的动力。血琼脂和巧克力色琼脂培养基（）成分营养琼脂、新鲜脱纤维羊血。（）制法将营养琼脂加热融化，待冷至左右，以无菌手续加入脱纤维羊血（临用前水浴箱预温），轻轻摇匀（勿有气泡），倾注无菌平皿内即成血琼脂平皿。（）用途咽拭子培养、化
13、脓性球菌及一般标本的分离培养。伊红美蓝琼脂培养基（简称）（）成分肉膏汤琼脂、乳糖、无菌伊红水溶液、无菌美蓝水溶液。（）制法将乳糖加至肉膏汤琼脂中，灭菌。待冷至约，加入伊红及美蓝溶液，混匀倾注平皿，冷凝后备用。实验室一般多使用商品化的干燥培养基，按说明配制。（）用途分离肠道致病菌用。SS 琼脂培养基（）成分肉膏汤琼脂、乳糖、胆盐、柠檬酸钠、硫代硫酸钠、柠檬酸铁水溶液、中性红水溶液、煌绿水溶液。（）制法将肉膏汤琼脂溶于水中，加热溶解，再加入乳糖、胆盐、柠檬酸钠、硫代硫酸钠、柠檬酸铁，以微火加热，使其全部溶解。调至。以纱布过滤，并补足失去水分，继续煮沸，加入中性红水溶液及煌绿水溶液。混匀后倾注平皿，
14、冷凝后备用。（）用途培养分离沙门菌和志贺菌。康凯琼脂及山梨醇麦康凯琼脂（）成分乳糖、蛋白胨、氯化钠、胆盐（或牛胆酸钠与去氧胆酸钠）、中性红水溶液、琼脂、蒸馏水。（）制法将蛋白胨、氯化钠、胆盐溶于水中，加热溶解，将琼脂加入余下的水中加热溶解。将上述液趁热混合，调至，用纱布过滤，按需要分装，灭菌。待冷至约时按每培养基中加入乳糖及无菌的中性红水溶液，混匀后倾注平皿，冷凝后备用。（）用途培养分离肠道杆菌。铁质双糖琼脂培养基（）成分蛋白胨、氯化钠、葡萄糖，乳糖、柠檬酸铁铵、硫代硫酸钠、琼脂、酚红、蒸馏水。（）制法除糖和酚外，其他成分混合于水中加热溶解，调至.4.6，再加入糖类和指示剂混匀。过滤后以每管分
15、装于 试管中。一般实验室多使用商品的干燥培养基配制。（）用途鉴别肠道杆菌用。胆盐肉汤培养基（）成分牛肉膏、氯化钠、蛋白胨、胆盐、硫酸铝钾、蒸馏水、葡萄糖、柠檬酸钠。（）制法除葡萄糖和柠檬酸钠外，将其余成分均加入蒸馏水中，加热溶解，调至，灭菌。再加入葡萄糖和柠檬酸钠混匀，溶解后分装于 的试管，每管高，灭菌。（）用途用于血液增菌培养伤寒沙门菌和副伤寒沙门菌。硒酸盐（）培养基（）成分蛋白胨、乳糖、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、亚硒酸钠、蒸馏水。（）制法将亚硒酸钠溶于蒸馏水中，作为液；将其余成分溶于蒸馏水中作为液。取液份，液份混匀，调至，分装，每管，灭菌。保存备用。（）用途用于沙门菌及某些志贺菌的粪便标本增
16、菌培养。硫磺酸盐（）增菌液（）成分多胨或盶蛋白胨、胆盐、碳酸钙、硫代硫酸钠、蒸馏水。（）制法将上述成分混于蒸馏水中，加热溶解，分装试管，每管。因碳酸钙不易溶解，分装时需不时摇动。灭菌，临用前，每管加入碘液（碘、碘化钾，溶于蒸馏水中，储存于棕色瓶中备用）混合后接种标本。也可按每增菌液中加入碘，以防止变形杆菌的过度生长。（）用途用于沙门菌的增菌培养。发酵培养基（）成分蛋白胨水或肉膏汤（）、糖类（乳糖、葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、甘露醇、甘露糖、阿拉伯糖、鼠李糖、山梨醇、肌醇、卫矛糖、木糖、菊糖、水杨苷、侧金盏花醇，或醇苷类物质）、溴甲酚紫乙醇溶液.1。（）制法将糖加入蛋白胨水中，加热溶解后再加入溴甲酚紫
17、乙醇溶液混匀。分装于 试管内，每管，管内装有倒置的发酵小管。灭菌后备用。于棉塞上涂上颜色，作为标记，如，葡萄糖红色；乳糖黄色；麦芽糖蓝色；甘露醇白色；蔗糖黑色。（）用途观察细菌对糖、醇或苷类发酵能力，用于鉴定细菌。蛋白胨水（）成分蛋白胨（或胰蛋白胨）、氯化钠、水。（）制法将上述成分混合于蒸馏水中加热溶解，校正至。分装于 试管内，每管。灭菌后备用。（）用途供作靛基质（吲哚）试验用。葡萄糖磷酸盐蛋白胨水（）成分蛋白胨、葡萄糖、磷酸氢二钾、蒸馏水。（）制法将上述成分混于蒸馏水中，加热溶解后调至，以滤纸过滤。分装于 试管中，每管约。灭菌后备用。（）用途供试验、甲基红试验用。柠檬酸盐琼脂斜面培养基（）成
18、分磷酸二氢铵0.1、硫酸镁0.02、磷酸氢二钾0.1、柠檬酸三钠（）0.2、氯化钠.5、.5 溴麝香草酚蓝乙醇溶液、蒸馏水、琼脂。（）制法将上述成分加入蒸馏水中，加热溶化。调至6.8，再加入指示剂摇匀。分装 试管中，灭菌，取出后趁热制成斜面。（）用途作柠檬酸盐利用试验。尿素培养基（）成分蛋白胨、葡萄糖、氯化钠、磷酸二氢钾、.4 酚红液、尿素液、蒸馏水。（）制法除指示剂和尿素外，将其余成分混于蒸馏水中加热溶解，调至，再加入指示剂混匀过滤，分装，每三角烧瓶，灭菌。以无菌操作每瓶加入已过滤除菌的尿素液，混匀后分装于 的试管内，约.5 支，培养，证明无菌存放备用。（）用途供尿素分解试验用。变形杆菌为阳
19、性，沙门菌属和致贺菌属细菌为阴性。硫化氢试验培养基（）成分蒸馏水、氯化钠0.5、蛋白胨、琼脂1.2、硫代硫酸钠0.02、硫酸亚铁0.02、牛肉膏0.5、葡萄糖0.1、乳糖、蔗糖、酚红0.25。（）制法除糖、酚红外，其他成分混合于水中加热溶解，调至.4.6，再加入糖类和酚红混匀，过滤分装，每管约，灭菌，取出趁热立即斜置，冷凝即成。（）用途供肠道杆菌鉴别用。18 单核细胞增生李斯特菌培养基（）增菌液取胰胨、多价胨、酵母膏、氯化钠、磷酸二氢钾2.5、葡萄糖2.5、蒸馏水，调7.2 7.4，高压灭菌，使用前加吖啶黄溶液，萘啶酮酸溶液和放线菌酮，此三种成分要过滤除菌或无菌配制。（）李氏增菌肉汤取胰胨、多
20、价胨、酵母膏、氯化钠、磷酸二氢钾.35、磷酸氢二钠、七叶苷、蒸馏水混合，调7.2 7.4，高压灭菌备用。李氏液（）中加入萘啶酮酸0.45（用0.05 氢氧化钠溶液配制），吖啶黄0.2（用灭菌蒸馏水配制）；李氏液（）中加入萘啶酮酸0.40，吖啶黄0.50。无菌分装于大试管中。（）胰酪胨大豆琼脂 取胰胨、多价胨、酵母膏、氯化钠、磷酸二氢钾.、葡萄糖.、琼脂、蒸馏水 溶解后，调.，高压灭菌 备用。（）硫酸铁铵半固体琼脂 取胰胨、多价胨、硫酸铁胺.、硫代硫酸钠.、琼脂.、蒸馏水 溶解后，调.，高压灭菌 备用。（）改良的 琼脂 取胰胨、多价胨、牛肉膏、葡萄糖、氯化钠、磷酸氢二钠、苯乙醇.、无水甘氨酸、氯
21、化锂.、琼脂、蒸馏水 溶解，调.，高压灭菌 备用。（）三糖铁琼脂（）取蛋白胨、牛肉膏、乳糖、蔗糖、葡萄糖、氯化钠、硫酸亚铁胺（）（）.、硫代硫酸钠.、琼脂、酚红.、蒸馏水，除酚红以外的各成分加热溶解，调.，再加入.酚红水溶液.，摇匀。分装试管，高压灭菌、。放成高层斜面备用。（）硝酸盐培养基 将硝酸钾.、蛋白胨、蒸馏水 溶解，调.，分装试管，每管约，高压灭菌 备用。硝酸盐还原试剂（甲液：将对氨基苯磺酸.溶解于 乙酸溶液 中。乙液：将甲萘胺.溶解于 乙酸溶液 中。试验方法：接种后在（）培养，加入甲液和乙液各 滴，观察结果。硝酸盐还原为亚硝酸盐时立刻或数 分钟内显红色）。（）缓冲葡萄糖蛋白胨水（和
22、试验用）将磷酸氢二钾、多价胨、葡萄糖、蒸馏水 溶化后校正.，分装试管，高压灭菌1 备用。甲基红（）试验（取少量纯培养物接种于本培养基中，于（）培养。滴加甲基红试剂 滴，立即观察结果。鲜红色为阳性，黄色为阴性），甲基红试剂配法（甲基红溶于 乙醇中，然后加入 蒸馏水）；试验（取少量培养物接种于本培养基中，于（）培养。加入 萘酚 酒精溶液.和 氢氧化钾溶液.，充分振摇试管，观察结果。阳性反应立刻或数 内出现红色，如为阴性，应放在温箱再培养，再进行观察）。（）糖发酵培养基 将牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、磷酸氢二钠（）、.溴麝香草酚蓝溶液、蒸馏水 溶解后，按.加入所需糖类（李斯特菌可分别加入甘露醇、木糖、鼠
23、李糖等），调.，分装于有倒管的小试管中，高压灭菌 备用。（）血琼脂 将肉浸液（或牛肉膏，加 蒸馏水）、蛋白胨、氯化钠、琼脂、脱纤维羊血，上述培养基（除羊血外）溶化后，调 为.，分装小烧瓶，高压灭菌，待冷至，以无菌操作加入脱纤维羊血，混匀后，倒入平皿。.氯化钠蛋白胨水（）成分 氯化钠、蛋白胨、蒸馏水。（）制法 将上述成分混于蒸馏水中，加热溶解。用 氢氧化钠调至.，分装试管，灭菌。存放备用。（）用途 用于区别副溶血性弧菌和其他种弧菌，副溶血性弧菌在此培养基中能生长，霍乱弧菌等弧菌在此培养基中不生长。培养时间以 为准。.碱性琼脂培养基（）成分 牛肉膏.、蛋白胨、氯化钠.、琼脂.、蒸馏水。（）制法 将
24、上述成分混于蒸馏水中，加热溶解。调至.，灭菌 冷至 左右倾注平皿，存放备用。（）用途 分离古典生物型和埃尔托（）生物型霍乱弧菌。.明胶培养基（）成分 明胶、肉膏汤。（）制法 将明胶置于肉膏汤中，隔水加热溶解，调至.趁热过滤，分装小试管，每管，灭菌 后 存放备用。（）用途 明胶液化试验用。.庖肉培养基（）成分 新鲜去脂碎牛肉、蒸馏水。其他：氢氧化钠、凡士林。（）制法 将新鲜去脂碎牛肉置入 蒸馏水中，加氢氧化钠，煮沸，用 层纱布过滤，取其滤液作牛肉汤培养基，肉渣用水冲洗除去碎屑，再用蒸馏水冲洗。最后用纱布包紧，挤除多余水分。将肉渣分装试管，高度约，再加入牛肉汤培养基高出肉渣 倍，每管培养基上加入
25、厚的凡士林。灭菌 后 存放备用。（）用途 该培养基最常用于厌氧芽孢梭菌的增菌培养、芽孢形成、蛋白质的分解、毒素产生及保种。.促芽孢形成培养基（）土壤浸出液培养基 蛋白胨、土壤浸出液、牛肉浸粉、琼脂、.，将各成分相加，加热溶解，高压灭菌。多数需氧芽孢杆菌的无芽孢菌株使用本培养基可以恢复其形成芽孢的特性。（）培养基 细菌盶蛋白胨、酵母浸粉、可溶淀粉、硫乙醇酸钠、磷酸氢二钠、水，.，用于产气荚膜梭菌的芽孢形成。（）培养基 细菌盶蛋白胨、酵母浸粉、可溶性淀粉、硫酸镁.、磷酸二氢钾.、磷酸氢二钠.、水，.，用于产气荚膜梭菌的芽孢形成。（）锰营养琼脂 胰胨、葡萄糖、酵母浸粉、磷酸氢二钾、.硫酸锰水溶液、琼
26、脂、水，用于加强需氧芽孢杆菌芽孢形成。.肝浸液半固体琼脂（）成分 肝浸液、蛋白胨、氯化钠.、琼脂粉.。（）制法 将上述成分混合，加热溶解，调至.，分装小试管，每管.，灭菌 备用。（）用途 用于布氏菌染料抑菌试验。加入 甘氨酸可用作检测弯曲菌对 甘氨酸耐受试验。.沙保培养基（）成分 称取葡萄糖.、蛋白胨.、琼脂粉、蒸馏水。（）制法 将上述成分混合加热溶解（一般可不调），分装试管，一般以斜面长度不超过试管长度的 为宜，经高压蒸汽 灭菌 后，取出摆成斜面，待琼脂凝固后，置 孵育，使凝结汽水蒸发，若无杂菌污染者，即可放冰箱内保存备用。（）用途 供分离培养真菌用。.曲霉菌鉴别培养基（）成分 胰蛋白胨、柠
27、檬酸铁.、酵母浸膏、琼脂、蒸馏水。（）制法 将上述各成分混于蒸馏水中，加热溶解，分装于中试管，灭菌 后，取出摆成斜面，待琼脂凝固后，即可放 冰箱内保存备用。（）用途 于 培养，黄曲霉菌可呈现鲜艳的橙黄色菌落。.虎红氯霉素培养基（）成分 葡萄糖、蛋白胨、磷酸二氢钾、硫酸镁（）.、虎红（孟加拉红）、蒸馏水、氯霉素.。（）制法 将上述成分混于蒸馏水中，加热溶解，分装试管，每管，灭菌，趁热置成斜面，冰箱保存备用。（）用途 黄曲霉菌、青霉菌在此培养基上生长较好，产生色素典型。.蔡氏和改良蔡氏培养基（）成分 硝酸钠，硫酸铁.、硫酸镁.、氯化钾.、磷酸氢二钾、蔗糖、琼脂、蒸馏水。在此基础上加氯化钠，以硫酸亚
28、铁.代替硫酸铁即为改良蔡氏培养基。（）制法 将上述成分混于蒸馏水中，加热溶解，分装试管，每管，灭菌，趁热置成斜面，置 冰箱保存备用。（）用途 该培养基有利于分离曲霉菌和青霉菌等真菌。.马铃薯 葡萄糖琼脂（）成分 马铃薯、葡萄糖、琼脂、蒸馏水。（）制法 将马铃薯去皮，洗净，切成小块，置蒸馏水中煮 或，用纱布过滤，挤出所有液体，补足水量。加入其他成分，加入溶化，调至.，分装，灭菌，趁热置成斜面，置 冰箱保存备用。（）用途 真菌分离培养的基础培养基。.葡萄球菌培养基（）成分 胰蛋白胨、乳糖、酵母浸膏.、甘露醇、氯化钠、明胶、无水磷酸氢二钾、琼脂、蒸馏水。（）制法 将上述成分混于蒸馏水中，加热溶解，调
29、至.，灭菌，冷至 左右倾注平皿。（）用途 用于葡萄球菌增菌培养及鉴别。接种标本后置 培养 或培养，形成深橙色菌落。若在菌落上加 滴.溴麝香草酚蓝指示剂变为黄色即为分解甘露醇产酸；若在菌落上加 滴磺基水杨酸水溶液或饱和硫酸铵水溶液，后，菌落周围出现一清晰带，即表明有明胶酶，明胶水解阳性。由于被检样品本身所含微生物数量和存在形式关系，以及微生物鉴定本身的特殊要求，许多被检样品需要进行微生物培养，用以进行微生物鉴定或进一步的实验鉴定。三、病原微生物培养与接种技术（一）细菌的一般接种技术.琼脂平板划线法 划线接种的方式很多，要求通过划线而使混杂的几种细菌在琼脂平板表面分散开来；使个别的细菌能固定在一点
30、，生长繁殖后形成单个菌落，以达到分离得纯种的目的。一般常用分区划线法。右手持接种环在火焰上烧灼灭菌，待冷（稍待），取细菌培养物（或病人材料）少许。左手持琼脂平板底部，盖留在桌上，使培养基面尽量直立，以免空气中杂菌落入，并靠近火焰附近操作。右手握持沾菌的接种环涂布于琼脂平板之边缘上，继续用接种环按不同方向划开。划线时使接种环与平板表面约呈 度角轻轻接触。以腕力在平板做轻快的滑移动作，不可用力太大，以免划破琼脂平板，划线要求密集平行，充分利用平板表面，但不要交叉重复。.琼脂斜面培养基接种法 此法通常是从平皿上挑取某一单个菌落转种至斜面培养基上，或从斜面培养基转至斜面培养基，主要用于细菌的转种分纯或
31、扩大培养，使其增殖后用于鉴定或保存菌种。自琼脂平皿转至斜面培养基：左手持待接种的斜面培养基，略倾斜，琼脂斜面部向上；右手持接种环，在火焰上灼烧灭菌，待冷；以右手拔取并夹持试管塞，将管口迅速通过火焰灭菌；用灭菌且冷却的接种环挑取单个菌落，迅速移入待接种的斜面培养基，自斜面底部向上划一直线，然后再由底部起轻轻向上蜿蜒涂布；接种毕，将管口迅速通过火焰上灼烧灭菌后，塞好塞子。置 培养。自斜面培养基转至斜面培养基：左手持菌种管与待接种的斜面培养基管，将两管并列，略倾斜，琼脂斜面部均应向上；右手持接种环，在火焰上灼烧灭菌，待冷；以右手手掌与小指，小指与无名指分别拔取并夹持两管塞子，将两管管口迅速通过火焰灭
32、菌；用灭菌且冷却的接种环伸入菌种管，从斜面刮取菌苔少许，迅速移入待接种的斜面培养基管内，自斜面底部向上划一直线，然后再由底部起轻轻向上蜿蜒涂布；接种毕，将两管管口迅速通过火焰上灼烧灭菌后，塞好塞子。置 培养。.液体培养基接种法 此法主要用于单糖发酵、靛基质试验等。接种方法基本同于斜面接种法。按上述斜面接种法，以无菌操作程序分别取三种细菌培养物少许，接种于肉汤管中，先将沾菌的接种环在接近液面的管壁上轻轻研磨，使细菌混合于肉汤中。培养 后，观察各种细菌的生长情况；大多数细菌在肉汤培养基中生长呈现均匀浑浊（大肠杆菌）；有的细菌沉淀于管底（如炭疽杆菌及链球菌），或生长在液面呈菌膜状（如枯草杆菌）。.半
33、固体培养基穿刺接种法 此法多用于双糖、明胶、半固体等培养基的接种。接种方法与斜面接种法相似。按上述斜面培养基接种法，以无菌操作方法用接种针分别挑取细菌纯培养物少许或单个菌落，垂直刺入半固体琼脂培养基的中心，直至近管底处，但不必及于管底，随即循原线退出。培养 后，观察细菌生长情况。具有鞭毛的细菌（如大肠杆菌）能从穿刺线向四周弥散生长，使整个培养基浑浊；细菌如无鞭毛（如葡萄球菌），则仅沿穿刺线生长。.倾注培养法 本法适用于饮用水、牛乳、果汁等标本的细菌计数。若为固体检样则应以无菌操作经充分振摇或研磨做成 的匀浆，并置匀浆器中以，做成 的匀浆稀释液。（）先将营养琼脂熔化并冷至 左右。（）取待检标本（
34、原始标本或经适当稀释的标本）置于直径为 的无菌平皿内。（）倾入 上述琼脂，立即混匀，待冷凝后于 倒置培养，做菌落计数。（）菌落计数时，可用肉眼观察，必要时需用放大镜检查。应选择菌落数在 的平皿作为菌落数测定的标准，求出同稀释度平皿的平均菌落数再乘以稀释倍数即为每毫升待测检样所含的活菌数（）。（二）细菌的培养方法.一般培养法 此法又称需氧培养法。将已接种好的培养基置于 温箱中培养，一般细菌即可生长。少数难以生长的细菌需培养 或更长时间。.二氧化碳培养法 此法是将某些细菌置于 环境中进行培养的一种方法。产生 的方法常用的有烛缸法和化学法。烛缸法：将已接种细菌的培养基置于标本缸或干燥器内。缸口及缸盖
35、涂以凡士林，放入适当长度的点燃的蜡烛于缸内，盖密盖。待 蜡烛自行熄灭，此时缸内含。最后将容器置于 温箱中培养。化学法：每升容积加入重碳酸钠.浓盐酸.，分别将两试剂置于 大小的烧杯内，再放入标本缸或干燥器中，盖密盖后置温箱培养。重碳酸钠与浓盐酸接触生成。.厌氧培养法 此法主要用于厌氧菌的分离培养。厌氧培养的方法很多，此处主要介绍庖肉基培养法和简易厌氧罐法。庖肉基培养法：将庖肉基表面的凡士林微加热熔化，斜持试管，使凡士林粘附于试管一侧，再种入标本并轻摇使其充分混于肉渣内。再将凡士林微加热熔化并直立试管使覆盖于培养基表面，置 温箱培养 后观察培养结果。如分离厌氧芽孢梭菌，可在标本接种后将培养基置于
36、的水浴中 以杀灭其他杂菌。简易厌氧罐法：此法采用普通干燥器或简易厌氧罐，将培养物放入其内，再按每升容积放入.硼氢化钠（装入小烧杯中，加水）、.柠檬酸和.碳酸氢钠（装入另一小烧杯中，加水）以及钯粒、美蓝指示剂 支。硼氢化钠遇水产生氢气，经冷催化剂钯粒的催化与罐中的氧化合生成水，将罐内氧气耗尽。柠檬酸和碳酸氢钠作用生成，供厌氧菌生长繁殖用。美蓝指示剂指示罐内厌氧状态。（三）鸡胚接种培养法 许多微生物特别是病毒可在鸡胚某些组织内生长繁殖，以鸡胚接种病毒等微生物，操作简单，来源容易。准备鸡胚时应选择表面光泽干净、白色蛋壳（来亨鸡）的受精卵，其优点是易于观察鸡胚的生长情况，保存于 备用，以 之内为佳。孵
37、育时置 孵卵器内孵育，相对湿度，每日翻 动鸡胚 次。第 天起，用检卵灯观察鸡胚发育情况，淘汰未受精卵；受精卵可看出清晰的血管和鸡胚的暗影，随着转动鸡胚可见胚影活动。随后每天观察 次，若出现胚动呆滞、胚影固定于卵壳或血管昏暗模糊者，表明鸡胚濒死或已死亡，需随时淘汰。生长良好的鸡胚一直孵育到适当的胚龄。常用的接种方法有以下 种。.绒毛尿囊膜接种法 选用 胚龄的鸡胚，于照卵灯下标记胎位；于鸡胚旁近气室端选择无大血管处碘酒、乙醇消毒，用磨卵器在其部位卵壳上磨一条与卵纵轴平行的小槽，同时于气室用钢锥钻一小孔；将卵置于蛋架上，用针头或刀尖在小槽处轻轻刺破卵壳，切勿伤及绒毛尿囊膜；滴加无菌生理盐水一滴于壳膜
38、上，用橡皮吸头紧接气室小孔吸气，以造成气室负压，使绒毛膜下沉，去壳膜后可见已形成人工 气室。用注射器吸取.标本悬液滴于绒毛尿囊膜上，最后用熔化的石蜡或胶纸封口。将鸡胚横卧于 温箱中孵育。.尿囊腔接种法 选用孵育 胚龄的鸡胚在照卵灯下，用铅笔画出气室和胎位，在鸡胚旁无大血管处做好标记，并用磨卵器将卵壳磨一小孔，用碘酒消毒，用注射器吸取标本悬液.，由小孔斜刺进入.处注射，即达到尿囊腔，再以石蜡封孔置 温箱中孵育。.羊膜腔接种法 选用孵育 胚龄的鸡胚，在接种前一天将鸡胚气室朝上直立孵育，并标明胎位。接种时，用碘酒、乙醇消毒气室和胎位部分，在气室端开.方形天窗，不能损破壳膜，滴上一滴石蜡使卵壳透明，借
39、手电筒靠卵侧照视，可清楚看到胎位。以 注射器穿破羊膜注射标本悬液.，注射毕用玻璃胶纸封口，置 温箱中直立孵育，不能翻动。在照卵灯下画出气室和胎位，垂直直立于蛋架上。.卵黄囊接种法 选用孵育 鸡胚，利用照卵灯画出气室和胎位，并直立于蛋架上，气室端朝上，以碘酒、乙醇消毒，用无菌的钢锥在气室中央钻一小孔，用 注射器及 号针头吸取标本悬液.，从气室小孔垂直刺入接种于卵黄囊内，深度，退出注射器，用溶化的石蜡封闭小孔，置 温箱内培养，每天用照蛋灯检视一次，翻动两次。（四）组织培养法 目前分离培养病毒最常用的方法是组织培养，经济适用，敏感，结果正确。组织培养通常是指离体的活组织块培养法或单层细胞培养法两种，
40、目前组织块培养法已较少用，多采用单层细胞培养法。实验室常用的细胞有原代和次代细胞、二倍体细胞株和传代细胞系。体外细胞生长方式有悬浮型和贴附型两种。细胞类型常见有四种：成纤维细胞型：呈梭形，放射状生长；上皮细胞型：呈多角形，紧密相连；游走细胞型：呈散在生长，不连成片，游走变形；多形性细胞型：呈多形性，如同神经细胞。.原代细胞培养法（以鸡胚单层细胞培养法为例）（）材料 各种溶液：平衡盐溶液 液、.胰蛋白酶液、细胞生长液及细胞维持液。龄鸡胚、待测标本悬液。一般器械：无菌平皿、滴管、吸管、三角烧瓶、青霉素瓶、瓶塞、弯头小剪、小镊子等；血细胞计数板、水浴箱、离心机、消毒棉球等。（）方法 将 龄鸡胚以碘酒
41、、乙醇消毒卵壳后，以无菌操作取出鸡胚放于平皿内，去头、爪、内脏、骨骼。将组织块移入青霉素瓶内，用弯头小剪将鸡胚剪碎成.的小块，用含双抗的 液洗涤 次。加入 倍量的.胰蛋白酶液，静置 水浴中消化，弃去上清。用冷 液洗涤一次，离心，以除去胰蛋白酶液。加入 生长液，用毛细管吹打 次，使细胞分散呈均匀的悬液，再加适量生长液以稀释细胞悬液。细胞计数：取细胞悬液.加 液.及台盼蓝染液（.）或苯胺黑.，混匀后滴入血细胞计数盘内，静置，按白细胞计数法计算四个大方格中活的细胞数，用下列公式算出每毫升悬液中细胞数。细胞数 个大方格细胞总数 稀释倍数 用生长液稀释细胞悬液成 万 万个 较为合适。每个青霉素瓶中各分装
42、。盖好瓶盖，平置 环境培养。每天用倒置显微镜观察生长情况，一般于培养次日可见细胞贴壁生长成单层鸡胚成纤维细胞。取已长成片状的单层细胞接种标本。接种后即换成维持液，每天在镜下观察，如发现细胞发生圆缩、堆积、脱落等病理变化时，可能有病毒生长，应收集做进一步鉴定。细胞病变程度用“、”号表示。：表示 的细胞出现病变；：表示 的细胞出现病变；：表示 的细胞出现病变；：的细胞出现病变；：表示无细胞出现病变；.细胞传代培养法（以 为例）。（）材料 细胞、液、.或.胰蛋白酶或胰蛋白酶（胰蛋白酶，.）、细胞生长液（液或细胞培育液 液，实验室多使用商品化细胞生长液，按说明配制即可）。培养瓶、毛细吸管、吸管（、）、
43、废液瓶（事先醇消过毒），用无菌的钢锥在气室中央钻一小孔，用 注射器及 号针头吸取标本悬液.等。（）方法 选择一瓶已长成单层的 细胞，轻轻摇动培养瓶数次，悬浮起浮在细胞表面的碎片并连同生长液一同倒弃（倒至废液瓶内），用 液洗涤一次。从无细胞面侧加入.（或其他消化液），翻转培养瓶，使消化液浸没细胞约，再翻转培养瓶使细胞层在上，放置，不时肉眼观察至细胞面出现布纹状网孔为止。倒出消化液，沿细胞层的对面轻轻加入 液 洗涤，洗涤时慢慢转动培养瓶，让洗液在瓶内缓缓流动，以洗去消化液。沿细胞面加入适量生长液，洗下细胞，并用吸管吸入生长液，对准瓶底或瓶壁用力吹打贴壁细胞数次，并使细胞脱落分散成为细胞悬液。然后再
44、视其细胞数量进行传代（一般 传 或 传 分装成 瓶，可保留原瓶继续使用）。置，环境培养，传代后 左右可贴壁，换生长液，一般 可形成单层。形成单层后，可换成维持液供感染病毒等试验用，也可作为细胞株保存。（五）真菌培养法.真菌大培养法 常用沙保琼脂培养基培养，用于观察真菌菌落形态及色素的产生。酵母及酵母样真菌的接种方法如同细菌接种法，即用接种环或接种钩取材划线接种于斜面培养基表面即可，置 或 培养，后观察生长情况。丝状真菌的接种应用接种钩取材，将琼脂表面划破，被检材料或标本点种在划破的琼脂处浅表面，如同种树一样。置 培养，周观察生长情况。.真菌小培养法 为观察真菌自然形态、结构特征及生长发育情况，
45、常采用小培养法。真菌小培养的方法很多，本文主要介绍平皿点植法、玻片琼脂法和琼脂小块法。平皿点植法：将琼脂平皿倒置于实验台上，左手拿起皿底使培养基面朝下，右手持续种针，挑取待测菌少量孢子，轻轻点种于琼脂平皿中心一点，或点种成 大小的三角形的三个点，单细胞真菌可用接种针划线接种成 大小的十字叉状。盖上无菌盖玻片，于 培养一定时间，置显微镜下观察（若不加盖盖玻片，可采用倒置方式培养，这样可避免真菌孢子散落在培养基上，使形成典型菌落）。玻片琼脂法：在无菌载玻片上滴加少许沙保琼脂培养基，待冷凝后以划破琼脂法接种标本，盖上无菌盖玻片。置保持充分湿度的环境中，培养。真菌生长后取出，先用低倍镜观察，再用高倍镜
46、仔细观察菌丝和孢子形态。琼脂小块法：于无菌平皿中倾注沙保琼脂培养基，待冷凝后以无菌操作将琼脂切成.的小方块，置于无菌载玻片中央，然后在琼脂小块四周接种已纯化的真菌菌种，盖上盖玻片，置于有一定湿度的无菌环境中，培养。可在培养的不同时期取出真菌生长后取出，置显微镜下观察。此外，可先在培养物上滴加一滴 乙醇脱水，待干后，滴加乳酸酚棉蓝溶液染色，菌丝和孢子均染成蓝色，使更易观察。.丝状菌及酵母菌计数法 用于各类粮食原料、食品以及饮料中丝状菌和酵母菌的计数。（）采样 取样时要特别注意样品的代表性，并避免污染，所用的容器和工具都必须无菌。可根据采集的样品，采用不同的取样方式。如发酵食品、谷物加工制品、乳及
47、乳制品、其他液体食品等，用无菌工具采集可疑霉变食品，装入无菌容器中送检。如为粮垛或粮囤，根据其大小和类型采用分层定点取样，一般可分为三层五点，或分层随机取样，即充分混合后取约 送检。（）方法 以无菌操作称取样品 或，放入含有 的无菌.蛋白胨水的三角烧瓶中，振摇，制成 稀释液，用带橡皮乳头的 无菌吸管反复吹取 次，以使真菌孢子充分散开。取 稀释液 注入含 无菌水的试管中，另取一支 吸管吹吸混匀 次，即为 稀释液。按此操作方式依次做 倍递增稀释。由于孢子易于沉淀，稀释过程应尽可能短。根据对样品污染情况的估计，选择 个合适的稀释度，在做 倍稀释的同时，分别吸取 稀释液于无菌平皿中，每个稀释度重复 个
48、平皿，然后将冷至约 的虎红琼脂注入平皿中，充分混匀，待琼脂凝固后于 温箱倒置培养。后开始观察，共观察。（）计算方法 选择菌落数在 的平皿进行计数，同稀释度的 个平皿的菌落平均值乘以稀释倍数，即为每克或每毫升样品中所含丝状菌和酵母菌数。（）报告 以每克或每毫升样品中所含丝状菌和酵母菌菌落形成单位（，）报告。.直接平皿分离计数法 该法适用于谷粒、坚果等颗粒状样品的真菌分离计数。（）样品表面除菌 取样品，放入 大小的玻璃瓶中，倒入适量的 次氯酸钠溶液浸泡，倾出浸液，再用无菌蒸馏水洗涤多次，除去样品表面带的杂菌，以分离内部的真菌。最后将样品倒入铺有无菌吸水纸的平皿中，沥干，备用。（）方法 样品沥干后立
49、即接种，视颗粒在每皿接种 粒，每份样品共接种 粒。（）培养 接种后将皿盖朝上于 培养。（）结果观察 观察并记录受真菌侵染的粒数，以受真菌侵染粒数与接种粒数之比的百分率表示侵染率。（六）活体动物接种与感染技术 利用培养基增殖微生物固然有其很多优势，但是在许多情况下或许多病原体需要利用活体动物接种才能达到鉴定或最佳鉴定目的。.皮内接种法 该接种法注射部位以实验动物背部脊柱两旁为宜，最后选择白毛动物。用弯头剪去毛，消毒后，将皮肤绷紧，用 注射器，配上最小号针头，以针尖端斜面向上，平刺入皮肤内，慢慢注入接种物.，可见注射部位皮肤出现小圆丘形隆起。将针头斜面旋转向下再慢慢拔出，以防接种物溢出。.皮下接种
50、法 注射部位多为腹股沟、腹中线处或背部，小白鼠还可选择尾根部。局部去毛消毒后，用左手拇指和食指轻轻提起或捏住局部皮肤，右手将注射器刺入提起的皮下，左手放松，将接种物缓缓注入（视动物大小注入.），此时可见注射的皮肤出现片状隆起，然后慢慢退出注射器，以防接种物外溢。.肌肉接种法 注射部位除禽类以胸部肌肉为宜外，其他实验动物以腿部肌肉为宜。由一人抓住动物，局部去毛消毒后，由另一人将注射器刺入肌肉层内慢慢注入接种物.。.腹腔内接种法（）小白鼠腹腔接种法 接种者先用左手拇指和食指捏住小白鼠耳颈部皮肤，再用无名指和小指将其尾巴按在手心内，将小白鼠固定于手掌后，使其头部朝下腹部朝上，右手持注射器先刺入皮下，