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1、1、基因工程至少需要哪三种工具？、基因工程至少需要哪三种工具？2、这三种工具分别起什么作用？、这三种工具分别起什么作用？温故知新：温故知新：1.2 1.2 基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序 基因工程的基本操作程序主要基因工程的基本操作程序主要包括哪几个步骤？包括哪几个步骤？1 1、目的基因的获取、目的基因的获取2 2、基因表达载体的构建、基因表达载体的构建3 3、将目的基因导入受体细胞、将目的基因导入受体细胞4 4、目的基因的检测与鉴定、目的基因的检测与鉴定问题问题1一：一：目的基因的获取目的基因的获取 如苏云金芽孢杆菌的抗虫基因，还有植物如苏云金芽孢杆菌的抗虫基因，还有植物的抗病
2、（抗病毒、抗细菌）基因、种子贮藏的抗病（抗病毒、抗细菌）基因、种子贮藏蛋白的基因，以及人的胰岛素基因、干扰素蛋白的基因，以及人的胰岛素基因、干扰素基因等。基因等。1.目的基因主要是指目的基因主要是指_编码蛋白质的基因编码蛋白质的基因什么是目的基因什么是目的基因2、也可以是具有调控作用的因子、也可以是具有调控作用的因子获取目的基因的常用方法有哪些获取目的基因的常用方法有哪些?1 1、从基因文库获取、从基因文库获取目的基因目的基因2 2、利用、利用PCRPCR技术扩增技术扩增目的基因目的基因3 3、人工合成、人工合成目的基因目的基因已知序列已知序列未知序列未知序列(一一)从基因文库中获取目的基因从
3、基因文库中获取目的基因 将含有某种生物将含有某种生物不同基因不同基因的许多的许多DNA片断，片断，导入导入到到受体菌的群体受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库有这种生物的不同基因，称为基因文库1.1.基因文库概念基因文库概念2.2.基因文库类型基因文库类型基因组文库基因组文库基因组文库基因组文库部分基因文库部分基因文库部分基因文库部分基因文库（包含一种生物的包含一种生物的包含一种生物的包含一种生物的所有所有所有所有基因基因基因基因）（包含一种生物的（包含一种生物的（包含一种生物的（包含一种生物的一部分一部分一部分一部分基因）基因）基因）
4、基因）基因组基因组文库与文库与部分基部分基因文库因文库的关系的关系怎样从基因文库中得到怎样从基因文库中得到我们所需的目的基因呢我们所需的目的基因呢?根据基因的核苷酸序列、基因的功根据基因的核苷酸序列、基因的功能、基因在染色体上的位置、基因的能、基因在染色体上的位置、基因的转录产物转录产物mRNAmRNA、基因的表达产物蛋、基因的表达产物蛋白质等特性来获取目的基因。白质等特性来获取目的基因。4.cDNA4.cDNA文库的构建文库的构建提取某种生物的某器官提取某种生物的某器官或或特定特定发育时期的发育时期的mRNAmRNA单链单链DNADNA双链双链cDNAcDNA片段片段重组载体重组载体与载体与
5、载体 连接连接cDNAcDNA文库文库反（逆）转录酶反（逆）转录酶DNA DNA 聚合酶聚合酶导入受体菌导入受体菌 中储存中储存反转录法：反转录法：以目的基因转录成以目的基因转录成的信使的信使RNARNA为模板，反转为模板，反转录成互补的单链录成互补的单链DNADNA，然，然后在酶的作用下合成双后在酶的作用下合成双链链DNADNA，从而获得所需的，从而获得所需的基因。基因。cDNAcDNA合成过程是：合成过程是：第一步，反转录酶以第一步，反转录酶以RNARNA为模板合成一条与为模板合成一条与RNARNA 互补的互补的DNADNA单链，形成单链，形成RNA-DNARNA-DNA杂交分子。杂交分子
6、。第二步，核酸酶第二步，核酸酶H H使使RNA-DNARNA-DNA杂交分子中的杂交分子中的RNARNA链链 降解，使之变成单链的降解，使之变成单链的DNADNA。第三步，以单链第三步，以单链DNADNA为模板，在为模板，在DNADNA聚合酶的作用聚合酶的作用 下合成另一条互补的下合成另一条互补的DNADNA链，形成双链链，形成双链DNADNA分子。分子。问题问题2 为什么用生物发育某个时期的为什么用生物发育某个时期的mRNA反转反转录得的录得的DNA只有这种生物的部分基因？只有这种生物的部分基因？某个时期的发育是某个时期的发育是基因选择性表达基因选择性表达的结果的结果两种基因文两种基因文库库
7、的主要区的主要区别别如下表（如下表（课课本本P10）文文库类库类型型cDNA文文库库基因基因组组文文库库文文库库大小大小小小大大基因中启基因中启动动子子无无有有基因中内含子基因中内含子无无有有基因多少基因多少部分基因部分基因全部基因全部基因物种物种间间的基因交流的基因交流可以可以部分基因可以部分基因可以总结总结1 1、概念：、概念：PCRPCR全称为全称为_，是一项在生，是一项在生 物物_复制复制_的核酸合成技术的核酸合成技术 3 3、条件：、条件：2 2、原理：、原理：_多聚酶链式反应多聚酶链式反应体外体外特定特定DNA片段片段DNA复制复制(二二)利用利用PCR技术技术扩增目的基因扩增目的
8、基因模板模板（目的基因）（目的基因）原料原料(脱氧核苷酸脱氧核苷酸)引物引物（一小段单链（一小段单链DNADNA）DNADNA聚合酶（耐高温）聚合酶（耐高温）温度控制温度控制4 4 4 4、操作前提：、操作前提：、操作前提：、操作前提：一段已知目的基因的核苷酸序列，一段已知目的基因的核苷酸序列，以便合成引物。以便合成引物。6 6、结果、结果 。5 5 5 5、扩增形式：、扩增形式：、扩增形式：、扩增形式：指数形式（指数形式（指数形式（指数形式（2 2 2 2n n n n）在短时间内大量扩增目的基因在短时间内大量扩增目的基因7 7、过程：、过程：a a、变性、变性（90-9590-95）：双链
9、）：双链DNADNA模板在热作模板在热作 用下，用下，_断裂，形成断裂，形成_b b、复性、复性（55-6055-60）：系统温度降低，引物与）：系统温度降低，引物与 DNA DNA模板结合，形成局部模板结合，形成局部_。c c、延伸、延伸（70-7570-75）：在）：在TaqTaq酶的作用下，从酶的作用下，从 引物开始进行碱基互补配对，合成与引物开始进行碱基互补配对，合成与 模板互补的模板互补的_。氢键氢键单链单链DNA双链双链DNA链链(二二)利用利用PCRPCR技术扩增目的基因动画演示技术扩增目的基因动画演示（三）通过（三）通过DNADNA合成仪直接合成目的基因合成仪直接合成目的基因D
10、NA合成仪合成仪推测推测推测推测合成合成前提前提：基因比较小、核苷酸序列已知基因比较小、核苷酸序列已知蛋白质蛋白质蛋白质蛋白质的氨基的氨基的氨基的氨基酸顺序酸顺序酸顺序酸顺序mRNAmRNA核苷酸核苷酸核苷酸核苷酸序列序列序列序列基因基因DNA的核苷酸的核苷酸序列序列目的目的目的目的基因基因基因基因问题问题43、如果不知道目的基因的核苷酸序列，可采、如果不知道目的基因的核苷酸序列，可采用用_获取目的基因的三种方法应用获取目的基因的三种方法应用1、如果知道目的基因两端的核苷酸序列，而、如果知道目的基因两端的核苷酸序列，而且基因比较大，可采用且基因比较大，可采用_ 2、如果知道目的基因的序列，而且
11、基因比较、如果知道目的基因的序列，而且基因比较小，可采用小，可采用_PCR技术扩增技术扩增化学方法人工合成化学方法人工合成从基因文库获取的方法从基因文库获取的方法二：基因表达载体的构建二：基因表达载体的构建基因工程的核心基因工程的核心1 1目的：目的：使目的基因在受体细胞中使目的基因在受体细胞中稳定存在稳定存在，并，并且可以且可以遗传给下一代遗传给下一代，同时使目的基因，同时使目的基因能够能够表达和发挥表达和发挥作用。作用。2 2组成：组成：目的基因目的基因+启动子启动子+终止子终止子+标记基因标记基因等等启动子：启动子：位于基因的位于基因的首端首端的的一段特殊的一段特殊的DNADNA片断，片
12、断，RNARNA聚聚合酶合酶识别和结合的部位识别和结合的部位终止子：终止子：位于基因的位于基因的尾端尾端的的一段特殊的一段特殊的DNADNA片断，能片断，能终终止止mRNAmRNA的转录的转录标记基因：标记基因：鉴别鉴别受体细胞中受体细胞中是否含有目的基因，从而将是否含有目的基因，从而将有目的基因的细胞有目的基因的细胞筛选筛选出来出来3.基因表达载体的构建过程质粒质粒DNADNA分子分子限制酶处理限制酶处理两个切口两个切口四个黏性末端四个黏性末端DNADNA连接酶连接酶重组重组DNADNA分子（重组质粒）分子（重组质粒）同一种同一种一个切口一个切口两个黏性末端两个黏性末端跟跟踪踪训训练练(20
13、12年年江江苏苏无无锡锡高高二二检检测测)如如图图为为基基因因表表达达载载体体的的模模式式图图，下下列列有有关关基基因因工工程程中中载载体的体的说说法法错误错误的是的是()A基因工程的核心步骤是基因表达基因工程的核心步骤是基因表达 载体构建载体构建B任何基因表达载体的构建都是一任何基因表达载体的构建都是一 样的，没有差别样的，没有差别C图中启动子位于基因的首端，是图中启动子位于基因的首端，是 RNA聚合酶识别和结合的部位聚合酶识别和结合的部位D抗生素抗性基因的作用是作为标抗生素抗性基因的作用是作为标 记基因，用于鉴别受体细胞中是记基因，用于鉴别受体细胞中是 否导入了目的基因否导入了目的基因B三
14、、将目的基因导入受体细胞三、将目的基因导入受体细胞1 1转化：转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。2 2常用的受体细胞：常用的受体细胞：大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。和动植物细胞等。3 3目的基因导入受体细胞的原理：目的基因导入受体细胞的原理：借鉴细菌或病毒借鉴细菌或病毒侵染侵染细胞的途径。细胞的途径。生物种生物种类类植物植物细细胞胞动动物物细细胞胞微生物微生物细细胞胞常用方法常用方法农农杆菌杆菌转转化法化法基因基因枪枪法法花粉通道法花粉通道法显显微注微注射法射法Ca2处处理法理法受体受体细细胞胞 一
15、般是体一般是体细细胞胞受精卵受精卵 一般原核一般原核细细胞胞4 4、目的基因导入受体细胞的方法、目的基因导入受体细胞的方法为什么动物细胞要用受精卵做受体细胞？为什么动物细胞要用受精卵做受体细胞？全能性受限制全能性受限制（1 1）农杆菌转化法农杆菌转化法 农杆菌特点：易感染农杆菌特点：易感染双双子叶植物和子叶植物和裸子裸子植植 物，对大多数物，对大多数单单子叶植物没有感染能力。子叶植物没有感染能力。原理：原理：TiTi质粒上的质粒上的T-DNAT-DNA可以转移到受可以转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的体细胞，并整合到受体细胞染色体的DNADNA上。上。三、目的基因导入受体细胞三、目的基因
16、导入受体细胞构建基因表达载体构建基因表达载体转入转入农杆菌农杆菌植物细胞植物细胞导入导入稳定维持和表达稳定维持和表达过程：过程：（2 2）基因枪法基因枪法：目的基因导入单子叶植物细胞目的基因导入单子叶植物细胞 操作方法：利用压缩气体产生的动力操作方法：利用压缩气体产生的动力，将，将包裹在金属粒表面的表达载体包裹在金属粒表面的表达载体DNA打入受体打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法。钨粉粒子和金粉粒子，粒子的直径一般在钨粉粒子和金粉粒子，粒子的直径一般在0.64um。适用：适用：单子叶植物单子叶植物（3 3）花粉管通道法花粉管通道法：将目的基因导
17、入植物细胞将目的基因导入植物细胞操作方法：在植物花受粉后，花粉形成花操作方法：在植物花受粉后，花粉形成花粉管还末愈合前期，剪去柱头，然后，滴入粉管还末愈合前期，剪去柱头，然后，滴入DNA（含的基因）使目的基因借助花粉管通（含的基因）使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞道进入受体细胞 特点特点:十分简便经济。十分简便经济。例：转基因抗虫棉（我国）例：转基因抗虫棉（我国）（4 4）、将目的基因导入动物细胞）、将目的基因导入动物细胞方法：方法：显微注射法显微注射法目的基因表达载体目的基因表达载体提纯提纯 取卵取卵（受精卵）（受精卵）显微注射显微注射 受精卵受精卵 新性状动物新性状动物（5 5）、将目
18、的基因导入微生物细胞）、将目的基因导入微生物细胞微生物作受体细胞原因：微生物作受体细胞原因：繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少常用菌：大肠杆菌常用菌：大肠杆菌常用法：常用法：CaCa2+2+处理获得感受态细胞处理获得感受态细胞 （改变细胞壁的通透性）（改变细胞壁的通透性）过程：过程：CaCaCaCa2+2+2+2+处理处理处理处理大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌感受态感受态感受态感受态 细胞细胞细胞细胞感受态细胞感受态细胞感受态细胞感受态细胞 吸收吸收吸收吸收DNADNA表达载体表达载体表达载体表达载体与感受态与感受态与感受态与感受态细胞混合细胞混合细胞混合细
19、胞混合从从细细胞胞器器的的功功能能上上分分析析，若若通通过过基基因因工工程程生生产产人人的糖蛋白，可以用大的糖蛋白，可以用大肠肠杆菌杆菌吗吗？【提示】【提示】不可以，糖蛋白上的糖不可以，糖蛋白上的糖链链是在内是在内质质网网和高和高尔尔基体上加工完成的，而内基体上加工完成的，而内质质网和高网和高尔尔基体基体存在于真核存在于真核细细胞中，大胞中，大肠肠杆菌是原核生物，杆菌是原核生物，细细胞胞中不含有中不含有这这两种两种细细胞器。胞器。问题问题3导入过程完成后，全部受体细胞都能摄导入过程完成后，全部受体细胞都能摄 入重组入重组DNADNA分子吗？分子吗？真正能摄入重组真正能摄入重组真正能摄入重组真正
20、能摄入重组DNADNADNADNA分子的受体细胞很少，且有分子的受体细胞很少，且有分子的受体细胞很少，且有分子的受体细胞很少，且有的会摄入载体的会摄入载体的会摄入载体的会摄入载体-载体，目的基因载体，目的基因载体，目的基因载体，目的基因-目的基因类型目的基因类型目的基因类型目的基因类型目的基因进入受体细胞后，是否都能稳定目的基因进入受体细胞后，是否都能稳定维持和表达？维持和表达？不一定，需要检测不一定，需要检测不一定，需要检测不一定，需要检测问题问题4问题问题5练习练习采用基因工程的方法培育抗虫棉，下列导入目的基采用基因工程的方法培育抗虫棉，下列导入目的基因的做法正确的是因的做法正确的是()将
21、毒素蛋白注射到棉受精卵中将毒素蛋白注射到棉受精卵中将编码毒素蛋将编码毒素蛋白的白的DNA序列，注射到棉受精卵中序列，注射到棉受精卵中将编码毒素将编码毒素蛋白的蛋白的DNA序列，与质粒重组，导人细菌，用该序列，与质粒重组，导人细菌，用该细菌感染棉的体细胞，再进行组织培养细菌感染棉的体细胞，再进行组织培养将编码将编码毒素蛋白的毒素蛋白的DNA序列，与细菌质粒重组，注射到序列，与细菌质粒重组，注射到棉的子房并进入受精卵棉的子房并进入受精卵 A、B、C、D、C检查是否成功检查是否成功分子分子水平水平个体水平：个体水平：检测转基因生物染色体的检测转基因生物染色体的DNA DNA 上是否插入了目的基因上是
22、否插入了目的基因检测目的基因是否转录出了检测目的基因是否转录出了mRNAmRNA检测目的基因是否翻译成蛋白质检测目的基因是否翻译成蛋白质抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等方法方法方法方法方法方法DNADNA分子杂交分子杂交分子杂交分子杂交抗原抗体杂交抗原抗体杂交 四、目的基因的检测与鉴定四、目的基因的检测与鉴定转基因生转基因生物的物的DNA探针探针15N N15N N14N N14N N（1 1）检测转基因生物染色体的）检测转基因生物染色体的DNADNA上是否插入了上是否插入了目的基因目的基因基因探针：基因探针：放射性同位素等标记的含有目的基放射性同位素等标记的含有目
23、的基因因DNA片段片段方法方法 DNA分子杂交技术分子杂交技术变性变性变性变性变性变性变性变性变性变性变性变性方法方法 分子杂交技术分子杂交技术（2）检测目的基因是否转录出了）检测目的基因是否转录出了mRNA探针探针15N N15N N转基因生物转基因生物的的mRNA14N N14N N提提取取（3）检测目的基因是否翻译成蛋白质）检测目的基因是否翻译成蛋白质方法方法抗原抗原-抗体杂交抗体杂交苏云金杆菌苏云金杆菌Bt毒素蛋白毒素蛋白将将Bt毒蛋白注毒蛋白注射小鼠体内射小鼠体内从小鼠血管抽出从小鼠血管抽出血液分离出抗血液分离出抗Bt毒素的抗体毒素的抗体抗体抗体蛋白质蛋白质 出现出现杂交带杂交带脱脱分分化化组组织织培培养养（4）除上述分子检测外，有时还需进行）除上述分子检测外，有时还需进行 个体生物学水平的鉴定：如抗性特性个体生物学水平的鉴定：如抗性特性