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1、艾滋病常用实验室检测及临床意义分析.1主要内容n HIV抗体检测n CD4检测n 病毒载量检测n 实验室安全防护.2HIV抗体-感染成功抗体转阳诊断艾滋病死亡-4-8周-出现症状 2-10 年 1年 0.5-2年 HIV抗体+无症状有症状HIV抗体+艾滋病感染艾滋病毒后的自然发展过程急性感染期潜伏期发病期艾滋病感染者艾滋病患者窗口期.31 23 4急性感染期.4KINETICS OF VIRAL MARKERS DURING PRIMARY HIV-1 INFECTIONHIV RNAHIV p24 antigenHIV antibodiesHIV感染后血液中核酸、抗原和抗体动态变化窗口期暴露
2、天数检测域.5感染HIV后病毒载量、CD4与病程变化规律.6.7艾滋病实验室分类n 筛查实验室（CD4检测实验室）n 确证实验室（CD4、病毒载量实验室).8 中国HIV实验室网络 国家艾滋病参比实验室 中国CDC性艾中心 艾滋病确认中心实验室 省、市 艾滋病确认实验室 省、市 艾滋病筛查中心实验室 省、市、州、县 艾滋病筛查实验室 省、市、州、县 艾滋病检测点 乡、镇.9HIV实验室条件n 人员:经过专门技术培训,取得培训合格证/上岗证;n 环境:功能分区,符合生物安全二级要求;n 仪器设备:按要求配备，满足检测要求。实验室必须经过资质认证/验收！.10HIV病原体诊断 HIV抗体检测 艾滋
3、病病毒抗原检测（P24）HIV核酸检测 病毒分离.11检测样品n 血清、血浆n 尿液n 抗凝全血（CBC、CD4、VL)n PBMC（外周血淋巴细胞）.12样品的采集和处理 一、样品的采集 最常用的样品是血液，包括血清、血浆和全血(抗凝血)。唾液或尿液有时也可作为测试样品。常用样品的采集方法如下：（一）采集样品应按临床采血技术规范及检测试剂盒要求进行。（二）采集标本时应注意安全，操作应戴双层手套。建议采用真空采血管及蝶形针具，以免直接接触血液。.13（三）血清样品采集：用注射器抽静脉血35ml，室温放置1-2小时，待血液凝固或用3000rpm离心15分钟，吸出血清备用。（四）抗凝血样品采集(免
4、疫功能CD4/CD8测定、血液常规CBC测定、病毒载量）：用加有抗凝剂（K3EDTA）的真空采血管或试管抽取静脉血，反复轻摇，常温6小时以内送达实验室检测CD4/CD8或CBC后，再分离血浆和血细胞备用。.14（五）血清或血浆样品应存放于-20，短期内（1周）进行检测的样品可存放于2-8。（六）用于抗原和核酸检测的血浆和血细胞样品应冻存于-20以下，进行病毒 RNA检测的样品如长期（3个月以上）保存应置于-80。.15二、样品的运送（一）抗体检测实验室间传递的样品应为血清或血浆，血液常规、CD4和病毒载量等要求送抗凝血。样品应置于带盖的试管内，试管上应有明显的标记，标明样品的编号或受检者姓名、
5、种类和采集时间。.16（二）将试管放入专用带盖的容器内，容器的材料要易于消毒处理。在试管的周围应垫有缓冲吸水材料，以免碰碎。如果路程较远或气候炎热，应在2-8条件下运送。抗凝血和抗体检测样品路程短可常温送检。包装内需附有送检单。（三）特殊情况下如需对个别样品进行复测，可以用特快专递形式投寄，但必须将盛样品的试管包扎好，保证不会破碎和溢漏。.17三、样品的接收（一）含有感染性样品的包裹必须在具有处理感染源设备的实验室内由经过培训的工作人员打开，用后的包裹应进行消毒。（二）核对标本与送检单，检查样品管有无破损和溢漏。（三）检查样品的状况，记录有无严重溶血、微生物污染、血脂过多以及黄疸等情况。（四）
6、因特殊临床治疗导致自发荧光的样品不可用于荧光方法测试。.18HIV抗体检测的目的n 诊断 确定个体HIV感染状况，包括临床检测、自愿咨询检测、根据特殊需要进行的体检等。n 血液筛查 防止输血传播HIV，包括献血员筛查和原料血浆筛查。n 监测 了解不同人群HIV感染率及其变化趋势，包括各类高危人群、重点人群和一般人群。.19HIV抗体检测的方法n 筛查试验（包括初筛和复检）：酶联免疫吸附试验（ELISA)、化学发光试验、明胶颗粒凝聚试验（PA）、免疫渗滤试验、免疫层析试验等n 确证试验：免疫印迹试验（WB)、条带免疫试验、放射免疫沉淀试验、免疫荧光试验等。.20艾滋病抗体确证试验 免疫印迹法（W
7、B）为目前最常用的HIV抗体确认方法，被公认为判断HIV感染的黄金方法。.21艾滋病抗体检测试剂使用条件 HIV筛查或确认试剂必须是HIV/1+2混合型，国家卫生部批准或注册，经过国家医药监督管理局批批检合格，临床试剂评估优良，并且在有效期内。.22检测要点1、严格按照试剂说明书操作，不得擅自更改。2、注意防止交叉污染。3、严格遵守实验室操作规程。4、认真做好实验记录。.23HIV抗体检测结果及结论 HIV抗体筛查结果阴性反应可做HIV抗体阴性报告，筛查试验呈阳性反应，可出具“HIV抗体待复查”报告，不能出HIV抗体阳性报告。筛查阳性反应或可疑阳性反应不能作最终报告通知被检测者，对个体诊断来说
8、,只有经过确证试验，结果阳性才可做HIV抗体阳性报告。.24检测程序及流程图1、筛查检测 验收标本，用筛查试剂进行检测，如呈阴性反应，报告HIV抗体阴性；对呈阳性反应的标本，须进行重复检测。2、重复检测 对筛查呈阳性反应的标本用原有试剂和另外一种不同原理或不同厂家的试剂重复检测。.25HIV抗体筛查检测流程样 样 品 品初筛检测 初筛检测筛查试剂 筛查试剂阳性反应 阳性反应阴性反应 阴性反应重复检测 重复检测原有试剂和另外一种不同原理 原有试剂和另外一种不同原理（或厂家）的试剂，或另外两（或厂家）的试剂，或另外两种不同原理或不同厂家的试剂 种不同原理或不同厂家的试剂 一阴一阳 一阴一阳均阴性反
9、应 均阴性反应 均阳性反应 均阳性反应送确认实验室确认 送确认实验室确认报告阴性 报告阴性.26 HIV抗体确证 1、常用的确证实验方法是免疫印迹法（WB）。2、免疫印迹试剂有HIV-1/2混合型和单一型。一般先用HIV-1/2混合型试剂进行检测，如果呈阴性反应，则报告HIV抗体阴性，如果呈阳性反应，则报告HIV-1抗体阳性，如果不满足阳性标准，则判为HIV抗体不确定。如果出现HIV-2型的特异性指示条带，还需要用HIV-2型免疫印迹试剂再做单一的HIV-2型抗体确认试验，呈阴性反应，报告HIV-2抗体阴性；呈阳性反应的则报告HIV-2抗体血清学阳性。.27HIV抗体确证检测流程免疫印迹法（免
10、疫印迹法（WB WB，HIV-1/2 HIV-1/2混合型）混合型）HIV-1 HIV-1阳性反应 阳性反应不确定反应 不确定反应 出现 出现HIV-2 HIV-2指示条带 指示条带报告 报告HIV-1 HIV-1阳性 阳性结合流行病学资料，可以在 结合流行病学资料，可以在4 4周后随访检测，如带型没有进展或呈阴性反应，则报告阴性；如随访期间出现阳性反应，则报 周后随访检测，如带型没有进展或呈阴性反应，则报告阴性；如随访期间出现阳性反应，则报告阳性；如随访期间带型有进展，但不满足阳性标准，应继续随访到 告阳性；如随访期间带型有进展，但不满足阳性标准，应继续随访到8 8周。如带型没有进展或呈阴性
11、反应则报告阴性；满足 周。如带型没有进展或呈阴性反应则报告阴性；满足HIV HIV抗体阳性诊断标准则报告阳性，不满足阳性判断标准可视情况决定是否继续随访。抗体阳性诊断标准则报告阳性，不满足阳性判断标准可视情况决定是否继续随访。阴性反应 阴性反应报告阴性 报告阴性筛查试验阳性反应样品 筛查试验阳性反应样品根据具体情况进一步检测 根据具体情况进一步检测HIV-2 HIV-2.28检测结果的报告和处理 HIV抗体筛查：筛查实验呈阴性反应出具HIV抗体阴性报告，如果近期有高危行为，如性乱、注射毒品等，或有急性流感样症状等情况，为排除“窗口期”的可能，建议23个月以后再做抗体检测。筛查实验呈阳性反应，可
12、出具“HIV抗体待复查”报告，不能出阳性报告。.29HIV抗体筛查呈阳性的处理（1）填写HIV抗体筛查阳性送检单（2）尽可能重新采集受检者的血样。（3）将二份血样（或仅原血样）连同HIV抗体筛查阳性送检单一并送当地艾滋病筛查中心实验室，再转送艾滋病确认实验室，或直接送确认实验室确认。（4）筛查中心实验室应尽快进行复测。（5）做好检测后咨询。.30HIV抗体确证结果报告 1、HIV抗体阳性应出具HIV抗体阳性确认报告，并按相关规定做好咨询、保密和报告工作;2、HIV抗体阴性应出具HIV抗体阴性确认报告，如果近期有高危行为，如性乱、注射毒品等，或有急性流感样症状等情况，为排除“窗口期”的可能，建议
13、1个月以后再做抗体检测;.31抗体确证不确定结果 HIV抗体不确定出具HIV抗体不确定确认报告，在备注中应注明“1个月后复查”。1、随访：每1个月一次，连续2次，共2个月。2、做好检测后咨询。.32全国艾滋病检测技术规范2009版.33全国艾滋病检测技术规范2009版.34.35.36实验室记录要求1、标本的登记 收到标本后，及时登记有关参数，包括受检者姓名或代号、试管编号、性别、年龄、职业、送检单位、人群类别、检验结果、送检日期、报告日期、备注(必要时记录通信地址)等。2、实验原始记录表 应按实验要求，设计操作的原始记录表，标明空白对照、阳性对照、阴性对照、外部对照以及待检样品的位置，便于指
14、导实验人员加样。要注明试剂盒来源、测定方法、批号、有效期、操作人员和复核人员姓名及检测日期。.373、HIV 阳性标本的保存记录 记录HIV阳性标本的储存量、储存温度、储存起始时间以及标本保管人姓名。4、文件存档 实验原始记录表、打印数据、检测记录表、标本登记、标本保存记录以及仪器设备维修和校准记录等都应该妥善存档保存15年以上。最好同时使用计算机保存各种文件和记录。.38HIV感染产妇所生儿童HIV抗体检测策略及流程 适用范围HIV 感染产妇所生婴幼儿；已满18 个月的婴幼儿，其母亲HIV 感染状态不详，儿童出现HIV 相关临床表现，临床怀疑HIV 感染的儿童。.39HIV感染产妇所生儿童H
15、IV抗体检测策略及流程 检测程序及结果报告 婴儿满12个月进行第一次HIV抗体检测。使用两种不同原理或不同厂家筛查试剂进行抗体检测，两种筛查试剂检测结果均为阴性反应，报告“HIV抗体阴性（）”，可排除感染。检测结果出现阳性反应（一种为阴性反应一种为阳性反应或两种均呈阳性反应），不能排除感染，应继续追踪随访，至儿童满18个月时再次进行HIV抗体检测。.40HIV感染产妇所生儿童HIV抗体检测策略及流程 检测程序及结果报告 婴儿满18个月时应再次进行HIV抗体检测。使用两种不同原理或不同厂家筛查试剂进行抗体检测。两种筛查试剂的检测结果均为阴性反应，报告“HIV抗体阴性（）”，可排除感染。检测出现阳
16、性反应（一种为阴性反应一种为阳性反应或两种均呈阳性反应），进一步进行确证试验，根据确证试验的结果判断是否感染HIV。.41HIV感染产妇所生儿童HIV抗体检测策略及流程 检测程序及结果报告 在发放检测报告的同时上报疫情；做好检测后咨询。.42全国艾滋病检测技术规范2009版.43免疫功能（CD4/CD8）的检测.44T淋巴细胞分类 在T淋巴细胞分类中，CD4代表T辅助细胞而CD8代表T抑制细胞和T杀伤细胞。CD4+T淋巴细胞是HIV感染的主要靶细胞，也是免疫反应的中心细胞；CD8+T淋巴细胞是免疫反应的效应细胞。.45T淋巴细胞分类 正常人的CD4+T淋巴细胞约占总的T淋巴细胞的65%，CD8
17、+T淋巴细胞约占35%。人体感染了HIV后，涉及的主要病理过程就是免疫系统的损害，主要表现为：CD4+T淋巴细胞的丢失，绝对数量的减少，同时CD8+T淋巴细胞数量增加，CD4和CD8的比例失调。因此CD4+T淋巴细胞计数作为直接测定免疫功能的方法，是提供HIV感染病人免疫系统损害状况最明确的指标。.46CD4+T淋巴细胞正常值 CD4：410-1590/mm3 CD8：190-1140/mm3 CD4/CD8：1.47CD4+T淋巴细胞计数意义 是艾滋病疾病分期、确定诊断、制定抗病毒治疗和预防机会性感染方案的标准实验室指标，也是与病毒载量相配合预测疾病进程的可靠指标。.48CD4+T淋巴细胞检
18、测意义1、用于HIV感染者的疾病分期：凡CD4+T淋巴细胞200/mm3或CD4+T淋巴细胞的百分比14%的HIV感染者可归入艾滋病。.49CD4+T淋巴细胞检测意义 2、判断HIV感染者的临床合并症（各种机会性感染与CD4+T淋巴细胞的相关性），如CD4+T淋巴细胞200/mm3时，很容易发生卡氏肺囊虫肺炎；而巨细胞病毒感染和鸟分支杆菌感染常发生于CD4+T淋巴细胞50/mm3的病人，极少见于CD4+T淋巴细胞100/mm3的病人。.50CD4+T淋巴细胞检测意义3、帮助确定抗HIV药物治疗及机会性感染预防性治疗的适应症，例如，当CD4+T淋巴细胞200/mm3时，应给予抗卡氏肺囊虫肺炎的预
19、防性治疗；4、抗HIV药物疗效的重要判断指标。.51成人及青少年艾滋病分期标准（美国CDC.1993）CD4200/ul和/或出现艾滋病指征性症状（如卡氏肺囊虫肺炎等）时，就可定义为进入艾滋病期。如表中A3，B3，C1-3期。.52CD4+、CD8+T细胞检测绝对计数方法单平台法：应用流式细胞仪、绝对计数管及相应软件，可直接得出CD4+、CD8+T细胞值，操作简单，结果准确，目前广泛应用。多重平台法：包括白细胞计数、白细胞中的淋巴细胞百分比及淋巴细胞中的CD4+T/CD8+T细胞百分比等三项实验室检测技术，操作及计算较复杂，结果准确性不如单平台法。.53CD4检测样品要求n 抗凝血n 新鲜、不
20、溶血、无脂肪血n 按要求常温送检n 信息满足要求.54样品的采集1、合适抗凝管：有2ml、4ml、10ml不同容量管；2、抗凝剂：用于流式细胞仪免疫表型检测的抗凝剂（K2EDTA，K3EDTA）；3、采血管上注明样品编号等信息；4、按管的容量采集；5、采血后立即握住试管两端，垂直轻柔颠倒混匀数次，防止血液凝固；6、填写相应的送样单，信息满足要求，编号与采血管一致。.55样品的运输1、包装应符合国家病原微生物实验室生物安全管理条例防泄漏、防污染，运输样品至检测实验室；2、要求室温条件（1825）保存和运输样品，避免极端温度（结冰或大于37），高温季节，需用隔热容器盛装样品，并将其置于有冰袋和吸热
21、物质的容器中3、样品采集后6小时送达实验室检测效果最好。.56样品的接收1、专人接收样品，检查样品质量、数量并核对标识，送检单需记录样品详细资料；2、溶血、凝血、严重脂血、结冰、量不足、管裂有渗漏的样品视为不合格样品；3、超过检测允许时间的样品接收但不能用于CD4检测；.57样品检测要求、报告及结果录入建议实验室及时检测；一般要求24小时内染色，染色后6小时内分析；两天内出报告，报告及时反馈到治疗点；治疗点及时将检测结果录入国家治疗信息系统。.58.59.60CD4实验室网络 全区目前共有25个CD4检测实验室，分布14个市级CDC，3家医院和9个县级CDC，去年自治区卫生厅新招标采购多台流式
22、细胞仪，将陆续配备到疫情较为严重的县级CDC和抗病毒治疗点。.61CD4实验室网络1、自治区CDC 11、贵港市CDC2、百色市CDC 12、钦州市CDC3、崇左市CDC 13、防城港市CDC4、河池市CDC 14、北海市CDC5、桂林市CDC 15、贺州市人民医院6、南宁市CDC 16、广西龙潭医院7、柳州市CDC 17、南宁市四医院8、来宾市CDC 18、灵山县CDC9、梧州市CDC 19、鹿寨县10、玉林市CDC 20、平南县CDC.62病毒载量检测.631、辅助诊断n 某些非典型的抗体反应，特别是不确定反应时，RNA的测定可提供非常有用的证据。n 单纯使用RNA测定不能完全确定感染与否
23、，但当RNA测定出现较高拷贝数的阳性结果时（1000）提示感染发生的可能性非常大。.642、窗口期辅助诊断n 在窗口期抗原峰出现前后通常出现一个病毒载量的高峰，通常此高峰高于发病时的血浆病毒水平，早期病毒RNA测定具有特殊的意义。n 目前国际上正在尝试使用这种检测对采供血样品进行多个样品混合后的RNA检测以降低窗口期传播的残余危险度。.653、病程监控n 由于HIV感染发生后病毒载量的变化具有一定规律，并且这种变化与疾病的进程有着密切的相关性。n 通常在感染后无症状期内发生的临床症状很难与AIDS发病时的症状区别，病毒载量测定可以帮助医生判断一个刚发生的症状是否与HIV感染有关。.664、指导
24、治疗方案及疗效测定n 并非在任何情况下感染者都应该进行抗病毒治疗，这不但是经济上的原因，更重要的是在于抗病毒药物的副作用和疗效。通常在病毒载量达到一定水平后（如35000-50000拷贝/毫升）才具有良好的效果。n 只有通过治疗后病毒水平的检测才能确定治疗是否有效，通常治疗后病毒水平降低50%才被认为临床有效。1000 1000800 800600 600400 400200 2006 65 54 43 32 20 20 40 60 week 0 20 40 60 weekHAART HAARTSTI STIHIV-1 plasma RNA HIV-1 plasma RNACD4+T cell
25、 count CD4+T cell countHIV-1 plasma RNA HIV-1 plasma RNACD4+T cell count CD4+T cell count.675、预测疾病进程n HIV疾病进程与病毒载量的关系十分密切，观察感染者病毒RNA水平可大致预测其发病的可能。如右图所示，病毒载量与6年发病率的关系为：30000时则为80%。.68两种方法检测病毒载量（一）RT-PCR（二）NASBA EasyQ.69病毒载量检测样品要求n 血浆n 样品量约1毫升n 样品要求保存低温保存（-20以下）n 冷冻运输.70实验室网络n 自治区CDC确证中心实验室n 柳州市CDC确证实
26、验室n 梧州市CDC确证实验室n 贺州市CDC确证实验室n 龙潭医院确证实验室n 桂林市CDC确证实验室.713.12105.72低于最低检测限（400拷贝/毫升）.73高于最高检测限（7.5105拷贝/毫升）.74.75.76RT-PCR病毒载量结果的报告三种情况n 具体的一个数值（该值在400-7.5105拷贝/毫升）n 低于最低检测限（400拷贝/毫升）n 高于最高检测限（7.5105拷贝/毫升）.771.6105.78低于最低检测限（50拷贝/毫升）.79高于最高检测限（3.0106拷贝/毫升）.80NASBAEASYQ病毒载量结果报告的三种情况n 具体的一个数值（该值在50 3.0106拷贝/毫升）n 低于最低检测限（50拷贝/毫升）n 高于最高检测限（3.0106拷贝/毫升）.81