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1、单克隆抗体与基因工程抗体第1 页，本讲稿共20 页多克隆抗体(Polyclonal antibody)一.概念 给动物接种抗原所获得的免疫血清或抗血清是多种抗体的混合物,它是由多种抗原决定簇刺激多株B 细胞增殖分化所产生的,称为多克隆抗体.第2 页，本讲稿共20 页 二.多克隆抗体的应用 nn 免疫学检测nn 被动免疫治疗和紧急预防三.存在问题n n 特异性差,用于免疫学检测容易出现交叉反应 第3 页，本讲稿共20 页单克隆抗体(Monoclonal antibody,McAb)一.概念:通过B 细胞杂交瘤技术,获得特异性针对某一种抗原决定簇的细胞克隆，产生均一性的抗体.二.B 细胞杂交瘤的类
2、型 小鼠-小鼠 大鼠-大鼠 小鼠-人 人-人 第4 页，本讲稿共20 页三.杂交瘤技术的原理 1.亲本细胞的选择 小鼠骨髓瘤细胞 次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核苷转移酶(HGPRT)缺陷型 免疫脾细胞 经抗原免疫的BALB/c 小鼠的脾脏第5 页，本讲稿共20 页 2.2.细胞融合细胞融合骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞 PEG PEG 杂交瘤细胞 脾细胞 脾细胞融合后细胞的类型融合后细胞的类型:未融合的脾细胞未融合的脾细胞 杂交瘤细胞 杂交瘤细胞 未融合的瘤细胞 未融合的瘤细胞 第6 页，本讲稿共20 页3 3 杂交瘤细胞的选择性培养 杂交瘤细胞的选择性培养 DNADNA合成的途径合成的途径：糖糖+氨基酸氨基酸
3、氨基喋呤氨基喋呤(Aminopterin,A)(Aminopterin,A)TK TK 核苷酸 核苷酸 DNADNA 胸腺嘧啶核苷 胸腺嘧啶核苷 TMPTMP(Thymidine,T)(Thymidine,T)核苷酸前体核苷酸前体 次黄嘌呤次黄嘌呤 HGPRTHGPRT IMP IMP(Hypoxanthine,H)(Hypoxanthine,H)第7 页，本讲稿共20 页融合后细胞在HAT 培养基中存活情况脾细胞（HGPRT+,TK+,不能长期生长）骨髓瘤细胞（HGPRT-,TK-，不能生长）杂交瘤细胞（HGPRT+,TK+，能够生长）第8 页，本讲稿共20 页4.杂交瘤细胞的筛选和克隆化
4、筛选：免疫荧光 ELISA 等 克隆化：有限稀释法 单个细胞显微操作法 软琼脂培养法第9 页，本讲稿共20 页5.单克隆抗体的生产 体内：BALB/c 小鼠体内诱发含有单抗的 腹水 体外：无血清培养基悬浮培养等6.单克隆抗体的纯化 硫酸铵沉淀法 离子交换层析 A 蛋白-Sepharose 亲和层析第10 页，本讲稿共20 页四.单克隆抗体的特性 高度均一性：纯度很高的均一性抗体 高度专一性：只对抗原分子上某一抗原决定 簇起反应 大量产生及稳定性：杂交瘤细胞能在体内外无限繁殖 之传代 第1 1 页，本讲稿共20 页五.单克隆抗体在医学上的应用（一）用作诊断试剂 1.检测淋巴细胞表面分子，区分不同
5、分化 阶段的淋巴细胞，鉴别淋巴细胞。2.鉴定病原体，准确诊断传染病。3.用于肿瘤的诊断和分型 4.激素类单抗用于测定体内激素含量，判 断内分泌的功能状态 第12 页，本讲稿共20 页（二）用作研究工具1.1.纯化抗原2.2.分析和探查抗原结构3.3.分析抗原决定簇分子的功能（三）用于疾病的治疗1.1.抗细胞表面分子单抗，用于移植排斥反应的防治2.2.抗细胞因子单抗用于自身免疫性疾病的治疗3.3.抗肿瘤单抗用于肿瘤的导向治疗第13 页，本讲稿共20 页单克隆抗体用于免疫治疗存在的问题1.1.单克隆抗体的特异性 由于肿瘤特异性抗原较少，缺乏对肿瘤有严格特异性的单抗，对正常组织有交叉反应2.2.异种
6、抗体反应 鼠源性单抗用于人体，导致异源性超敏反应第14 页，本讲稿共20 页基因工程抗体(Genetic engineering antibody)概念：根据研究者的意图，采用基因工程方法，在基因水平，对免疫球蛋白基因进行切割、拼接或修饰后导入受体细胞进行表达，产生新型抗体。主要包括 嵌合抗体、单链抗体、人源化抗体、双价抗体和双特异性抗体。第15 页，本讲稿共20 页一.嵌合抗体(chimeric antibody)从杂交瘤细胞分离出功能性可变区基因，与人Ig 恒定区基因连接，插入适当表达载体，转染宿主细胞，表达人-鼠嵌合抗体。特点：减少了鼠源性抗体的免疫原性，同时保留了亲本抗体特异性结合抗原
7、的能力。第16 页，本讲稿共20 页二.单链抗体(single chain antibody)用基因工程方法，将抗体重链和轻链可变区通过一个连接肽连接而成的重组蛋白。特点：能保持与抗原结合的性能，分子量小，穿透性强，体内循环半衰期短，免疫原性低。第17 页，本讲稿共20 页单链抗体的应用：1.1.用于肿瘤的导向治疗2.2.肿瘤的影像分布3.3.基因治疗 细胞内抗体：在细胞内表达特异性识别某一基因产物的抗体，可干扰该基因产物的生物活性。4。研究基因结构与功能的关系第18 页，本讲稿共20 页三.人源化抗体(humanized antibody)1.将小鼠的CDR 序列移植到人抗体可变区框架中，产生的抗体称为CDR 移植抗体。2.将小鼠Ig 基因敲除，转染人Ig 基因，在小鼠体内产生人Ab，再经杂交瘤技术，产生大量完全人源化抗体第19 页，本讲稿共20 页n n 四、双价抗体与双特异性抗体nn(bispecific antibody)nn 许多抗原抗体反应要求双价的抗原结合位点，使抗原分子上的两个表位交联或使两个抗原分子连接。nn 将识别肿瘤抗原的抗体和 识别细胞毒性免疫效应细胞表面分子的抗体连结在一起，可使效应细胞更容易与肿瘤细胞结合识别，取得杀伤肿瘤细胞的作用。第20 页，本讲稿共20 页