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1、动物细胞工程制药本章内容本章内容n n第一节第一节 概述概述n n第二节第二节 动物细胞的形态和生理特征动物细胞的形态和生理特征n n第三节第三节 生产用动物细胞的要求生产用动物细胞的要求n n第四节第四节 动物细胞的培养条件和培养基动物细胞的培养条件和培养基n n第五节第五节 动物细胞培养的基本方法动物细胞培养的基本方法n n第六节第六节 动物细胞大量培养的方法和操作方式动物细胞大量培养的方法和操作方式n n第七节第七节 动物细胞生物反应器动物细胞生物反应器n n第八节第八节 动物细胞产品的纯化方法和质量要求动物细胞产品的纯化方法和质量要求n n第九节第九节 动物细胞产品的制造实例动物细胞产
2、品的制造实例n n第十节第十节 动物细胞制药的前景和展望动物细胞制药的前景和展望第一节第一节 概述概述n n细胞工程是以细胞为单位，按人们的意志，应用细细胞工程是以细胞为单位，按人们的意志，应用细细胞工程是以细胞为单位，按人们的意志，应用细细胞工程是以细胞为单位，按人们的意志，应用细胞生物学、分子生物学等理论和技术，有目的地胞生物学、分子生物学等理论和技术，有目的地胞生物学、分子生物学等理论和技术，有目的地胞生物学、分子生物学等理论和技术，有目的地进行精心设计，精心操作，使细胞的某些遗传特进行精心设计，精心操作，使细胞的某些遗传特进行精心设计，精心操作，使细胞的某些遗传特进行精心设计，精心操作
3、，使细胞的某些遗传特性发生改变，从而达到改良或产生新品种的目的，性发生改变，从而达到改良或产生新品种的目的，性发生改变，从而达到改良或产生新品种的目的，性发生改变，从而达到改良或产生新品种的目的，以及使细胞增加或重新获得产生某种特定产物的以及使细胞增加或重新获得产生某种特定产物的以及使细胞增加或重新获得产生某种特定产物的以及使细胞增加或重新获得产生某种特定产物的能力，从而在离体条件下进行大量培养、增殖，能力，从而在离体条件下进行大量培养、增殖，能力，从而在离体条件下进行大量培养、增殖，能力，从而在离体条件下进行大量培养、增殖，并提取出对人类有用的产品。并提取出对人类有用的产品。并提取出对人类有
4、用的产品。并提取出对人类有用的产品。细胞工程的研究内容：细胞工程的研究内容：真核细胞的基因重组、导入、扩增和表达的理论和技术，细胞融合的理论和技术，细胞器特别是细胞核移植的理论和技术，染色体改造的理论和技术，转基因动植物的理论和技术，细胞大量培养的理论和技术，以及将有关产物提取纯化的理论和技术。类型类型类型类型产物产物产物产物人疫苗人疫苗人疫苗人疫苗小儿麻痹症、狂犬、风疹、脑炎、乙肝表面抗源、疱症、小儿麻痹症、狂犬、风疹、脑炎、乙肝表面抗源、疱症、小儿麻痹症、狂犬、风疹、脑炎、乙肝表面抗源、疱症、小儿麻痹症、狂犬、风疹、脑炎、乙肝表面抗源、疱症、某些癌症某些癌症某些癌症某些癌症动物疫苗动物疫苗
5、动物疫苗动物疫苗口蹄疫、鸡痘病、猪霍乱、马脑炎、牛痢疾、犬瘟、草口蹄疫、鸡痘病、猪霍乱、马脑炎、牛痢疾、犬瘟、草口蹄疫、鸡痘病、猪霍乱、马脑炎、牛痢疾、犬瘟、草口蹄疫、鸡痘病、猪霍乱、马脑炎、牛痢疾、犬瘟、草鱼出血病、犬瘟病鱼出血病、犬瘟病鱼出血病、犬瘟病鱼出血病、犬瘟病酶酶酶酶尿激酶、细胞色素尿激酶、细胞色素尿激酶、细胞色素尿激酶、细胞色素P450P450、胃蛋白酶、胰蛋白酶、纤维胃蛋白酶、胰蛋白酶、纤维胃蛋白酶、胰蛋白酶、纤维胃蛋白酶、胰蛋白酶、纤维蛋白溶酶原激活剂、胶原酶、酪氨酸脱羧酶蛋白溶酶原激活剂、胶原酶、酪氨酸脱羧酶蛋白溶酶原激活剂、胶原酶、酪氨酸脱羧酶蛋白溶酶原激活剂、胶原酶、酪
6、氨酸脱羧酶激素激素激素激素促红细胞生成素、促间质细胞激素、绒膜促性腺激素、促红细胞生成素、促间质细胞激素、绒膜促性腺激素、促红细胞生成素、促间质细胞激素、绒膜促性腺激素、促红细胞生成素、促间质细胞激素、绒膜促性腺激素、促黄体激素、促滤泡激素、生长激素促黄体激素、促滤泡激素、生长激素促黄体激素、促滤泡激素、生长激素促黄体激素、促滤泡激素、生长激素免疫调节因免疫调节因免疫调节因免疫调节因子子子子白细胞活化因子、转移抑制因子、胸腺素、白细胞介素、白细胞活化因子、转移抑制因子、胸腺素、白细胞介素、白细胞活化因子、转移抑制因子、胸腺素、白细胞介素、白细胞活化因子、转移抑制因子、胸腺素、白细胞介素、干扰素
7、、血清胸腺因子、巨噬细胞毒力因子、干扰素、血清胸腺因子、巨噬细胞毒力因子、干扰素、血清胸腺因子、巨噬细胞毒力因子、干扰素、血清胸腺因子、巨噬细胞毒力因子、-细胞生细胞生细胞生细胞生长因子长因子长因子长因子动物细胞工程培养的产物第二节第二节 动物细胞的形态和生理特征动物细胞的形态和生理特征一、动物细胞的形态n n动物细胞的结构较原核细胞复杂得多n n各种细胞有明确的分工n n形态各异原核细胞与真核细胞之区别原核细胞与真核细胞之区别原核细胞原核细胞真核细胞真核细胞细胞大小细胞大小较小较小 较大较大细胞核细胞核无成形的细胞核，拟无成形的细胞核，拟核，无核膜，核仁核，无核膜，核仁有真正的细胞核，有真正
8、的细胞核，有核膜、核仁有核膜、核仁细胞质细胞质除核糖体无其它细胞除核糖体无其它细胞器器有各种细胞器有各种细胞器细胞壁细胞壁有有植物、真菌有，动植物、真菌有，动物细胞无物细胞无代表生物代表生物细菌、放线菌细菌、放线菌真菌、植物、动物真菌、植物、动物通常将离体培养的细胞分为两类n n贴壁细胞（贴壁依赖型）n n悬浮细胞（非贴壁依赖型）1.贴壁细胞n n细胞的生长必须有可以贴附的支持物表面，细胞依靠自身分泌的或培养基中提供的贴附因子才能在该表面上生长、增殖。n n常见两种细胞形态：n n成纤维细胞型n n上皮细胞型2.悬浮细胞n n这类细胞的生长不依赖支持物表面，可在这类细胞的生长不依赖支持物表面，
9、可在培养液中呈悬浮状态生长，如血液的淋巴培养液中呈悬浮状态生长，如血液的淋巴细胞和用以生产干扰素的细胞和用以生产干扰素的Namalwa细胞细胞等。等。n n细胞呈圆形。细胞呈圆形。3.兼性帖壁细胞兼性帖壁细胞n n有些细胞不严格依赖支持物，它们既可以贴附于支持物表面生长；一定条件下，也可以在培养基中呈悬浮状态良好地生长。如中国仓鼠卵巢细胞（CHO细细胞胞）、小小鼠鼠L929细胞。细胞。二、二、动物细胞的化学组成和代谢n n动物细胞的化学组成动物细胞的化学组成动物细胞的化学组成动物细胞的化学组成 无机成分：水、无机盐无机成分：水、无机盐无机成分：水、无机盐无机成分：水、无机盐 有机成分：蛋白质、
10、糖类、脂类、核酸有机成分：蛋白质、糖类、脂类、核酸有机成分：蛋白质、糖类、脂类、核酸有机成分：蛋白质、糖类、脂类、核酸n n动物细胞的代谢动物细胞的代谢动物细胞的代谢动物细胞的代谢 糖，脂肪和蛋白质的代谢分为三个降解阶段糖，脂肪和蛋白质的代谢分为三个降解阶段糖，脂肪和蛋白质的代谢分为三个降解阶段糖，脂肪和蛋白质的代谢分为三个降解阶段（大分子降解为小分子，小分子代谢产生三个主要（大分子降解为小分子，小分子代谢产生三个主要（大分子降解为小分子，小分子代谢产生三个主要（大分子降解为小分子，小分子代谢产生三个主要的中间产物，中间产物进入三羧酸循环）的中间产物，中间产物进入三羧酸循环）的中间产物，中间产
11、物进入三羧酸循环）的中间产物，中间产物进入三羧酸循环）三、三、动物细胞的生理特点n n1.细胞的细胞的分裂周期长分裂周期长：一般：一般1248 hn n大肠杆菌：大肠杆菌：20 minn n酵母：酵母：2 hn n2.细胞生长需贴附于基质，并有接触抑制现象:除少数细胞可悬浮培养外，大多数正常二倍体细胞的生长都需要在一定的基质（玻璃、塑料等）上贴附，伸展后才能生长增殖。n n接触抑制：当细胞在基质上分裂增殖，逐渐汇合成片时，即每个细胞与其周围细胞相互接触时，细胞就停止增殖。此时若保持充足的营养，细胞仍可存活一段时间，但细胞密度不再增加n n3.3.正常二倍体细胞的生长寿命是有限的正常二倍体细胞的
12、生长寿命是有限的:时间长时间长短决定于细胞来源的种族和年龄短决定于细胞来源的种族和年龄n n当细胞离体培养开始，称为当细胞离体培养开始，称为原代培养原代培养。原代培。原代培养细胞经传代后成为养细胞经传代后成为有限细胞系有限细胞系，此时即使培，此时即使培养条件都很理想，大多数细胞也只能生长有限养条件都很理想，大多数细胞也只能生长有限时间，经若干传代后会逐渐死亡，一般不超过时间，经若干传代后会逐渐死亡，一般不超过5050代。当细胞突变为异倍体后，该细胞可转变代。当细胞突变为异倍体后，该细胞可转变成成无限细胞系无限细胞系，或称连续细胞系，此时细胞的，或称连续细胞系，此时细胞的寿命是无限的。寿命是无限
13、的。n4.动物细胞对周围环境十分敏感动物细胞对周围环境十分敏感对对理理化化因因素素敏敏感感：如如渗渗透透压压、pH、离离子子强度、剪切力、微量元素等。强度、剪切力、微量元素等。由细胞膜结构决定。由细胞膜结构决定。n5.动物细胞对培养基的要求高动物细胞对培养基的要求高n n动动物物细细胞胞：要要求求非非常常高高！12种必需氨基酸、8种以上的维生素、多种无机盐和微量元素、作为主要碳原的葡萄糖以及多种细胞生长因子和贴附因子，而且不同种类要求又有变化。n n6.动物细胞蛋白的合成途径和修饰功能与细菌不同细菌蛋白质合成部位？动物蛋白质合成部位？为什么有糖基化？核糖体 高尔基体 内质网n n动物细胞蛋白质
14、合成部位既在游离的核糖体上合成（细胞质基质蛋白），又在糙面内质网的核糖体上合成（分泌性的和膜中的融合蛋白），多数为糖蛋白。糖链加接：内质网或高尔基体中。蛋白质的糖基化与细胞功能密切相关。总结：动物细胞的生理特点n n细胞分裂周期长细胞分裂周期长n n细胞生长需贴附基质，存在接触抑制细胞生长需贴附基质，存在接触抑制n n正常二倍体细胞生长寿命有限正常二倍体细胞生长寿命有限n n动物细胞对周围环境十分敏感，培养难度大动物细胞对周围环境十分敏感，培养难度大n n动物细胞对培养基要求高动物细胞对培养基要求高n n动物细胞蛋白质合成途径和修饰功能与细菌动物细胞蛋白质合成途径和修饰功能与细菌不同不同动物细
15、胞生产药物动物细胞生产药物缺点：缺点：缺点：缺点：培养条件高、成本贵、产量低培养条件高、成本贵、产量低培养条件高、成本贵、产量低培养条件高、成本贵、产量低优优优优点点点点：分分分分泌泌泌泌胞胞胞胞外外外外、收收收收集集集集纯纯纯纯化化化化方方方方便便便便，翻翻翻翻译译译译后后后后修修修修饰饰饰饰（糖糖糖糖基基基基化化化化），与与与与天天天天然然然然产产产产品品品品一一一一致致致致，更更更更适适适适合合合合临临临临床床床床使使使使 用。用。用。用。动物细胞来源的生物药物比例越来越大！动物细胞来源的生物药物比例越来越大！动物细胞来源的生物药物比例越来越大！动物细胞来源的生物药物比例越来越大！第三节
16、第三节 生产用动物细胞的要求和获得生产用动物细胞的要求和获得一、生产用动物细胞的要求一、生产用动物细胞的要求二、生产用动物细胞的获得二、生产用动物细胞的获得三、基因工程细胞的构建和筛选三、基因工程细胞的构建和筛选四、常用生产用动物细胞的特性四、常用生产用动物细胞的特性五、细胞库的建立五、细胞库的建立一、生产用动物细胞的要求什么样的细胞可以允许用以生产人用的药品？正常组织中分离的原代细胞：鸡胚细胞、兔肾细胞只要是二倍体细胞，即使经过多次传代，如WI-38，2BS细胞异倍体传代细胞生产重组基因产品异倍体传代细胞生产重组基因产品担心异倍体细胞的核酸会影响到人的正常染色体按照按照FDA对细胞株的要求对
17、细胞株的要求严格控制最终产品中控制最终产品中DNA残留量残留量二、生产用动物细胞的获得n n用于生产的动物细胞：原代细胞已建立的二倍体细胞系可无限期传代的转化细胞系用这些细胞进行融合和重组的工程细胞系1.原代细胞n n直接取自动物组织、器官，经过粉碎、消化而获得的细胞悬液（109/g）。如鸡胚细胞、原代兔肾细胞或鼠肾细胞、淋巴细胞等。n n用原代细胞生产生物制品常需要大量的动物，费钱费力。2.二倍体细胞系n n原代细胞经过传代、筛选、克隆，从多种细胞成分的组织中挑选并纯化出某种具有一定特征的细胞株。n n由于该类细胞寿命有限，一般从动物的胚胎组织中获取。如WI-38、MRC-5、2BS等曾广泛
18、用于生产。二倍体细胞系有正常细胞的特点n n染色体组型是2n核型n n贴壁依赖、接触抑制n n可传代培养50代n n无致瘤性3.转化细胞系n通通过过某某个个转转化化过过程程形形成成，常常常常由由于于染染色色体体的的断断裂裂变变成成了了异异倍倍体体，失失去去了了正正常常细细胞胞的的特特点点，获获得了无限增殖的能力。得了无限增殖的能力。n转转化化过过程程可可以以是是自自发发的的、人人为为的的（SV40SV40病病毒毒、化化学学试试剂剂）。也也可可从从直直接接从从动动物物的的肿肿瘤瘤组组织织中中建立。建立。n n转化细胞系具有无限生命力，常常倍增时间较短，对培养条件和生长因子等要求较低，更适于大规模
19、工业化生产。如Namalwa、CHO、BHK-21、Vero细胞等。n n中国尚未成立细胞保存中心，细胞分散保存在各研究所。4.融合细胞系n n细细胞胞融融合合：指指两两个个或或两两个个以以上上的的细细胞胞合合并并成成一一个个细细胞的过程。胞的过程。各种融合：动物与动物；动物与植物；植物与植物。各种融合：动物与动物；动物与植物；植物与植物。正正常常情情况况下下，两两个个接接触触的的细细胞胞不不融融合合。在在特特定定诱诱导导物物作作用用下下，细细胞胞膜膜会会发发生生一一定定变变化化，导导致致两两个个或或多多个细胞的融合。个细胞的融合。细胞融合方法（诱导法）n n仙台病毒融合法：已很少使用n n聚
20、乙二醇融合法：目前主要用于产生单克隆抗体的杂交瘤细胞的制备细胞融合方法（物理法）n n电融合法：细胞在短时间的电场作用下，细胞膜发生可逆性的电击穿，而使相邻细胞的细胞膜相互发生继发性融合。优点：操作简单（电融合仪），无化学毒性、对细胞损伤小、融合同步、融合率高，可在显微镜下直接观察。已成功用于多种细胞的融合。5.重组工程细胞系n n采用基因工程的手段构建各种工程细胞。n n总结：原代细胞、二倍体细胞、转化细胞系仍用于生产中，但生产中采用更多的、更有前景的是融合细胞和重组工程细胞。三、基因工程细胞的构建和筛选1、真核细胞基因表达载体的构建2、基因载体的导入和高效表达工程 细胞株的筛选 1、真核细
21、胞基因表达载体的构建真核细胞基因表达载体的构建病毒载体：如牛痘病毒、腺病毒、反转录病毒和杆状病毒等。质粒载体：穿梭质粒载体(在细菌和哺乳动物细胞中都能扩增)。先在细菌中构建好重组质粒，再将其转入动物细胞。杆状病毒载体n n杆状病毒表达系统是目前国内外十分推崇的真核表达载体。n n文献统计，已有1000 余种外源基因在昆虫杆状病毒表达系统中得到了成功地表达。病毒侵染机理昆虫杆状病毒表达系统表达过程杆状病毒载体n n杆状病毒表达系统是目前国内外十分推崇的真核表达载体。n n文献统计，已有1000 余种外源基因在昆虫杆状病毒表达系统中得到了成功地表达。病毒侵染机理昆虫杆状病毒表达系统表达过程昆虫杆状
22、病毒表达系统表达过程n n外源基因与病毒DNA重组，获得重组病毒n n重组病毒感染细胞，重组DNA进入细胞n n外源基因随病毒复制而表达杆状病毒载体n n杆状病毒表达系统是目前国内外十分推崇的真核表达载体。n n文献统计，已有1000 余种外源基因在昆虫杆状病毒表达系统中得到了成功地表达。病毒侵染机理昆虫杆状病毒表达系统表达过程杆状病毒作载体的优点该病毒基因组是双链该病毒基因组是双链DNADNA，容易进行重组；，容易进行重组；插入插入78kb78kb的的DNADNA不影响正常病毒粒子的形成；不影响正常病毒粒子的形成；多多角角体体蛋蛋白白和和病病毒毒粒粒子子的的形形成成无无直直接接关关系系，因因
23、此此用用外外源源基基因因更更换换多多角角体体蛋蛋白白基基因因，仍仍能能形形成成有有感感染染力力的的病病毒毒粒粒子；子；多多角角体体蛋蛋白白基基因因有有非非常常强强的的启启动动子子，产产生生的的蛋蛋白白质质可可占占全部蛋白质的全部蛋白质的2030%2030%；用用光光学学显显微微镜镜可可看看到到多多角角体体，容容易易以以此此为为标标记记物物来来挑挑选选阳性克隆（多角体被替代后看不到）；阳性克隆（多角体被替代后看不到）；如果用家蚕杆状病毒，还可在蚕体直接表达外源基因如果用家蚕杆状病毒，还可在蚕体直接表达外源基因。穿梭质粒载体一般含有如下基本成分允许载体在细菌体内扩增的质粒序列。允许载体在细菌体内扩
24、增的质粒序列。含有能使基因转录表达的调控元件。含有能使基因转录表达的调控元件。能用以筛选出外源基因已整合的选择标记能用以筛选出外源基因已整合的选择标记。有时还带有选择性增加拷贝数的扩增系统有时还带有选择性增加拷贝数的扩增系统。选择标记有两种n n仅适用于密切相关的突变细胞株，如标记基因hgprt和tk，分别只适用于hgprt-和tk-基因缺失的细胞株。n n显性作用基因，如neo，它能使抗生素-新霉素失活，从而使原来对新霉素敏感的哺乳动物细胞一旦获得该基因的载体后，就能在含该抗生素的培养基中存活。穿梭质粒载体一般含有如下基本成分允许载体在细菌体内扩增的质粒序列。允许载体在细菌体内扩增的质粒序列
25、。含有能使基因转录表达的调控元件。含有能使基因转录表达的调控元件。能用以筛选出外源基因已整合的选择标记能用以筛选出外源基因已整合的选择标记。有时还带有选择性增加拷贝数的扩增系统有时还带有选择性增加拷贝数的扩增系统。选择性增加拷贝数的扩增系统n n最常用编码二氢叶酸还原酶（DHFR）的基 因。DHFR的 扩 增 可 防 止 氨 甲 蝶 呤（MTX）对细胞的毒害作用。将DHFR的基因与目的基因一起构建到载体中，当在培养基内增加MTX浓度时，就会促使DHFR基因的扩增，同时也会使毗邻的目的基因随之扩增，从而提高表达量。穿梭质粒载体一般含有如下基本成分允许载体在细菌体内扩增的质粒序列。允许载体在细菌体
26、内扩增的质粒序列。含有能使基因转录表达的调控元件。含有能使基因转录表达的调控元件。能用以筛选出外源基因已整合的选择标记能用以筛选出外源基因已整合的选择标记。有时还带有选择性增加拷贝数的扩增系统有时还带有选择性增加拷贝数的扩增系统。2、基因载体的导入和高效表达工程细胞株的筛选DNA导入动物细胞的常用方法 融合法融合法 化学法化学法 物理法物理法 病毒法病毒法细胞融合法细胞融合法 DNA-磷酸钙沉淀法磷酸钙沉淀法 电穿孔法电穿孔法 重组逆转录病毒介导法重组逆转录病毒介导法 脂质体介导法脂质体介导法 DEAE-葡聚糖法葡聚糖法 显微注射法显微注射法 重组重组DNA病毒病毒介导法介导法 原生质融合法原
27、生质融合法 染色体介导法染色体介导法 基因枪法基因枪法 多瘤病毒样颗粒多瘤病毒样颗粒介导法介导法 微细胞介导法微细胞介导法鬼影红细胞介导法鬼影红细胞介导法最普遍的两种方法a.磷酸钙沉淀法磷酸钙沉淀法磷酸钙沉淀法磷酸钙沉淀法：将溶解的：将溶解的：将溶解的：将溶解的DNADNA加在加在加在加在NaNa2 2HPOHPO4 4中，逐渐加入中，逐渐加入中，逐渐加入中，逐渐加入CaClCaCl2 2溶液溶液溶液溶液，当当当当 NaNa2 2HPOHPO4 4和和和和CaClCaCl2 2形成形成形成形成沉淀，沉淀，沉淀，沉淀，DNADNA包裹在沉淀中，形成包裹在沉淀中，形成包裹在沉淀中，形成包裹在沉淀中
28、，形成DNA-DNA-磷酸钙共沉磷酸钙共沉磷酸钙共沉磷酸钙共沉淀物，当沉淀物与细胞表面接触时，通过吞噬作用淀物，当沉淀物与细胞表面接触时，通过吞噬作用淀物，当沉淀物与细胞表面接触时，通过吞噬作用淀物，当沉淀物与细胞表面接触时，通过吞噬作用将将将将DNADNA导入胞内。导入胞内。导入胞内。导入胞内。优点：方法简单，可进行共转化优点：方法简单，可进行共转化优点：方法简单，可进行共转化优点：方法简单，可进行共转化b.电穿孔法：借助电穿孔仪产生的高压脉冲电场，使细胞膜出现瞬时可逆性的小孔，外源DNA沿小孔进入细胞。特点：转化效率较高，但进入的DNA拷贝数较低如何筛选工程细胞？a.依靠构建载体内的选择标
29、记采用相应的筛选系依靠构建载体内的选择标记采用相应的筛选系统：统：如用如用HATHAT（次黄嘌呤、氨基喋呤、胸腺嘧啶）（次黄嘌呤、氨基喋呤、胸腺嘧啶）选择系统，筛选选择系统，筛选tk tk+、hgprthgprt+的转化细胞；用的转化细胞；用G418G418（GeneticinGeneticin）选择系统，筛选）选择系统，筛选neoneor r的转化细胞的转化细胞。b.对选出的细胞进行克隆和亚克隆使其纯化。对选出的细胞进行克隆和亚克隆使其纯化。c.利利用用扩扩增增系系统统，不不断断增增加加其其基基因因拷拷贝贝数数，获获得得高效表达而稳定的工程细胞株。高效表达而稳定的工程细胞株。外源基因导入动物
30、细胞的效率很低！四、常用生产用细胞的特性n nCHOCHO细细胞胞：中中国国仓仓鼠鼠卵卵巢巢上上皮皮样样细细胞胞。用用于于构构建重组工程细胞系。建重组工程细胞系。最为成熟和普遍表达糖基化蛋白药物的细胞。最为成熟和普遍表达糖基化蛋白药物的细胞。n nCOSCOS细胞：广泛用于细胞：广泛用于瞬时表达系统瞬时表达系统。n nSP2/0-Ag14SP2/0-Ag14：用用于于单单克克隆隆抗抗体体杂杂交交瘤瘤细细胞胞的的制制备和抗体的生产。备和抗体的生产。n nBHK-21BHK-21细胞，细胞，VeroVero细胞，细胞，NamalwaNamalwa细胞等。细胞等。五、细胞库的建立n n用用于于生生产
31、产的的细细胞胞（除除原原代代细细胞胞外外）必必须须建建立立两个细胞库：两个细胞库：1.原始细胞库原始细胞库（master cell bank，MCB）2.生生产产用用细细胞胞库库（manugactures working cell bank，MWCB),),或或称称工工作作细细胞胞库库（working cell bank，WCB)。n n原原原原始始始始细细细细胞胞胞胞库库库库是是是是单单单单一一一一来来来来源源源源的的的的均均均均质质质质的的的的细细细细胞胞胞胞，对对对对于于于于二二二二倍倍倍倍体体体体细细细细胞胞胞胞应应应应该该该该是是是是群群群群体体体体倍倍倍倍增增增增水水水水平平平平尽
32、尽尽尽可可可可能能能能低低低低的的的的细细细细胞胞胞胞。贮存时须有该细胞的详细档案，包括：贮存时须有该细胞的详细档案，包括：贮存时须有该细胞的详细档案，包括：贮存时须有该细胞的详细档案，包括：该该该该细细细细胞胞胞胞系系系系的的的的历历历历史史史史：来来来来源源源源、年年年年龄龄龄龄和和和和性性性性别别别别、细细细细胞胞胞胞分分分分离的方法、所用的培养材料等；离的方法、所用的培养材料等；离的方法、所用的培养材料等；离的方法、所用的培养材料等；该该该该细细细细胞胞胞胞系系系系的的的的特特特特性性性性：形形形形态态态态、生生生生长长长长的的的的特特特特性性性性、种种种种源源源源的的的的特性等；特性
33、等；特性等；特性等；对各种有害因子检查的结果。对各种有害因子检查的结果。对各种有害因子检查的结果。对各种有害因子检查的结果。n n生生产产用用细细胞胞库库：从从原原始始细细胞胞库库来来，或或从从单单一一安安瓿瓿来来，或或从从多多个个安安瓿瓿在在融融化化即即刻刻混混合合在在一一起起的的，然然后后经经培培养养扩扩增增到到一一定定数数量量后后，再再分分装装储储存存形形成成的的细胞库细胞库。生生产产用用细细胞胞库库也也必必须须建建立立档档案案，而而且且需需要要进进行行无无菌菌性性和和无无细细胞胞交交叉叉污污染染的的检检查查，生生产产时时需需确确定定其其最高使用的传代数。最高使用的传代数。第四节 动物细
34、胞的培养条件和培养基n n培养成功必备条件：培养成功必备条件：培养成功必备条件：培养成功必备条件：所所所所 有有有有 与与与与 细细细细 胞胞胞胞 接接接接 触触触触 的的的的 设设设设 备备备备、器器器器 材材材材 和和和和 溶溶溶溶 液液液液，都都都都 必必必必 须须须须 保保保保 持持持持 绝对无菌，避免细胞外微生物的污染绝对无菌，避免细胞外微生物的污染绝对无菌，避免细胞外微生物的污染绝对无菌，避免细胞外微生物的污染必必必必须须须须有有有有足足足足够够够够的的的的营营营营养养养养供供供供应应应应，绝绝绝绝对对对对不不不不可可可可有有有有有有有有害害害害的的的的物物物物质质质质，避避避避免
35、免免免即使是极微量的有害离子的掺入即使是极微量的有害离子的掺入即使是极微量的有害离子的掺入即使是极微量的有害离子的掺入保证有适量的氧气供应保证有适量的氧气供应保证有适量的氧气供应保证有适量的氧气供应需要随时清除细胞代谢中产生的有害产物需要随时清除细胞代谢中产生的有害产物需要随时清除细胞代谢中产生的有害产物需要随时清除细胞代谢中产生的有害产物有有有有良良良良好好好好的的的的适适适适于于于于生生生生存存存存的的的的外外外外界界界界环环环环境境境境，如如如如pHpH、渗渗渗渗透透透透压压压压、离离离离子子子子浓度等浓度等浓度等浓度等及时分种，保持合适的细胞密度及时分种，保持合适的细胞密度及时分种，保
36、持合适的细胞密度及时分种，保持合适的细胞密度一、动物细胞的培养条件1.器材的清洗和消毒器材的清洗和消毒2.水质水质3.pH4.渗透压渗透压5.温度温度6.空气空气1.器材的清洗和消毒（1 1）器材的清洗：）器材的清洗：）器材的清洗：）器材的清洗：a.a.浸泡（浸泡（浸泡（浸泡（3%3%磷酸三钠）磷酸三钠）磷酸三钠）磷酸三钠）b.b.刷洗刷洗刷洗刷洗c.c.泡酸（重铬酸钾、硫酸、水）泡酸（重铬酸钾、硫酸、水）泡酸（重铬酸钾、硫酸、水）泡酸（重铬酸钾、硫酸、水）d.d.冲洗（自来水、蒸馏水、去离子水）冲洗（自来水、蒸馏水、去离子水）冲洗（自来水、蒸馏水、去离子水）冲洗（自来水、蒸馏水、去离子水）（
37、2 2）器材的消毒灭菌：）器材的消毒灭菌：）器材的消毒灭菌：）器材的消毒灭菌：物理方法物理方法物理方法物理方法：如紫外线、干热、湿热、过滤：如紫外线、干热、湿热、过滤：如紫外线、干热、湿热、过滤：如紫外线、干热、湿热、过滤 化学方法化学方法化学方法化学方法：如化学消毒剂、抗生素：如化学消毒剂、抗生素：如化学消毒剂、抗生素：如化学消毒剂、抗生素细胞培养成功与否的重要环节之一：去除任何影响细胞生长的有害因子，防止外来微生物的污染。2.水质n n细胞培养的水必须进行特殊的处理，才能使细胞培养的水必须进行特殊的处理，才能使用。用。除去微生物、有毒元素、金属离子、热原质除去微生物、有毒元素、金属离子、热
38、原质当前当前处理水质的方法处理水质的方法有：蒸馏、离子交换、有：蒸馏、离子交换、电渗透、反渗透、中空纤维过滤等电渗透、反渗透、中空纤维过滤等3.pHn n动动物物细细胞胞培培养养的的最最适适pH为为7.27.4，低低于于6.8或或高高于于7.6会会对对细细胞胞产产生生不不利利影影响响，严严重时可引起细胞退变甚至死亡。重时可引起细胞退变甚至死亡。培培养养基基应应具具有有一一定定的的缓缓冲冲能能力力，必必须须加加入入缓缓冲冲系系统统：如如HEPES、Na2HPO4/NaH2PO4缓缓冲冲系系统统、NaHCO3/CO2缓缓冲冲系统等。系统等。4.渗透压n n动动动动物物物物细细细细胞胞胞胞缺缺缺缺乏
39、乏乏乏细细细细胞胞胞胞壁壁壁壁，外外外外界界界界渗渗渗渗透透透透压压压压的的的的高高高高低低低低波波波波动动动动对对对对细胞存活有很大影响。细胞存活有很大影响。细胞存活有很大影响。细胞存活有很大影响。最理想的渗透压为最理想的渗透压为最理想的渗透压为最理想的渗透压为290300mOsm/kg290300mOsm/kg为为为为调调调调整整整整培培培培养养养养液液液液的的的的渗渗渗渗透透透透压压压压，一一一一般般般般采采采采用用用用加加加加减减减减NaClNaCl的的的的方方方方法：法：法：法：1mg/ml NaCl-32mOsm/kg1mg/ml NaCl-32mOsm/kg在在在在细细细细胞胞胞
40、胞培培培培养养养养操操操操作作作作中中中中，为为为为保保保保持持持持合合合合适适适适的的的的渗渗渗渗透透透透压压压压和和和和pHpH，一一一一般般般般都都都都使使使使用用用用平平平平衡衡衡衡盐盐盐盐溶溶溶溶液液液液（BBSBBS），由由由由无无无无机机机机盐盐盐盐和和和和葡葡葡葡萄糖组成。萄糖组成。萄糖组成。萄糖组成。5.温度n n动物细胞最佳培养温度动物细胞最佳培养温度：370.5n n昆虫细胞最佳培养温度昆虫细胞最佳培养温度：27 n n温度过高：细胞退变甚至死亡温度过高：细胞退变甚至死亡n n温度过低：降低代谢和生长速度，影响温度过低：降低代谢和生长速度，影响产量产量6.空气n n方瓶和
41、转瓶培养时，保持瓶内有足够的方瓶和转瓶培养时，保持瓶内有足够的空间，即培养的液体量不超过总体积的空间，即培养的液体量不超过总体积的30%。n n采用生物反应器需通气，采用不同比例采用生物反应器需通气，采用不同比例的的O2、N2、CO2和空气。和空气。二、动物细胞培养基的种类和组成n天然培养基n合成培养基n无血清培养基动物细胞对培养基的要求较高，且随着细胞的种系不同有较大差异。1.天然培养基n n指指指指来来来来自自自自动动动动物物物物体体体体液液液液或或或或利利利利用用用用组组组组织织织织分分分分离离离离提提提提取取取取的的的的一一一一类类类类培培培培养养养养基基基基，如如如如血血血血浆浆浆浆
42、凝凝凝凝块块块块、血血血血清清清清、淋淋淋淋巴巴巴巴液液液液、胚胚胚胚胎胎胎胎浸浸浸浸液液液液以及羊水、腹水等。以及羊水、腹水等。以及羊水、腹水等。以及羊水、腹水等。缺缺缺缺点点点点：成成成成分分分分复复复复杂杂杂杂，制制制制作作作作过过过过程程程程复复复复杂杂杂杂，组组组组分分分分不不不不稳稳稳稳定定定定，批批批批间间间间差差差差异异异异大大大大，来来来来源源源源有有有有限限限限，不不不不适适适适于于于于大大大大量量量量培培培培养养养养和和和和生生生生产的需要，逐渐为合成培养基所替代。产的需要，逐渐为合成培养基所替代。产的需要，逐渐为合成培养基所替代。产的需要，逐渐为合成培养基所替代。n n
43、用成分明确的化学试剂配制成的培养基。用成分明确的化学试剂配制成的培养基。用成分明确的化学试剂配制成的培养基。用成分明确的化学试剂配制成的培养基。优点：成分明确，组分稳定，可大量生产供应优点：成分明确，组分稳定，可大量生产供应优点：成分明确，组分稳定，可大量生产供应优点：成分明确，组分稳定，可大量生产供应其组成大致如下：其组成大致如下：其组成大致如下：其组成大致如下：1.1.2.合成培养基n n氨基酸：氨基酸：氨基酸：氨基酸：是细胞合成蛋白质的原料。所有细胞都需要是细胞合成蛋白质的原料。所有细胞都需要是细胞合成蛋白质的原料。所有细胞都需要是细胞合成蛋白质的原料。所有细胞都需要1212种必需氨基酸
44、：缬、亮、异亮、苏、赖、色、苯丙、种必需氨基酸：缬、亮、异亮、苏、赖、色、苯丙、种必需氨基酸：缬、亮、异亮、苏、赖、色、苯丙、种必需氨基酸：缬、亮、异亮、苏、赖、色、苯丙、蛋、组、酪、精、胱。蛋、组、酪、精、胱。蛋、组、酪、精、胱。蛋、组、酪、精、胱。此外谷氨酰胺是所有细胞重要的碳源和能源。此外谷氨酰胺是所有细胞重要的碳源和能源。此外谷氨酰胺是所有细胞重要的碳源和能源。此外谷氨酰胺是所有细胞重要的碳源和能源。目前商品合成培养基中含氨基酸种类最少的最目前商品合成培养基中含氨基酸种类最少的最目前商品合成培养基中含氨基酸种类最少的最目前商品合成培养基中含氨基酸种类最少的最 含该含该含该含该1313种
45、氨基酸的种氨基酸的种氨基酸的种氨基酸的Eagle MEMEagle MEM培养基。培养基。培养基。培养基。单单纯纯使使用用合合成成培培养养基基，细细胞胞常常常常不不能能很很好好增增殖殖，甚甚至至不不能能贴贴壁壁。因因此此在在使使用用时时常常常常需需要要加加入入一一定定量量的的动动物物血血清清，最最常常用用的的是是5%-10%的的动动物物血血清清。杂杂瘤瘤细细胞胞的的培培养养对对血血清清要要求求更更高高，常常需需10%-20%胎牛血清。胎牛血清。n n维生素维生素维生素维生素n n糖类糖类糖类糖类n n无机盐无机盐无机盐无机盐n n其它成分其它成分其它成分其它成分还需要血清！血清的作用机制提供有
46、利于细胞生长增殖所需的各种生长因子和提供有利于细胞生长增殖所需的各种生长因子和提供有利于细胞生长增殖所需的各种生长因子和提供有利于细胞生长增殖所需的各种生长因子和激素激素激素激素提供有利于细胞贴壁所需的贴附因子和伸展因子提供有利于细胞贴壁所需的贴附因子和伸展因子提供有利于细胞贴壁所需的贴附因子和伸展因子提供有利于细胞贴壁所需的贴附因子和伸展因子提供可识别金属、激素、维生素和脂质的结合蛋提供可识别金属、激素、维生素和脂质的结合蛋提供可识别金属、激素、维生素和脂质的结合蛋提供可识别金属、激素、维生素和脂质的结合蛋白白白白提供细胞生长所必需的脂肪酸和微量元素提供细胞生长所必需的脂肪酸和微量元素提供细
47、胞生长所必需的脂肪酸和微量元素提供细胞生长所必需的脂肪酸和微量元素提供良好的提供良好的提供良好的提供良好的pHpHpHpH缓冲系统缓冲系统缓冲系统缓冲系统n n无血清培养基：合成培养基无血清培养基：合成培养基无血清培养基：合成培养基无血清培养基：合成培养基+不同种类的添加剂不同种类的添加剂不同种类的添加剂不同种类的添加剂添加剂大致有以下几类：添加剂大致有以下几类：添加剂大致有以下几类：添加剂大致有以下几类：1.1.1.1.激素激素激素激素和生长因子和生长因子和生长因子和生长因子：各种激素、生长因子的功能各种激素、生长因子的功能各种激素、生长因子的功能各种激素、生长因子的功能 维持细胞的功能维持
48、细胞的功能维持细胞的功能维持细胞的功能 保持细胞的状态（分化或未分化）保持细胞的状态（分化或未分化）保持细胞的状态（分化或未分化）保持细胞的状态（分化或未分化）使用最多的是使用最多的是使用最多的是使用最多的是胰岛素胰岛素胰岛素胰岛素，促进糖原和脂肪酸，促进糖原和脂肪酸，促进糖原和脂肪酸，促进糖原和脂肪酸的合成的合成的合成的合成，对细，对细，对细，对细胞生长有刺激作用。胞生长有刺激作用。胞生长有刺激作用。胞生长有刺激作用。3.无血清培养基n n结合蛋白结合蛋白：最经常被补充的是：最经常被补充的是铁传递蛋白铁传递蛋白和和白蛋白白蛋白。n n贴附和伸展因子贴附和伸展因子：目前多数无血清培养基只：目前
49、多数无血清培养基只适用于悬浮细胞，真正能用以培养贴壁细胞适用于悬浮细胞，真正能用以培养贴壁细胞的很少，也很贵，原因在于它们均缺少必需的很少，也很贵，原因在于它们均缺少必需的贴附和伸展因子。的贴附和伸展因子。n n其它有利于细胞生长的因子和元素其它有利于细胞生长的因子和元素：它们包：它们包括有消除氧自由基损害的括有消除氧自由基损害的谷胱甘肽谷胱甘肽，某些微某些微量元素量元素，如硒等。，如硒等。无血清培养基的优点：提高了细胞培养的可重复性，避免了由于血清批次提高了细胞培养的可重复性，避免了由于血清批次提高了细胞培养的可重复性，避免了由于血清批次提高了细胞培养的可重复性，避免了由于血清批次之间差异的
50、影响；之间差异的影响；之间差异的影响；之间差异的影响；减少了由血清带来病毒、真菌和支原体等微生物污减少了由血清带来病毒、真菌和支原体等微生物污减少了由血清带来病毒、真菌和支原体等微生物污减少了由血清带来病毒、真菌和支原体等微生物污染的危险；染的危险；染的危险；染的危险；供应充足、稳定；供应充足、稳定；供应充足、稳定；供应充足、稳定；细胞产品容易纯化；细胞产品容易纯化；细胞产品容易纯化；细胞产品容易纯化；避免了血清中某些因素对有些细胞的毒性；避免了血清中某些因素对有些细胞的毒性；避免了血清中某些因素对有些细胞的毒性；避免了血清中某些因素对有些细胞的毒性；减少了血清中蛋白对某些生物测定的干扰，便于