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1、甲型H1N1 流感病例标本采集和实验室检测一、病原学 流行性感冒病毒属于正粘病毒科。正粘病毒的核酸分节段。正粘病毒科仅有一个种，即流行性感冒病毒，简称流感病毒。流感病毒分为甲（A）、乙（B）、丙（C）三型，是流行性感冒的病原体。甲型流感病毒除了感染人外，还可引起禽、猪等多种动物感染。由于该病毒抗原性易发生变异，曾多次引起世界性大流行，例如，19181919 年的大流行中，全世界至少有2000 万人死于流感。乙型流感病毒仅感染人且致病性较低。丙型流感病毒只引起人类不明显或轻微的上呼吸道感染，很少造成流行。甲型流感病毒于1933 年分离成功。形态与结构：形态多为球形，直径为80120nm，初次从患
2、者体内分离出的病毒有时呈丝状或杆状。流感病毒核酸为分节段的单负链RNA，由核心和衣壳组成的核衣壳呈螺旋对称，有包膜，表面有刺突。核心：流感病毒RNA 分节段，甲型和乙型由8 个节段、丙型由7 个节段组成。各片段的长度在8902341bp 之间。由于病毒分节段复制，病毒成熟时再重新装配于子代病毒体中，所以病毒在复制过程中极容易发生基因重组而导致新病毒株的出现，这也是流感病毒易发生变异的主要原因。每个基因节段分别编码不同的蛋白质。16 片段分别编码PB2、PB1、PA、HA、NP 和NA 单个蛋白，第7 片段编码M1和M2 两个蛋白，第8 片段编码NS1 和NS2 两个蛋白。核蛋白（NP）：是病毒
3、的主要结构蛋白，构成病毒衣壳，它与3 种RNA 多聚酶复合体（PB1、PB2、PA）一起与RNA 节段相连形成核糖核蛋白（RNP），即为核衣壳，呈螺旋对称排列。核蛋白抗原结构稳定，很少变异，与M 蛋白一起决定病毒的型特异性，但其抗体没有中和病毒的能力。包膜：病毒体的包膜由两层组成，内层为基质蛋白M1，其抗原结构较稳定，具有型特异性，但相应抗体不具有中和病毒的能力，而在增加病毒包膜的韧性与完整性方面起重要作用。包膜外层来源于宿主细胞膜的脂质双层膜，M2 为嵌于包膜中的膜蛋白，形成膜通道，利于脱壳及HA 的产生。刺突：流感病毒的包膜上镶嵌有两种刺突，即血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA），均以疏水末
4、端插入到脂质双层中。血凝素的数量较神经氨酸酶多，大约为4 15 1。血凝素（HA）：呈三棱柱形，糖蛋白成分，占病毒蛋白的25%。HA 为三聚体，每条单体前体（HA0）由HA1 和HA2 通过精氨酸及二硫键连接而成，当精氨酸被细胞蛋白酶裂解而形成仅由二硫键连接的HA1 和HA2 时，病毒才有感染性。HA1 是同红细胞、宿主细胞受体（唾液酸）相结合的部位，因而与感染性有关；HA2 具有膜融合活性，促使病毒包膜与胞饮细胞膜的融合并释放核衣壳。HA 抗原结构易发生改变，是划分甲型流感病毒亚型的主要依据。二、卫生部办公厅关于印发人感染甲型H1N1流感预防控制技术指南（试行）的通知 标本采集和检测 1、标
5、本采集：按照本指南的应急监测方案（附件2）要求，采集相关标本进行检测。具体标本采集类型、方法参见全国流感/人禽流感监测实施方案的“流感监测实验技术操作规范”。2、标本检测：标本检测方法和流程参见附件3 人甲型H1N1 流感病例标本采集和实验室检测指南（暂行）。3、生物安全要求：甲型H1N1 流感病毒培养应在具有资质的BSL-3 实验室中进行，标本储存、包装和运送应按照病原微生物实验室生物安全管理条例（国务院424 号令）和可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样本运输管理规定（中华人民共和国卫生部第45 号令）等有关规定执行。三、附件3.甲型H1N1 流感病例标本采集和实验室检测指南（暂行
6、）甲型H1N1 感冒病毒的检测：所有甲型H1N1 感冒疑似病例应该采集上呼吸道标本来检测甲型H1N1 感冒病毒。推荐采集的呼吸道标本：疾病发病后应尽快采集如下标本：鼻咽拭子/吸取物或者鼻腔冲洗液/吸取物。如果不能收集这些标本，可合并鼻拭子与口咽拭子。气管插管的病人也应收集气管吸取物。标本应置于无菌病毒运输液（VTM），并立即用冰块或冰排保存或置于4（冰箱），并马上运送至实验室。临床样品收集人员及实验室人员的感染控制指导请见相关文件。（1）拭子：理想的情况下，标本应使用头部为合成纤维的拭子（例如，聚酯纤维），用铝或塑料做杆。不推荐棉拭子和木杆。不能用海藻酸钙做的拭子收集标本。标本采集管应包含2
7、毫升病毒运输液（例如，含有蛋白质稳定剂，阻止细菌和真菌生长的抗生素，缓冲液）。（2）临床标本储存：所有呼吸道标本应保存在4，并尽快放置在-70。如果没有-70 冰箱，标本应保存在4，但不应超过4 天。（3）临床标本运输：临床标本应按照A 类包装要求运送，并用干冰运输。所有标本应标示清楚。疑似病例标本运送应包含的信息请参照禽流感标本运输。（3）检测程序：呼吸道标本应首先应用realtimeRT-PCR 方法检测A 型流感病毒的M 基因、Swine（H1N1）的HA 基因和NP 基因，以及质控对照RNP 基因。同时，接种MDCK 细胞或SPF 鸡胚进行病毒分离，并测定病毒的全基因组序列。（4）推荐
8、的检测方法：用Real-timeRT-PCR 方法检测甲型H1N1 感冒病毒。RT-PCR荧光PCR（5）其他检测方法*快速流感抗原检测：一些商用快速检测可以区分A 和B 型流感病毒。快速检测实验A 型流感阳性的病例符合可能病例的标准。这些实验对检测甲型H1N1 流感病毒临床标本的敏感性和特异性未知，而且检测季节性流感病毒的灵敏度不佳。因此，快速检测阴性结果可能是假阴性，不能作为甲型H1N1 流感感染的最后诊断。快速抗原检测*免疫荧光法：免疫荧光试验可以区分A 和B 型流感病毒。检测A 型流感阳性的病例符合可能病例的标准。免疫荧光试验的结果取决于临床标本的质量，操作技能，对检测甲型H1N1 感
9、冒病毒临床标本的敏感性和特异性未知。因此，免疫荧光试验阴性结果可能是假阴性，不能作为甲型H1N1 流感感染的最后诊断。免疫荧光*病毒培养：可用MDCK 细胞和SPF 鸡胚分离甲型H1N1 流感病毒可以诊断感染，但无法为临床诊断及时提供结果。病毒分离阴性并不能排除感染甲型H1N1 流感病毒鸡胚尿囊腔、羊膜腔接种四、临床标本的采集 1、鼻拭子：将带有聚丙烯纤维头的拭子轻轻插入鼻道内鼻腭处，停留片刻后缓慢转动退出。以另一拭子拭另侧鼻孔。将拭子头浸入采样液中，尾部弃去。2、咽拭子：用带有聚丙烯纤维头的拭子擦拭双侧咽扁桃体及咽后壁，同样将拭子头浸入采样液中，尾部弃去。注：亦可将鼻、咽拭子收集于同一采样管
10、中，以便提高分离率，减少工作量。3、鼻咽抽取物：用与负压泵相连的收集器从鼻咽部抽取粘液。先将收集器头部插入鼻腔，接通负压，旋转收集器头部并缓慢退出。收集抽取的粘液，并用采样液5ml 涮洗收集器3 次。标本采集鼻拭子标本采集咽拭子标本采集鼻腔吸引液 4、漱口液：用10ml 生理盐水漱喉。漱时让患者头部微后仰，发“噢”声，让生理盐水在咽部转动。然后，用平皿或烧杯收集洗液5、鼻洗液：患者取坐姿，头微后仰，用移液管将5ml 生理盐水注入一侧鼻孔，嘱患者同时发K 音以关闭咽腔。然后让患者低头使生理盐水流出，用平皿或烧杯收集洗液。重复此过程洗两侧鼻孔。五、临床标本的运送 1、新鲜的临床采集标本应在4 条件
11、下24 小时内运送至全国流感监测网络实验室。未能24 小时内送至实验室的，应置-70 或以下保存。标本送至实验室后，病毒分离标本应尽快进行接种分离，24 小时内能进行接种的可置于4 保存，如未能接种应置-70 或以下保存。2、冻存的临床采集标本应在冻存的条件下，低温送至实验室。冻存的标本送到实验室后，24 小时内能进行病毒分离的，可以放置4 保存。如未能分离的标本应置-70 或以下保存。3、临床标本采集管建议使用带螺口的塑料管。六、生物安全要求 甲型H1N1 流感病毒培养应在具有资质的BSL-3 实验室中进行，标本储存、包装和运送应按照病原微生物实验室生物安全管理条例（国务院424 号令）和可
12、感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样本运输管理规定（中华人民共和国卫生部第45 号令）等有关规定执行。医护人员防护 1、一级防护（1）适用于发热门(急)诊的医务人员。（2）穿工作服、隔离衣，戴工作帽和医用防护口罩。（3）每次接触病人后立即进行手清洗和消毒。手消毒用0.30.5%碘伏消毒液或快速手消毒剂(洗必泰醇、新洁尔灭醇、75%酒精等)揉搓13 分钟。2、二级防护（1）适用于进入隔离留观室和专门病区的医务人员，接触从病人身上采集的标本、处理其分泌物、排泄物、使用过的物品和死亡病人尸体的工作人员，转运病人的医务人员和司机。（2）进入隔离留观室和专门病区必须戴医用防护口罩，每4小时更换1
13、次或感潮湿时更换；穿工作服、隔离衣、鞋套，戴手套、工作帽。（3）每次接触病人后立即进行手清洗和消毒。手消毒用0.30.5%碘伏消毒液或快速手消毒剂(洗必泰醇、新洁尔灭醇、75%酒精等)揉搓13 分钟。（4）对病人实施近距离操作时，戴防护眼镜。（5）注意呼吸道及粘膜防护。3、三级防护（1）适用于为病人实施吸痰、气管切开和气管插管的医务人员。（2）除二级防护外，还应当加戴全面型呼吸防护器。4、防护要求：（1）防护服：符合GB19082-2003 医用一次性防护服技术要求，可为联体或分体式结构，穿脱方便，结合部严密。袖口、脚踝口应为弹性收口，具有良好的防水性、抗静电性、过滤性效率和无皮肤刺激性。（2
14、）防护口罩：符合GB19083-2003 医用防护口罩技术要求，口罩可分长方型和密合型，应当配有鼻夹，具有良好的表面抗湿性，对皮肤无刺激，气流阻力在空气流量为85L/min 情况下，吸气阻力不得超过35mmH2O，滤料的颗粒过滤效率应当不小于95%。也可选用符合N95 或FFP2 标准的防护口罩。杭州市甲型杭州市甲型H1N1H1N1流感疑似标本送检单流感疑似标本送检单标本编号姓 名性别年龄职业*现住址 发病日期 采样时体温标本种类*标本量（g或ml）采集日期备注*职业：参照传染病报告卡 标本种类：A、鼻咽拭子B、鼻咽吸取物C、鼻腔冲洗液D、鼻腔吸取物E、气管吸取物F、其他（请在表格中注明）标本量：如果同一份标本有多个包装，请说明 备注：1、如果是未成年人，请写出家长姓名2、可以写上病人的联系方式3、如果需要病人单独的报告，请注明联系人：联系电话：*送样时间：单位：（盖章）请批评指证谢谢！