电镜技术及超薄切片技术(研究生)医学.ppt

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1、 电子显微镜室简介我室的电镜型号和性能如下:H-600A型透射电镜,购于1989年,最大点分辨率为0.36nm,有效放大倍数达30万倍。H-7500型透射电镜,购于2004年,最大点分辨率为0.24nm,有效放大倍数达60万倍。S-3000N型扫描电镜,购于2004年,有效放大倍数达30万倍。1924年,法国物理学家Broglie提出了“电子与光一样,具有波动性“的假说,并计算出电磁波长为0.005nm.1926年,德国科学家Busch发现了带电粒子在电场或磁 场中偏转聚焦的现象,类似于光线通过透镜可被聚焦一样。19281931年间,德国年轻的大学生Ruska测量了磁透 镜的聚焦特性,并开展了

2、电子放大成像的研究,终于在1938 年成功研制了世界上第一台真正的电子显微镜,放大倍数为 1200倍,被誉为电子显微镜之父。,并在1986年获得诺贝尔 奖。20世纪50年代初到60年代末期,电镜发展很快,从性能 到构造都得到很大的改进,特别是分辨本领得到大幅度提高,达到1nm左右,到80年代的点分辨率已接近0.1nm,最新研制 的超高压透射电镜的点分辨率可达0.005nm。电镜的发展历程电镜的基本类型:1、透射电子显微镜2、扫描电子显微镜3、分析电子显微镜4、超高压电子显微镜5、扫描探针显微镜 (扫描隧道显微镜、原子力显微镜、扫描光子显微镜等)一、电子显微镜的原理和结构 光的衍射现象:由于光具

3、有波动性,当光线通过小孔或小孔光源经光学系统成象会产生衍射。其图案是:中央部分一个亮斑,在其周围有明暗交替的园环。2D D=可以这么说,显微镜分辩本领是由其产生的衍射图中央亮斑半径 D(分辨能力)而定:阿贝公式:D=当光的波长为 =500nm=0.5m介质折射率 N(油)=1.5物体与物镜所形成夹角的半数 90 中央亮斑的半径 D=200nm=0.2m 分辨本领测算:1、人眼在明视距离250mm处能分辨0.2mm的两点。油镜最小能分辨0.2 m的两点。则油镜理论最大放大能力为:0.2mm /0.2 m=10002、假如一台电镜的点分辨率为0.1nm,则其理论放大 倍数为:0.2mm /0.1n

4、m=2x1063、H-7500型透射电镜的点分辨率为0.24nm,则其理 论放大倍数为:0.2mm /0.24nm=0.83x106。而 其有效放大倍数为 0.6x106瑞利准则瑞利准则 光线通过二个比较靠近的小孔时,这二个小孔的衍射图会重叠在一起。当一个衍射图的中央亮斑正好落在另一个衍射图的第一暗环中心时,这二个点刚可以分辩。这就是显微镜分辩本领的 瑞利准则瑞利准则。运动着的电子所产生电磁波长为:=(n m)如 V=50000 v 则 =0.005 nm=0.000005m 是光的=500nm 的10万分之一,大大减少了衍射光斑D的值。光学显微镜与电子显微镜在工作原理上的比较:光学显微镜是利

5、用玻璃制作的透镜对光进行折射,将一物点发出不同角度的光线最终会聚成一个像点。电子显微镜是利用电场或磁场折射电子束,达到成像目的。光 源聚光镜样 品物 镜 投影镜最终象透射电子显微镜 光学显微镜 镜筒内部结构示意图:镜筒内部结构示意图:1)照明系统:电子枪 聚光镜 2)样品室 3)成象系统:物镜 中间镜 投影镜 4)观察记录系统:观察室 照相机 一、电子显微镜的照明系统1、电子枪 一般安装在镜筒的顶端,是一个由阴极、栅极和阳极三个部分组成的结构。大多数阴极为热阴极。灯丝为钨灯丝,呈V形,尖端向下,其余两端连接电源。2、聚光镜 由铁壳包裹的线圈构成,通入电流后乃形成电磁场,使由电子枪发出的电子束进

6、一步密集聚拢,以增强其照明效果。聚光镜的中央位置装有极靴,其作用是籍以增强磁场强度,而磁场强度可通过改变所加电流大小来调节,以达到根据需要调节放大倍率和对所形成图象进行聚焦的目的。一般电镜都设有二级聚光镜。二、电子显微镜的成像系统1、物镜 由铁壳包裹的线圈组成,是电镜成像系统的关键性部件。在物镜中心位置同样装有精密度极高的极靴,以及要求很高的肖像散部件,以尽量消除成像过程中难以完全避免的像散现象,保证成像的清晰度。在物镜的后焦面装有可动光阑片,可根据具体情况来调整光阑孔的大小。2、中间镜 也是由铁壳包裹的线圈组成,位于物镜和投影镜之间,作用是将物镜所成的放大像进一步放大。目前高档的电镜可设有三

7、极中间镜。3、投影镜 也是由铁壳包裹的线圈组成,作用是将以上成像进一步放大并投影于荧光屏上,激发荧光,形成影象。三、观察记录系统1、荧光屏 为圆形平面结构,上面涂以荧光粉,当高速电子撞击其表面时,便激发出荧光,从而使观察者能通过含铅玻璃窗口直接看到影象。2、照相室 在荧光屏的下边,装有电镜软片,通过电子束直接轰击软片表面而使软片爆光,从而使观察影象以底片或照片的形式保存下来。四、真空系统 由低真空和高真空两极真空泵构成。前者称为机械泵,排气气压达0.01mmHg;后者称为扩散泵,排气气压可达0.0001mmHg以下。真空系统的作用是使镜筒内部获得高真空。如果镜筒内真空度较差,将会:1)气体分子

8、与高速电子相 互作用,随机地散射电子,降低象的反差。2)电子枪中存在残余气体,会产生电离和放电,引起电子束发射不稳定。3)残余产体与白灯丝发生作用,降低灯丝寿命。4)残余产体在样品周围会污染样品。五、供电系统 它是由以下三个部分组成 1)高压电源:使电子获得一定的速度。通常电压为25KV、50KV、75KV 和 100 KV。2)磁透镜激励磁电源:它提供了磁透镜所必需的电源,从而使磁透镜周围有一个特定形状的磁场。3)辅助电源:例如真空系统控制电源、调焦和嚗光装置、照相机自动控制和记数电路等等。六、辅助系统 1)水冷系统:是用水冷却油扩散泵、磁透镜的线圈等,保证设备正常工作。2)气动系统:采用压

9、缩空气作为动力,将各种阀门按程序要求打开或关闭,完成所须任务。透射与扫描电镜原理图解扫描电子显微镜工作原理 就是通过极细的电子束扫描标本表面而激发出二次电子,并被接收到阴极射线管而成像。扫描电镜由两个主要部分组成:探查系统和显示系统一、探查系统探查系统:由电子枪、电磁透镜组成。电子枪发射电子束(加速电压在1 50KV),经过电磁透镜的作用,射击标本表面,使之产生二次电子。二、显示系统显示系统:电子检测器,闪烁器、光电倍增器以及显示屏组成。由电子束激发的二次电子被位于检测器前端的栅极所吸引,并被强正电场加速飞向闪烁器。当电子击中闪烁器时,后者乃产生光子,光子沿导光管引向光电倍增器,并在此产生光电

10、子,此信号经放大后被传输到阴极射线管(显示屏),从而在此成像。透射电子显微镜拍摄的照片扫描电子显微镜拍摄的照片 电子束的穿透能力一般较弱,大多数标本无法直接在电镜下观察,必须把样品切成厚度为 101000nm 的薄片。这种切片称为超薄切片,是电镜观察生物样品常用方法之一。(1)超薄切片技术二、透射电子显微镜样品制备 1)取材 取材的要点是快、小、冷、准快、小、冷、准,组织要 新鲜。快:取材时间在12分钟以内完成;小:体积大小在1立方毫米左右或横切面 为1平方毫米的长条形;冷:固定液温度在4摄氏度左右。准:取材部位要准确,尽量取材于所要观察的部位。取材方法:1、器官组织 取材法:主要针对活体器官

11、组织的取材如肾、肝、肺等活检组织。2、游离细胞收集法:主要针对培养细胞及游离细胞如血细胞、脱落细胞等。常用方法有血浆凝集法和琼脂预包埋法。双刀拉锯法2)固定 固定的目的是被研究的材料尽量保持生活状态时的组织结构,避免因缺血缺氧所带来的“死后变化”。固定方法分物理固定法和化学固定法1、物理固定法:微波快速高温、冷冻或干燥2、化学固定法:使用化学试剂-固定剂3、常用固定剂:2.5%戊二醛、1%锇酸、5%高锰酸钾、10%福尔马林、等。1组织块固定:适用活组织检查,如肾、肝、胃肠道等等。常规采用戊二醛锇酸双重固定法。2游离细胞的固定:适用于培养细胞、周围血、骨髓、胸腹水或其他渗出液。如为贴壁生长的培养

12、细胞,应先用橡皮刮子将细胞从培养管壁上轻轻刮下,或用酶消化,使细胞脱离管壁,然后按以上方法固定。有离心法和悬浮制备法。3.原位固定法:在组织表面滴固定液或注射固定液的方法。4灌注固定法:即通过血管将固定液灌注到所要固定的组织中。通常采用的固定剂为2%4%戊二醛溶液或者4%多聚甲醛溶液。化学固定方式分:化学固定方式分:常用固定剂的性质常用固定剂的性质1四氧化锇四氧化锇(osmium tetroxide,OsO4):四氧化锇又名锇酸,是强氧化剂,与氮原子有较强的亲和力,因而对于细胞结构中的蛋白质成分有良好的固定作用。它还能与不饱和脂肪酸反应使脂肪得以固定。此外,四氧化锇还能固定脂蛋白,使生物膜结构

13、的主要成分磷脂蛋白稳定。它还能与变性DNA以及核蛋白反应,但不能固定天然DNA、RNA及糖原。四氧化锇固定剂有强烈的电子染色作用,用它固定的样品图象反差较好。固定的时间一般为1小时左右,其蒸气对皮肤、呼吸道粘膜及眼睛角膜有伤害作用。注意通风和避光。2戊二醛戊二醛(glutaraldehyde C5H8O2)戊二醛的优点是对糖原、糖蛋白、微管、内质网和细胞基质等有较好的固定作用,对组织和细胞的穿透力比四氧化锇强,还能保存某些酶的活力,长时间的固定(几周甚至12个月)不会使组织变脆。缺点是不能保存脂肪,没有电子染色作用,对细胞膜的显示较差。另外还有10%福尔马林、5%高锰酸钾等。3)漂洗组织块固定

14、后,必须彻底洗净固定液的残余。在戊二醛锇酸双重固定的组织块,力求将戊二醛洗净后浸入锇酸液中,防止二者起化学反应而降低固定效果。常用漂洗液为0.1M的磷酸缓冲液(PBS)。4)块染就是对组织块进行整块染色。一般在脱水前用1%醋酸双氧铀染色,时间为12小时。5)脱水)脱水 为了保证包埋介质完全渗入组织内部,必须事先将组织内的水分驱除干净,即用一种和水及包埋剂均能相混溶的液体来取代水,常用的脱水剂是乙醇和丙酮。急骤的脱水会引起细胞的收缩,因此,脱水应梯度进行:70%丙酮15分钟,80%丙酮15分钟,90%丙酮15分钟,100%丙酮0分钟(二次)。6)浸泡与包埋)浸泡与包埋 浸泡:使某种适宜的液体介质

15、(包埋剂)渗入组织块取代脱水剂。包埋:使浸入的介质经高温处理后聚合为坚固体,利于超薄切片。常用包埋剂:Epon-812环氧树脂、DDSA、MNA以及加速剂DMP-30等。(高温处理)液体固体 包埋剂的理想性质理想的包埋剂应具有以下性质:(1)粘度低,容易渗入组织;(2)聚合均匀而充分,聚合前后体积变化小;(3)有良好的切割性能;(4)能耐受电子束轰击,高温下不变形;(5)对细胞成分抽提少,微细结构保存良好;(6)在电镜的高倍放大下,本身不显示任何结构;(7)材料来源丰富、易得,价格低廉,对人体无害。透射电镜样品制备操作流程:取材漂洗(生理盐水)前固定(2.5%戊二醛,4C冰箱2小时以上)漂洗(

16、0.1M 磷酸缓冲液,3次,45分钟)后固定(1%锇酸1小时左右)漂洗(0.1M 磷酸缓冲液,3次,45分钟)块染(1%醋酸铀2小时)梯度脱水(50%、70%、80%、90%、100%丙酮各15分钟,100%2次,各10分钟)浸透(丙酮:包埋液=1:1,37 C烘箱2小时;丙酮:包埋液=1:4,37C烘箱过夜;纯包埋液45C烘箱2小时)包埋聚合(45C烘箱3小时,65C烘箱48小时)常用包埋剂 1环氧树脂Epon 812:为进口分装,聚合前后体积变化小(收缩率为2%5%),切片在电子束照射下稳定,能较好地保存细胞的微细结构。但操作条件要求较严格,如组织块脱水要彻底,包埋时要注意防潮及防止气泡产

17、生,聚合时温度要控制好等。通常与硬化剂MNA、增塑剂DDSA以及加速剂DMP-30混合使用。2、环氧树脂Epon 618:国产,效果不如前者。超薄切片超薄切片 1、切片前的准备:铜网清洗,用丙酮和乙 醇浸洗 2、支持膜制备:常用Formvar膜聚乙烯醇缩 甲醛),由氯仿配置,浓度为0.5%。3、玻璃刀制备:专用制刀机制作。4、半薄切片光镜定位。5、修块技术。6、超薄切片厚度在 5080 nm 之间较为合 适,干涉色为金黄色为宜。7、捞片:常用粘捞法和圈捞法。超薄切片机 分两类:一类是机械推进式切片机,用微动螺旋和微动杠杆来提供微小推进;另一类是热胀冷缩式切片机,利用金属杆热胀或冷缩时产生的微小

18、长度变化来提供推进。切片染色:生物材料是由氢、碳、氮、氧、磷等具有很小原子序数的物质组成,这些物质对电子透射能力和散射能力基本一样,这样所产生图象的反差是很弱的。采用重金属处理以增强反差、提高分辩率。由于被染色标本的不同结构成份对重金属的结合量不同,染色处理后重金属密度高的部分因散射掉的电子较多,在荧光屏上观察颜色也就较深,这样可获得反差对比良好的图象。常用的重金属为铅和铀。电镜观察、拍片、记录等。首先,观察人员要熟悉电镜的基本操作程序以及所要观察材料的相关知识。其次,做好观察记录,选好范围拍片,准确记录底片号码及相应内容。最后,做好各种资料的整理、备案工作。扫描电镜样品制备流程:取材(做好样

19、品观察面的标志)漂洗(生理盐水或缓冲液)固定(2.5%戊二醛2小时以上)漂洗(0.1M磷酸缓冲液,3次,45分钟)后固定(1%锇酸,2小时)脱水(50%、70%、80%、90%、95%各15分钟,换醋酸异戊酯15分钟或叔丁醇15分钟)干燥(零界点干燥或冷冻干燥)镀膜(真空镀膜仪或离子溅射仪)负染技术的原理:观察颗粒状生物材料的外部形状常用的染色方法。用重金属盐沉积到样品四周,样品四周散射电子的能力就较强,因而表现为暗区;样品本身散射电子的能力较弱,则表现为亮区,这样便能把样品的外形与表面结构清楚地衬托出来。标本回顾性研究 石蜡块做超薄切片技术1、取材:用锋利刀片从石蜡块上切下1mm 左右的厚片,对照HE切片在切下的厚片上选取所需部位,切成1mm3 的小块。2、溶蜡:二甲苯浸泡812h,使石蜡完全溶解,期间 换2次新二甲苯。3、水化:用100%、90%、80%、70%、50%乙醇进行 水化,直到完全水化。4、漂洗:用缓冲液漂洗(0.1M磷酸缓冲液或二甲砷酸 钠缓冲液)后,1%锇酸后固定12h。5、脱水:50%、70%、80%、90%、100%丙酮梯度脱水。6、浸泡包埋同常规方法。

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