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1、微生物工程第十二章 发酵的中间控制第1 页，本讲稿共63 页概述 发酵过程工艺控制的目的、研究的方法和层次一 发酵过程的种类分批培养补料分批培养半连续培养连续培养第2 页，本讲稿共63 页1、分批发酵简单的过程，培养基中接入菌种以后，没有物料的加入和取出，除了空气的通入和排气。整个过程中菌的浓度、营养成分的浓度和产物浓度等参数都随时间变化。第3 页，本讲稿共63 页分批培养中微生物的生长迟滞期 对数生长期 稳 定 期 死亡期第4 页，本讲稿共63 页微生物生长分为：迟滞期、对数生长期、稳定期和死亡期在迟滞期，菌体没有分裂只有生长，因为当菌种接种入一个新的环境，细胞内的核酸、酶等稀释，这时细胞不
2、能分裂。当细胞内的与细胞分裂相关的物质浓度达到一定程度，细胞开始分裂，这时细胞生长很快，比生长速率几近常数。这个时期称为对数生长期第5 页，本讲稿共63 页随着细胞生长，培养液中的营养物减少，废物积累，导致细胞生长速率下降，进入减速期和稳定期。最后当细胞死亡速率大于生成速率，进入死亡期对于初级代谢产物，在对数生长期初期就开始合成并积累，而次级代谢产物则在对数生长期后期和稳定期大量合成。第6 页，本讲稿共63 页分批培养的优缺点优点 操作简单，周期短，染菌机会少，生产过程和产品质量容易掌握缺点 产率低，不适于测定动力学数据第7 页，本讲稿共63 页2、补料分批培养 在分批培养过程中补入新鲜的料液
3、，以克服营养不足而导致的发酵过早结束的缺点。在此过程中只有料液的加入没有料液的取出，所以发酵结束时发酵液体积比发酵开始时有所增加。在工厂的实际生产中采用这种方法很多。第8 页，本讲稿共63 页补料分批培养的优缺点优点 在这样一种系统中可以维持低的基质浓度，避免快速利用碳源的阻遏效应；可以通过补料控制达到最佳的生长和产物合成条件；还可以利用计算机控制合理的补料速率，稳定最佳生产工艺。缺点 由于没有物料取出，产物的积累最终导致比生产速率的下降。由于有物料的加入增加了染菌机会第9 页，本讲稿共63 页3、半连续培养在补料分批培养的基础上间歇放掉部分发酵液（带放）称为半连续培养。某些品种采取这种方式，
4、如四环素发酵优点 放掉部分发酵液，再补入部分料液，使代谢有害物得以稀释有利于产物合成，提高了总产量。缺点 代谢产生的前体物被稀释，提取的总体积增大第10 页，本讲稿共63 页4、连续培养发酵过程中一边补入新鲜料液一边放出等量的发酵液，使发酵罐内的体积维持恒定。达到稳态后，整个过程中菌的浓度，产物浓度，限制性基质浓度都是恒定的。第11 页，本讲稿共63 页连续培养的优缺点优点 控制稀释速率可以使发酵过程最优化。发酵周期长，得到高的产量。由于D，通过改变稀释速率可以比较容易的研究菌生长的动力学缺点 菌种不稳定的话，长期连续培养会引起菌种退化，降低产量。长时间补料染菌机会大大增加。第12 页，本讲稿
5、共63 页二 发酵过程工艺控制的目的有一个好的菌种以后要有一个配合菌种生长的最佳条件，使菌种的潜能发挥出来目标是得到最大的比生产速率和最大的生产率第13 页，本讲稿共63 页发挥菌种的最大生产潜力考虑之点 菌种本身的代谢特点 生长速率、呼吸强度、营养要求（酶系统）、代谢速率 菌代谢与环境的相关性 温度、pH、渗透压、离子强度、溶氧浓度、剪切力等第14 页，本讲稿共63 页微生物代谢是一个复杂的系统，它的代谢呈网络形式，比如糖代谢产生的中间物可能用作合成菌体的前体，可能用作合成产物的前体，也可能合成副产物，而这些前体有可能流向不同的反应方向，环境条件的差异会引发代谢朝不同的方向进行。第15 页，
6、本讲稿共63 页微生物的生长与产物合成有密切相关性，不仅表现在菌体量的大小影响产物量的多少，而且菌体生长正常与否，即前期的代谢直接影响中后期代谢的正常与否。特别是对于次级代谢产物的合成更具有复杂性因此对发酵过程的了解不能机械的，割裂的去认识，而要从细胞代谢水平和反应工程水平全面的认识第16 页，本讲稿共63 页发酵过程受到多因素又相互交叉的影响如菌本身的遗传特性、物质运输、能量平衡、工程因素、环境因素等等。因此发酵过程的控制具有不确定性和复杂性。为了全面的认识发酵过程，本章首先要告诉大家分析发酵过程的基本方面，在此基础上再举一些例子，说明如何综合分析发酵过程及进行优化放大。第17 页，本讲稿共
7、63 页三 发酵过程研究的方法和层次1、研究方法单因子实验：对实验中要考察的因子逐个进行试验，寻找每个因子的最佳条件。一般用摇瓶做实验优点 一次可以进行多种条件的实验，可以在较快时间内得到的结果。缺点 如果考察的条件多，实验时间会比较长各因子之间可能会产生交互作用，影响的结果准确性第18 页，本讲稿共63 页数理统计学方法：运用统计学方法设计实验和分析实验结果，得到最佳的实验条件。如正交设计、均匀设计、响应面设计。优点 同时进行多因子试验。用少量的实验，经过数理分析得到单因子实验同样的结果，甚至更准确，大大提高了实验效率。但对于生物学实验要求准确性高，因为实验的最佳条件是经过统计学方法算出来的
8、，如果实验中存在较大的误差就会得出错误的结果。第19 页，本讲稿共63 页2、研究的层次初级层次的研究：一般在摇瓶规模进行试验。主要考察目的菌株生长和代谢的一般条件，如培养基的组成、最适温度、最适pH 等要求。摇瓶研究的优点是工作量大，可以一次试验几十种甚至几百种条件，对于菌种培养条件的优化有较高的效率。第20 页，本讲稿共63 页代谢及工程参数层次研究：一般在小型反应器规模进行试验。在摇瓶试验的基础上，考察溶氧、搅拌等摇瓶上无法考察的参数，以及在反应器中微生物对各种营养成分的利用速率、生长速率、产物合成速率及其它一些发酵过程参数的变化，找出过程控制的最佳条件和方式。由于罐发酵中全程参数的是连
9、续的，所以得到的代谢情况比较可信。第21 页，本讲稿共63 页国家生物工程中心创制的全参数发酵罐除了装备有常规发酵罐的温度、溶氧、pH 电极，得到发酵全过程的这些参数外，还有罐体称重，补料计量装置和尾气采集分析系统，更重要的是，有一套独特的数据处理软件，软件的开发是长期科研成果的结晶，可以得到14 个发酵过程参数，并且可以输入和绘制人工测定的参数，对发酵过程的分析起到了重要的作用第22 页，本讲稿共63 页第23 页，本讲稿共63 页鸟苷发酵过程曲线第24 页，本讲稿共63 页生产规模放大：在大型发酵罐规模进行试验。将小型发酵罐的优化条件在大型反应器上得以实现,达到产业化的实现。一般来说微生物
10、在不同体积的反应器中的生长速率是不同的，原因可能是，罐的深度造成氧的溶解度、空气停留时间和分布不同，剪切力不同，灭菌时营养成分破坏程度不同所致。第25 页，本讲稿共63 页四、发酵过程的中间分析发酵过程的中间分析是生产控制的眼睛，它显示了发酵过程中微生物的主要代谢变化。因为微生物个体极微小，肉眼无法看见，要了解它的代谢状况，只能从分析一些参数来判断，所以说中间分析是生产控制的眼睛。这些代谢参数又称为状态参数，因为它们反映发酵过程中菌的生理代谢状况，如pH，溶氧，尾气氧，尾气二氧化碳，粘度，菌浓度等第26 页，本讲稿共63 页代谢参数按性质分可分三类：物理参数：温度、搅拌转速、空气压力、空气流量
11、、溶解氧、表观粘度、排气氧（二氧化碳）浓度等化学参数：基质浓度（包括糖、氮、磷）、pH、产物浓度、核酸量等生物参数：菌丝形态、菌浓度、菌体比生长速率、呼吸强度、基质消耗速率、关键酶活力等第27 页，本讲稿共63 页从检测手段分可分为：直接参数、间接参数直接参数：通过仪器或其它分析手段可以测得的参数，如温度、pH、残糖等间接参数：将直接参数经过计算得到的参数，如摄氧率、KLa 等第28 页，本讲稿共63 页直接参数又可分为在线检测参数和离线检测参数在线检测参数指不经取样直接从发酵罐上安装的仪表上得到的参数，如温度、pH、搅拌转速；离线检测参数指取出样后测定得到的参数，如残糖、NH2-N、菌体浓度
12、。第29 页，本讲稿共63 页（一）发酵过程主要分析的项目目前发酵过程主要分析项目如下1、pH pH 与微生物的生命活动密切相关 酶催化活性 pH 的变化又是微生物代谢状况的综合反映基质代谢、产物合成、细胞状态、营养状况、供氧状况第30 页，本讲稿共63 页2、排气氧、排气CO2和呼吸熵排气氧的浓度表征了进气的氧被微生物利用以后还剩余的氧，因此排气氧的大小反映了菌生长的活性，通过计算可以求得摄氧率（OUR）。排气二氧化碳反映了微生物代谢的情况，因为微生物摄入的氧并不是全部变成二氧化碳的，有的进入代谢中间物分子，进入细胞或产物，因此消耗的氧并不等于排出的二氧化碳，此外，含氧的有机物降解后会产生二
13、氧化碳，使排气二氧化碳大于消耗的氧。第31 页，本讲稿共63 页RQ值随微生物菌种的不同，培养基成分的不同，生长阶段的不同而不同。测定RQ值一方面可以了解微生物代谢的状况，另一方面也可以指导补料CER 表示单位体积发酵液单位时间内释放的二氧化碳的量呼吸熵呼吸熵反映了氧的利用状况第32 页，本讲稿共63 页 一般在发酵中后期为保证产生次级代谢产物，有意使菌体处于半饥饿状态，在营养限制的条件下，维持产生次级代谢产物的速率在较高水平。对于这种工艺，后期的补料控制是关键。过程中发现，在补糖开始时，不但CER、OUR 大幅度提高，连RQ也提高约10，表明通过补糖不但提供了更多的碳源，而且随着体系内葡萄糖
14、浓度提高，糖代谢相关酶活力也提高，产能增加。第33 页，本讲稿共63 页3、糖含量微生物生长和产物合成与糖代谢有密切关系。糖的消耗 反映产生菌的生长繁殖情况 反映产物合成的活力菌体生长旺盛糖耗一定快，残糖也就降低得快通过糖含量的测定，可以控制菌体生长速率，可控制补糖来调节pH，促进产物合成，不致于盲目补糖，造成发酵不正常。糖含量测定包括总糖和还原糖。总糖指发酵液中残留的各种糖的总量。如发酵中的淀粉、饴糖、单糖等各种糖。还原糖指含有自由醛基的单糖，通常指的是葡萄糖。第34 页，本讲稿共63 页4、氨基氮和氨氮氨基氮指有机氮中的氮（NH2-N），单位是 mg/100ml。如氨基酸中的氮，黄豆饼粉、
15、花生饼粉中都有有机氮。氨氮指无机氨中的氮（NH3-N）。氮利用快慢可分析出菌体生长情况，含氮产物合成情况。但是氮源太多会促使菌体大量生长。有些产物合成受到过量铵离子的抑制，因此必须控制适量的氮。通过氨基氮和氨氮的分析可控制发酵过程，适时采取补氨措施。发酵后期氨基氮回升，这时就要放罐，否则影响提取过程。第35 页，本讲稿共63 页5、磷含量微生物体内磷含量较高，培养基中以磷酸盐为主，发酵中用来计算磷含量的是磷酸根。磷是核酸的组成部分，是高能化合物ATP 的组成部分，磷还能促进糖代谢。因此磷在培养基中具有非常重要的作用，如果磷缺乏就要采取补磷措施。第36 页，本讲稿共63 页6、菌浓度和菌形态菌形
16、态和菌浓度直接反映菌生长的情况。菌形态 显微镜观察菌浓度的测定是衡量产生菌在整个培养过程中菌体量的变化，一般前期菌浓增长很快，中期菌浓基本恒定。补料会引起菌浓的波动，这也是衡量补料量适合与否的一个参数。第37 页，本讲稿共63 页第38 页，本讲稿共63 页第39 页，本讲稿共63 页菌浓测定方法测粘度压缩体积法（离心）静置沉降体积法光密度测定法 OD600660 适合于细菌、酵母第40 页，本讲稿共63 页7、产物浓度 在培养过程中，产生菌的合成能力和产物积累情况都要通过产物量的测定来了解，产物浓度直接反映了生产的状况,是发酵控制的重要参数。而且通过计算还可以得到生产速率和比生产速率，从而分
17、析发酵条件如补料、pH 对产物形成的影响。第41 页，本讲稿共63 页(二)产物量的测定1、产物量的特殊表示法（1）、抗生素效价的表示抗生素效价表示抗生素的有效成分的多少，效价大小用单位（U）来表示效价表示方法：重量折算法 重量单位 类似重量单位 特殊单位第42 页，本讲稿共63 页重量折算单位：以最低抑菌浓度为一个单位，如青霉素0.6微克1U重量单位：规定某些抗生素活性部分1g=1u 如链霉素、卡那霉素、红霉素等定义活性部分1g 1u第43 页，本讲稿共63 页类似重量单位：规定抗生素的某种盐1mg=1000u 如金霉素、四环素的盐酸盐定一为1g 1u特殊单位：药检所制定某些抗生素的单位制霉
18、菌素 1mg=3700u多粘菌素B 1mg=10000u第44 页，本讲稿共63 页2、酶活力的表示法酶活力用单位来表示。由于酶通常不是很纯，不能用重量来表示酶的量。同一种酶用不同的方法测定会有不同的酶活单位，容易造成混乱，为此国际上作了统一规定，规定在250C 下，以最适的底物浓度，最适的缓冲液离子强度，以及最适的pH 诸条件下，每分钟能转化一微克分子底物的酶定量为一个活性单位。第45 页，本讲稿共63 页2、产物量的测定（1）、化学法 滴定法产物能使一定指示剂变色来指示反应终点的可用滴定法如青霉素在碱性条件下加入过量的I2，反应生成青霉噻唑酸碘，用Na2S2O3滴定多余的碘，可计算出青霉素
19、的单位柠檬酸可以用NaOH 滴定来计算柠檬酸产量第46 页，本讲稿共63 页 比色法产物经一定化学反应产生颜色，且颜色深浅与产物浓度成正比，可以用比色法测定。淀粉酶活力测定：在1%可溶性淀粉溶液中加入淀粉酶，所释放出的麦芽糖与生色试剂（3，5-二硝基水杨酸与酒石酸钾钠的碱溶液）产生颜色，它在540nm 处所得吸光度跟淀粉酶活力成正比。第47 页，本讲稿共63 页 测压法 产物特定反应放出或摄入气体，使系统有压力变化，可以通过测定压力变化得知产物量。（2）、物理法 许多酶、抗生素都有不对称碳原子，具有旋光性，因此可以通过测定旋光度来测定酶或抗生素的含量。谷氨酸 氨基丁酸CO2第48 页，本讲稿共
20、63 页化学和物理方法优点：快速、方便，经常用于过程分析缺点产品中存在的杂质会干扰测定结果，因此抗生素成品的测定用生物法测定。适用于抗生素效价的测定 生物法以抗生素的杀菌能力为衡量效价的标准，其原理恰好与临床应用的要求相一致，而且此法灵敏度高，需用的检品量较小，这是其它方法不能比的。但此法得到结果比较慢，需经过1618 小时培养。生物法常用于发酵终了产品效价的测定。（3）、生物法第49 页，本讲稿共63 页常用的生物法测定抗生素，采用杯碟法“杯”是放被测抗生素的不锈钢小管，小管内径为6mm，高10mm的圆筒形管子，管子的重量尽可能相等。碟是摊布培养基的玻璃培养皿。操作方法是：将已灭菌的琼脂培养
21、基加热到完全融化，倒在培养皿内，每碟15ml（下层），待其凝固。此外，将融化的培养基冷却到500C 左右混入试验菌，将混有菌的培养基5 ml 加到已凝固的培养基上待凝固（上层）。第50 页，本讲稿共63 页在培养基表面垂直放上小杯，在杯中加入待检样品，加满后在370C 培养1618 小时。在培养中,一方面试验菌开始生长另一方面抗生素呈球面扩散，离杯越近，抗生素浓度越大，离杯越远抗生素浓度越小。随着抗生素浓度减小，有一条最低抑菌浓度带，在带范围内，菌不能生长，而呈透明的圆圈，这就叫“抑菌圈”。抗生素浓度越高，抑菌圈越大，第51 页，本讲稿共63 页r:抑菌圈的半径(毫米）M：抗生素在管中的量（单
22、位）C：最低抑菌浓度（单位/毫升）H：培养基的厚度（毫米）L：管子的高度（毫米）D：抗生素的扩散系数（毫米/小时）T：细菌生长到肉眼所用的时间（小时）第52 页，本讲稿共63 页抗生素浓度与抑菌圈的半径成一定数学关系logM=(1/9.21DT)r2+log(C.4DTH)抗生素的总量的对数值与抑菌圈半径的平方呈正比。此外还受C、H、D、T 的影响但是C、H、D、T 是无法测量的，在实际计算中要设法消去第53 页，本讲稿共63 页一般的消去方法有l 二剂量法l 标准曲线法第54 页，本讲稿共63 页两剂量法：标准品低单位总量:m抑菌圈半径SL标准品高单位总量:M抑菌圈半径：SH样品高单位总量:
23、M 抑菌圈半径UH样品低单位总量:m 抑菌圈半径：UL已知：令：得出：第55 页，本讲稿共63 页logMlogM _logM/M=同理logmlogm=logm/m=log=log2log=第56 页，本讲稿共63 页logMlogm=logM/m=logKlogMlogm=logM/m=logK2logK=第57 页，本讲稿共63 页标准曲线法优点：在一个碟子上可以同时做两个样品的效价，当要做的样品量大时，采取标准曲线法可以提高效率。假设选用的浓度为：3U，4U，5U，6U,7U中心点是5U1122第58 页，本讲稿共63 页每个浓度做三个碟子。5U 为中心点，每个碟子中有3 个杯中加中心
24、点浓度，其余3 个加其它浓度。测得抑菌圈后，将浓度和抑菌圈平均直径做标准曲线。第59 页，本讲稿共63 页logMr第60 页，本讲稿共63 页管碟法影响因素的讨论：斜率小 D、T 大,误差小截距小 C、D、T、H 小，误差小第61 页，本讲稿共63 页logMrlogM1r1r1 r1第62 页，本讲稿共63 页l 培养基厚度H 越小，其它条件相同时r 越大。影响H 的因素：培养基的厚度l 细菌生长到肉眼所需的时间T 越大在其它条件相同时，r 越大影响T 的因素：菌体本身，及影响菌体生长的条件如：接种量，培养温度、及营养环境其它影响因素：上层铺得平整、菌液加入时的温度、钢圈的放置、滴液第63 页，本讲稿共63 页